益母草核糖体失活蛋白基因的制作方法

xiaoxiao2020-07-09  29

专利名称:益母草核糖体失活蛋白基因的制作方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种来自于中药植物益母草的具有核糖体失活活性的抗真菌蛋白基因。
背景技术
中药是我国医药中独具特色的重要组成部分。随着医药市场的持续增长,植物药市场的规模在快速增长,加之当今疾病谱和医疗模式的根本性变化,以及对化学药物毒副作用认识的加深,人们保健意识增强,中医药已被越来越多的国家所认同,各国竞相应用现代科技手段从传统药材中寻找新药或药物先导化合物。世界各国对植物药的研究开发,必将形成全球的一个新的经济增长点(肖培根,2000)。然而,目前对于中药的研究还主要停留在复方或复合成分上,对于药用植物的有效成分研究不多,仅有青蒿素等少数单一有效成分得到深入研究和开发。
真菌病害是作物减产和品质下降的主要原因之一。基因工程为植物抗真菌育种提供了新途径。植物界大量存在具有离体抑制真菌生长增殖能力的蛋白质,相应基因在转基因植株中表达,可使这些植株具有抗真菌能力。核糖体失活蛋白(Ribosome-inativatingproteins,RIPs)就是其中之一。核糖体灭活蛋白,即rRNA N-糖苷酶(rRNA N-glycosidases,EC3.2.2.22)是一类蛋白毒素,广泛存在与植物王国,有人推测它甚至可能存在于所有的植物中,只是含量相去甚远,并在真菌和细菌中也有发现。它作用于真核细胞的核糖体,通过水解核糖体RNA上特异位点结合的碱基,抑制靶细胞的蛋自质合成,从而使核糖体失活。RIP不灭活自身的核糖体,却能特异作用于亲缘关系较远的种类。人们普遍认为,植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用——抵抗病虫害或者恶劣的环境。在应用上,这类具有选择毒性的蛋白质的应用研究包括增强植物抗病性,同时,利用核糖体失活蛋白构造的免疫毒素在治疗癌症方面有广阔的前景。
将药用植物的有效成分研究与植物抗真菌基因工程育种相结合,将大大拓展中药材植物这一宝贵资源的发掘与利用。但类似研究尚未见报道。
益母草是我国的一种传统药用植物,属于唇形科(Labiatae)益母草属(Leonurus),以全草(包括种子)入药,具有抗菌抗肿瘤作用及活血调经、利尿消肿之功效。植物在生长发育过程中,面临着各种病原微生物的侵染,但研究发现益母草却很少感病,特别是在种子阶段,多数种子在贮藏和萌发过程中基本不会感染病原菌。虽然国内外对核糖体失活蛋白的研究较多,但是,到目前为止,尚无对益母草核糖体失活蛋白基因的研究报道。

发明内容
本发明将药用植物的有效成分研究与植物抗真菌基因工程育种相结合,其目的在于提供一种来自于中药植物益母草的具有核糖体失活活性的抗真菌蛋白基因。该蛋白对丝状真菌有明显的抑制作用,能使酵母、真菌等微生物核糖体失去翻译蛋白质的功能,在医药、植物抗病育种等方面有广阔的应用价值。
本发明申请人通过对益母草种子抗真菌蛋白的提取与纯化,得到一种具有核糖体失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin,进而进行了Leonurin的基因克隆。具体方法如下(1)蛋白质纯化将益母草种子粉碎后,用10mM磷酸缓冲液(pH=6.0,内含1mMEDTA,1mM Leupeptin 10mM硫脲)提取,提取液经75%硫酸铵沉淀,85℃变性10min处理,离心(12000rpm,15min)后的上清液经过SP Sepharose HP阳离子交换层析,收集有抗真菌活性的部分,再经C8反相HPLC和C18反相HPLC层析,得到单一的具有核糖体失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin;(2)Leonurin的N-端测序纯化的Leonurin经电泳转移到PVDF膜后,由湖南省生物研究所蛋白质化学研究室进行N-端测序,所测N端序列为pqsqtveecceslkdi;(3)Leonurin基因3’末端的扩增根据Leonurin的N-端氨基酸序列测定结果,设计一条简并引物5’-ccgcagtcgcagac(atcg)gt(atcg)ga(ag)-3’,采用TaKaRa公司的3’-RACE试剂盒扩增Leonurin的3’端序列,扩增片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)载体上,序列测定(上海Sangon)表明,扩增的片段为编码Leonurin的部分cDNA基因,包含了成熟蛋白的所有编码序列;(4)Leonurin全长cDNA基因的获得根据3’-RACE扩增的编码序列设计引物,利用YADE扩增Leonurin成熟蛋白编码序列的5’端序列,扩增片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)载体上,然后进行序列测定(上海Sangon)与拼接,从而获得Leonurin的全长cDNA基因。
