包含微生物油脂的组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于化妆品领域，具体涉及包含微生物油脂的组合物及其在肌肤屏障功能方面的应用。


背景技术：

2.皮肤是人体面积最大的器官，覆盖于整个体表，起到了重要的屏障作用。从广义上来看，皮肤的屏障功能不仅仅指其物理性屏障作用，还应包括皮肤的色素屏障作用、神经屏障作用、免疫屏障作用以及其他与皮肤功能相关的诸多方面；狭义的皮肤屏障功能通常指表皮尤其是角质层的物理性或机械性屏障结构。拥有健康的皮肤屏障就等于拥有了美丽自然的皮肤。然而，由于环境、饮食和错误的皮肤护理等原因，皮肤屏障受损，使得皮肤自身防御能力不足，皮肤极易敏感受损。油脂则可以在皮肤表面形成一道油膜屏障，使外界不良因素无法对皮肤造成刺激，起到保护皮肤，抑制皮肤水分蒸发和保湿的作用。
3.微生物油脂是继植物油脂、动物油脂之后人类开发出的又一种食用油脂新资源。能够生产油脂的微生物有酵母、霉菌、细菌和藻类等，其中真核的酵母、霉菌和藻类能合成与植物油组成相似的甘油三酯，而原核的细菌则合成特殊的脂类。海洋单细胞藻类即微藻，是地球上出现最早的生物物种，由于种类不同，它们的尺寸从几微米到几百微米不等。微藻作为低等植物可以生长在海洋、河流以及湖泊里，不占用耕地、适应环境能力强、生长周期短、产量高，还可以充分利用太阳能，将水、二氧化碳等无机物质合成有机物质。当然微藻制油还有其他优点，例如能生产出高附加值的副产品(生物高聚物、蛋白质、动物饲料、氢气等)，高效环保，是典型的“绿色能源”。
4.微藻中的油脂可以分为两个类别，分别是：贮存脂和结构脂。贮存脂中的三酰甘油酯，主要由可转化成生物柴油大部分的饱和脂肪酸和一部分的不饱和脂肪酸组成。结构脂主要由多不饱和脂肪酸组成，长链的多不饱和脂肪酸在生物体尤其是哺乳动物体内起着重要的调节作用。
5.大多数微藻中含有丰富的长链多不饱和脂肪酸，自然界中常见的不饱和脂肪酸主要分为3大类：ω-3系列，如二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)；ω-6亚油酸系列和ω-9油酸系列。多不饱和脂肪酸可调节血脂、增强机体免疫、补脑健脑和改善关节炎症状缓解疼痛等。例如，文献曹万新，dha的生理功能及应用研究进展，中国油脂[j]，2011，36(3)：1-4指出，ω-3系多不饱和脂肪酸dha具有健脑明目、预防心血管疾病、抗炎和抑制过敏反应等功效。例如，文献刘艺琳，微藻油的提取与功能研究进展[j]，2019，5(40):333-337中指出，微藻油中的角鲨烯在体内具有抗炎症、抗肿瘤、调节血脂和血糖等多种功能，同时角鲨烯通过调节糖脂代谢对心血管等代谢性疾病进程具有一定调节作用。所以微藻油在我们的日常生活中起到了非常重要的作用，被认为是最具发展潜力的油脂资源，在国际上受到了极大的关注。
[0006]
皮肤屏障，一般指皮肤物理屏障，包括皮肤表皮角质层和位于角质层表面的皮脂膜。角质层位于表皮的最外层，具有“砖-墙结构”，其中“砖块”指角质细胞，“砂浆”指细胞间
脂。在皮肤屏障形成过程中，有200多个基因与皮肤屏障高度相关。例如，与角质包膜形成有关屏障因子丝聚蛋白(flg)、兜甲蛋白(lor)、内皮蛋白(ivl)、转谷氨酰氨酶1(tgm1)，与屏障保湿相关因子胱天蛋白酶14(casp14)、hmgcoa还原酶(hmgcr)、水通道蛋白3(aqp3)和角质细胞胞间连接相关因子闭锁小带蛋白1(zo-1)。
[0007]
具体来说，丝聚合蛋白(flg)是皮肤表皮外层的角化包膜的一个重要的组成蛋白，主要存在于表皮颗粒层和透明层，是皮肤屏障的重要组成结构；并可进一步降解成具有亲水性的自由氨基酸和吸水性衍生物，帮助皮肤储存水分，维持皮肤含水量，具有保湿功效。兜甲蛋白(lor)是角质包膜的主要组成成分，对表皮的屏障功能起重要作用。内皮蛋白(ivl)主要表达于棘细胞层上部与颗粒层，是角质形成细胞分化的标志性蛋白，位于角化包膜的外层，与含有羟基-oh的神经酰胺共价结合，由此将脂质基质和角化细胞连接起来而发挥作用。角化包膜的特性抗性和不溶性是基于由转谷氨酰胺酶1(tgm1)催化的非常稳定的异肽键的形成。
[0008]