(5)序列同源性分析相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成,BLAST分析表明,Leonurin与napin类蛋白有一定的序列相似性,而napin类蛋白多为储藏蛋白,但Leonurin具有抗真菌活性和核糖体失活蛋白活性,因此,Leonurin是一个新的具有核糖体失活蛋白活性的抗真菌蛋白,Leonurin基因是一个新基因。
上述方法获得的Leonurin全长cDNA基因及其推断的氨基酸序列如下ctctccttgtggcgctggtggctgtaggcggagccaccaccttcaccaccaccgtcaccaccacttcattcgacgtcgacgacacccagcgatcccaatgcagtcaa ATG CTG CAG GGT CGC CAG TTC CGC TCC TGC CAA AGC TACM L Q G R Q F R S C Q S YCTT AGG CAG CGT GGG AAT GTT CTA GAA ATG GCC ACC GGA AAC CCT CAG TCG CAG ACG GTTL R Q R G N V L E M A T G N P Q S Q T VGAA GAA TGC TGC GAG AGT CTG AAG GAT ATT GAG CGG AAA CAG CAG CAA TGC GGG TGT GAAE E C C E S L K D I E R K Q Q Q C G C EGCC ATC AAG CAC GCG ATG AGG CAG ATG CAG GGG GGG CAG AGC GAG GAG GTG TAT CGA AAGA I K H A M R Q M Q G G Q S E E V Y R KGCT AGG ATG CTG CCA CGT ACT TGC GGA TTA AGG TCA CAG CAA TGC CAG TTT AAT GTT ATCA R M L P R T C G L R S Q Q C Q F N V I
TTT GTG TAG atgattaaggcctatcggccttaatttgtaataaagctgaggaaataaacgagctagtgatcacttcF VAtgatcactatgttttttgtgcgtggttccaaataaaaaaaaaaaaaaaaggatccggtacctctagatcag本发明的优点是(1)由于Leonurin基因来源于常用中药—益母草,而该种植物以全株(包括种子)入药,因此所获得的具有核糖体失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin对人畜及植物安全无害;(2)抑菌实验及分析试验表明,Leonurin不仅具有核糖体失活蛋白活性,还具有抗真菌作用Leonurin抑制酵母核糖体和鼠肝核糖体翻译蛋白质活性的IC50分别为20ng和35ng;15mg/ml的Leonurin对假丝酵母、黑曲霉、茄类镰孢菌、棉花枯萎病菌等真菌具有抑制作用。因此,该基因通过转基因的手段,使之在植物中高丰度表达,不仅仅可用于植物抗病的基因工程育种,而且其表达产物经纯化后具有抗菌抗肿瘤、治疗癌症等药用价值。
具体实施例方式实施例将益母草种子粉碎后,用10mM磷酸缓冲液(pH=6.0,内含1mMEDTA,1mM Leupeptin10mM硫脲)提取,提取液经75%硫酸铵沉淀,85℃变性10min处理,离心(12000rpm,15min)后的上清液经过SP Sepharose