hmgcoa还原酶(hmgcr)是合成胆固醇的限速酶，存在于内质网，催化合成甲基二羟戊酸，之后经过脱羧、磷酸化等多步反应生成鲨烯，最后鲨烯环化为羊毛固醇后转变为胆固醇。水通道蛋白3(aqp3)是aqps家族表达最丰富的水通道蛋白亚型，其在表皮的表达量具有空间层次，主要表达于人表皮基底层，棘细胞层、颗粒层，到角质层逐渐消失。这种空间性分布与皮肤的含水量分布一致：基底层和基底上部的水含量约为75％，而角质层仅约10％-15％。aqp3在基底膜带的高表达，可以促使水、甘油及尿素的转运，使得基底层的细胞外环境更接近于中性的平衡状态；而越接近角质层，aqp3的表达也越少，水分含量下降明显，皮肤内环境逐渐呈现酸性。此外，aqp3担负着角质层甘油运输的重要作用，aqp3将内源性的甘油运输进入表皮，使其直接或间接影响皮肤保湿功效。
[0009]
紧密连接是物理屏障中的重要组成部分，大多出现在皮肤表皮层，位于相邻细胞间隙的顶端侧面。紧密连接由不同类型的跨膜蛋白及细胞内胞质蛋白组成。跨膜蛋白如水闸蛋白1(cldn1)、闭锁蛋白(ocln)等；胞质蛋白如主要有闭锁小带蛋白-1(zo-1)等。zo-1是一种胞质蛋白，属于膜连接鸟苷酸激酶蛋白质家族，通过胞外信号传导途径来聚集闭锁蛋白和水闸蛋白，从而形成基本细胞连接条带；zo-1是皮肤屏障功能中最具特征性的一种胞质蛋白。
[0010]
植物仿生脂质技术(phyto bionic sebum，简称pbs技术)：精选多种天然植物油，通过科学配比，模拟皮肤屏障结构中的天然脂质成分，补充皮肤角质层必需的不饱和脂肪酸，如亚麻酸、亚油酸等，补充皮肤缺失的脂质成分，与皮脂相容，从而快速修护皮肤屏障，令肌肤重焕健康、滋润、有光泽的状态。
[0011]
其中：植物油脂主要来源于包括但不限于植物果实(例如：牛油果树果脂、油橄榄果油、杏仁油、鳄梨果油、沙棘果油、椰子果油、香橙果油、香柠檬果油、香橼果油、番茄果油、狗牙蔷薇果油、胡椒果油、巴西油桃木果油、扁叶香果兰果油、茴芹果油、毛瑞榈果油、欧刺柏果油、山鸡椒果油、温州蜜柑果油、星果棕果油、野蔷薇果油和芫荽果油等)、种子(例如：霍霍巴籽油、红花籽油、白池花籽油、向日葵籽油、澳洲坚果籽油、蓖麻籽油、牡丹籽油、葡萄籽油、葡萄柚籽油、苹果籽油、石榴籽油、西瓜籽油、西葫芦籽油、亚麻籽油、油菜籽油、芝麻籽油、玻璃苣籽油、伯尔硬胡桃籽油、草棉籽油、茶籽油、川谷籽油、番木瓜籽油、覆盆子籽油、猴面包树籽油、金盏花籽油、苦油树籽油、辣木籽油、美国山核桃籽油、紫苏籽油、巴巴苏
籽油和白羽扇豆籽油等)和胚芽(例如：稻胚芽油、小麦胚芽油、燕麦胚芽油和玉米胚芽油等)，也有部分来源于植物的叶、皮、根、花瓣和花蕊等其他部位。
[0012]
本发明意外地发现，包含微生物油脂的组合物具有皮肤屏障相关功效，可以提升皮肤屏障活力和促进皮肤屏障相关因子flg、lor、ivl、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1的表达。因此，这种包含微生物油脂的组合物可以作为功效添加剂应用于药品和皮肤外用剂中。


技术实现要素：

[0013]
一方面，本发明提供了一种包含微生物油脂的组合物，其中，以所述组合物的总重量计，所述组合物包含至少1重量％的微生物油脂。在优选的实施方式中，本发明组合物中的微生物油脂是微藻油、雨生红球藻油、长耳齿状藻油。
[0014]
在优选的实施方式，本发明组合物还包含天然表面活性剂，所述天然表面活性剂选自：卵磷脂、胆甾醇、羊毛脂、茶皂素、蛋白质、皂苷类、糖类、烷基多苷或它们的组合。在优选的实施方式中，所述天然表面活性剂是氢化卵磷脂。
[0015]
在优选的实施方式中，本发明组合物中微生物油脂与天然表面活性剂的重量比为1:1至20:1。在更优选的实施方式中，本发明组合物中微生物油脂与天然表面活性剂的重量比为10:1至20:1。
[0016]
另一方面，本发明还涉及包含微生物油脂的组合物在增强皮肤屏障功能中的应用。在优选的实施方式中，增强皮肤屏障功能通过促进皮肤屏障相关因子的表达实现。
[0017]
又一方面，本发明还涉及包含微生物油脂的组合物在制备用于增强皮肤屏障功能的药品和/或皮肤外用剂中的应用。在优选的实施方式中，所述药品和/或皮肤外用剂包含0.001-100重量％的所述组合物。
具体实施方式
[0018]