HP阳离子交换层析,收集有抗真菌活性的部分,再经C8反相HPLC和C18反相HPLC层析,得到单一的具有核糖体失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin;纯化后的Leonurin经电泳转移到PVDF膜,由湖南省生物研究所蛋白质化学研究室进行N-端测序,所测N端序列为pqsqtveecceslkdi;根据Leonurin的N-端氨基酸序列测定结果,设计一条简并引物5’-ccgcagtcgcagac(atcg)gt(atcg)ga(ag)-3’,采用TaKaRa公司的3’-RACE试剂盒扩增Leonurin的3’端序列,克隆到pUCm-T(上海Sangon)载体上,序列测定(上海Sangon)表明,扩增的片段为编码Leonurin的部分cDNA基因,包含了成熟蛋白的所有编码序列;根据3’-RACE扩增的编码序列设计引物,利用YADE扩增Leonurin成熟蛋白编码序列的5’端序列,扩增片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)载体上,然后进行序列测定(上海Sangon)与拼接,从而获得Leonurin的全长cDNA基因;在NCBI站点上用BLAST完成序列同源性分析,表明Leonurin基因是一个新基因。
权利要求
1.一种益母草核糖体失活蛋白基因,其特征在于具有如下的基因序列ctctccttgt ggcgctggtg gctgtaggcg gagccaccac cttcaccacc accgtcacca60ccacttcatt cgacgtcgac gacacccagc gatcccaatg cagtcaaatg ctgcagggtc120gccagttccg ctcctgccaa agctacctta ggcagcgtgg gaatgttcta gaaatggcca180ccggaaaccc tcagtcgcag acggttgaag aatgctgcga gagtctgaag gatattgagc240ggaaacagca gcaatgcggg tgtgaagcca tcaagcacgc gatgaggcag atgcaggggg300ggcagagcga ggaggtgtat cgaaaggcta ggatgctgcc acgtacttgc ggattaaggt360cacagcaatg ccagtttaat gttatctttg tgtagatgat taaggcctat cggccttaat420ttgtaataaa gctgaggaaa taaacgagct agtgatcact tcatgatcac tatgtttttt480gtgcgtggtt ccaaataaaa aaaaaaaaaa aaggatccgg tacctctaga tcag 534
2.一种益母草核糖体失活蛋白基因编码的蛋白质,其特征在于该蛋白质具有如下的氨基酸序列Met Leu Gln Gly Arg Gln Phe Arg Ser Cys Gln Ser Tyr Leu Arg1 5 10 15Gln Arg Gly Asn Val Leu Glu Met Ala Thr Gly Asn Pro Gln Ser20 25 30Gln Thr Val Glu Glu Cys Cys Glu Ser Leu Lys Asp Ile Glu Arg35 40 45Lys Gln Gln Gln Cys Gly Cys Glu Ala Ile Lys His Ala Met Arg50 55 60Gln Met Gln Gly Gly Gln Ser Glu Glu Val Tyr Arg Lys Ala Arg65 70 75Met Leu Pro Arg Thr Cys Gly Leu Arg Ser Gln Gln Cys Gln Phe80 85 90Asn Val Ile Phe Val9全文摘要
一种益母草核糖体失活蛋白基因,通过对益母草种子抗真菌蛋白的提取与纯化,得到具有核糖体失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin,并经一系列生物技术克隆得到。本发明将药用植物的有效成分研究与植物抗真菌基因工程育种相结合,抑菌实验及分析试验表明,Leonurin不仅具有核糖体失活蛋白活性,还具有抗真菌作用。因此,该基因通过转基因的手段,使之在植物中高丰度表达,不仅仅可用于植物抗病的基因工程育种,而且其表达产物经纯化后具有抗菌抗肿瘤、治疗癌症等药用价值。
文档编号C07K14/415GK1563381SQ20041003077
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月9日 优先权日2004年4月9日
发明者杨星勇, 肖月华, 裴炎 申请人:西南农业大学

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