本发明涉及包含微生物油脂的组合物及其应用，在研究中发现了所述组合物具有提升皮肤屏障活力和促进皮肤屏障相关因子flg、lor、ivl、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1的表达的作用。因此，包含微生物油脂的组合物可以作为功效添加剂，用于制备药品和/或皮肤外用剂，用于增强皮肤屏障功能。
[0019]
为了提供更简明的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解，无论是否明确地使用了术语“约”，本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值，并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。
[0020]
为了提供更简洁的描述，本文中一些数量表述被叙述为约x量至约y量的范围。应当理解，当叙述范围时，该范围并不限制于所叙述的上下界限，而应包括约x量至约y量的整个范围或它们之间的任何量。
[0021]
微生物油酯
[0022]
本发明的组合物包含微藻油、雨生红球藻(haematococcus pluvialis)油、长耳齿状藻(odontella aurita)油等。微藻油是保健品、医药和化妆品的添加剂，也可以作为食用油的可再生能源。食品方面，微藻油可以作为功能性营养强化剂或直接做成保健产品，微藻
油中不仅含有dha、epa等不饱和脂肪酸，而且还含有对人体健康有益的烃类和微量的醇类成分。医药方面，微藻油中的功能性多不饱和脂肪酸可以作为药物使用，目前微藻油中的亚油酸和花生四烯酸在医学领域应用相当广泛，对治疗高血压、缓解支气管哮喘、鼻充血以及消化系统溃疡等疾病疗效十分显著。在养殖业中，微藻油可以加入饲料中，从而得到我们想要的功能性农副产品。
[0023]
本发明中的微藻油为三油酸甘油酯，富含超过90％的有益人体的ω-9不饱和脂肪酸，即油酸。油酸是一种饮食中常见的单元不饱和脂肪酸，不是必须脂肪酸，但它仍对一般健康状况有益。ω-9存在于橄榄、杏仁、昆士兰果、榛实、芝麻、鳄梨、亚麻仁及其油内。地中海国家橄榄油的消费高与他们乳癌和心脏病发病率较低有关。加州大学的研究指出，单元不饱和脂肪酸含量高的饮食能预防低密度脂蛋白的胆固醇的氧化，并能保护血管壁，这类脂肪也可促进高密度胆固醇控制低密度胆固醇的功能，同时单元不饱和脂肪使抗氧化的维生素e更有效的保护细胞免遭自由基破坏。本发明意外地发现，包含微生物油脂(例如，微藻油)的组合物具有皮肤屏障相关功效，可以提升皮肤屏障活力和促进皮肤屏障相关因子flg、lor、ivl、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1的表达。
[0024]
在一些实施方式中，本发明的组合物包含0.1-100重量％的微生物油脂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含0.1-50重量％的微生物油脂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含0.1-20重量％的微生物油脂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含0.5-10重量％的微生物油脂。
[0025]
天然表面活性剂
[0026]
本发明的组合物还可以包含天然表面活性剂。天然表面活性剂多来自动植物体，为较复杂的高分子有机物。由于其亲水性强，因而能形成乳浊液。而这类物质多有较高的粘度，有益于乳化稳定性。
[0027]
本发明的组合物中包含的天然表面活性剂包括但不限于：卵磷脂、胆甾醇、羊毛脂、茶皂素、蛋白质、皂苷类、糖类、烷基多苷等。卵磷脂存在于生物细胞中，如动物卵、脑等组织及植物的种子或胚芽中，卵黄磷脂从蛋黄中提取；大豆中含有丰富的卵磷脂。卵磷脂具有乳化、分散、抗氧化等生理活性，是天然优良的表面活性剂，重要的乳化剂。
[0028]
氢化卵磷脂具有较强的亲水性和保湿性，对皮肤和黏膜有很强的亲和力，用于化妆品的配方中可起到保湿、乳化和分散等作用；作为表面活性剂，还可以调理皮肤，使之达到一个很好的油水平衡效果，利用氢化卵磷脂还可以开发出护肤膏、护手霜、唇膏、防晒油等高级化妆产品。
[0029]
在一些实施方式中，本发明的组合物包含0.1-20重量％的天然表面活性剂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含0.1-10重量％的天然表面活性剂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含0.1-5重量％的天然表面活性剂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含0.5-2重量％的天然表面活性剂。
[0030]
在优选的实施方式中，本发明的组合物中微生物油脂与天然表面活性剂的重量比为1:1至20:1。在更优选的实施方式中，组合物中微生物油脂与天然表面活性剂的重量比为10:1至20:1。
[0031]
药品和/或皮肤外用剂
[0032]
包含微生物油脂的组合物可以被应用于药品和/或皮肤外用剂中，用于增强皮肤
屏障功能。
[0033]
在一些实施方式中，所述药品选自：片剂、胶囊、乳剂、混悬剂、粉末剂、颗粒剂、溶液剂、以及本领域已知的各种药品剂型。根据剂型的不同类型添加不同的用量。
[0034]
在一些实施方式中，所述皮肤外用剂选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。根据制剂的不同类型添加不同的用量。
[0035]
所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆品组合物。所述化妆品组合物中可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。所述化妆品组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
[0036]
皮肤外用剂含有皮肤学上可接受的载体或媒介物(例如，洗液、面霜、软膏、清洁剂等等)。本领域普通技术人员能够根据本领域公知常识，选择能够以上文所述的浓度溶解或分散这些组分的载体。
[0037]
本领域普通技术人员能够根据公知常识和它们以最适用于处理时活性组分的浓度而溶解或分散在活性组分中的能力来选择适宜的载体，所述载体例如包括水、醇类、油等。
[0038]
本发明的皮肤外用剂可以是局部施用产品的形式，其能够从外部施用在皮肤上，并能够以本领域公知的那些普通技术制备。载体可以具有各种实际的形式，例如面霜，敷料，凝胶，洗液，软膏或者液体，其包括敷用和清洗掉的组合物，以及用本领域公知的方法将它们加入到例如干的或湿的涂抹物，水凝胶基质，或粘性(或非粘性)贴片的材料载体中。优选地，载体是一种凝胶或增加水分的洗剂，或者以干或湿的形式的涂抹物。
[0039]
典型的载体包括包含水和/或醇和润肤剂的乳剂，其中润肤剂是例如烃的油和蜡，硅油，透明质酸，植物、动物或海洋生物的脂肪或油，甘油酯衍生物，脂肪酸、或脂肪酸酯或醇或醇醚，羊毛脂及其衍生物，多元醇或酯，蜡酯，甾醇，磷脂等等，一般还有乳化剂(非离子的，阳离子的或阴离子的)，尽管一些润肤剂本身具有乳化特性。另外，可以利用其组分的不同比例和/或通过掺入例如树胶或其他形式的亲水胶体的增稠剂将这些相同组分配制成面霜、凝胶、或固体棒。
[0040]
本发明的皮肤外用剂可以包含在皮肤护理组合物中通常能找到的附加组分，例如润肤剂、皮肤调节剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、螯合剂等，只要它们与皮肤外用剂中其他的组分在物理上和化学上相容、且不影响本发明的微生物油脂的效果即可。
[0041]
在本发明的皮肤外用剂的一些实施方式中，可使用一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括对羟基苯乙酮、c1-c4对羟基苯甲酸烷基酯和苯氧基乙醇。基于组合物总重量，防腐剂的用量为大约0.5至大约2重量％，优选大约0.5至1重量％。
[0042]
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种抗氧化剂。适宜的抗氧化剂包括丁化羟基甲苯(bht)、抗坏血酸棕榈酸酯(bha)、丁羟茴醚、苯基-α-萘基胺、氢醌、没食子丙酯、去甲二氢愈创木酸、维生素e或维生素e的衍生物、维生素c及其衍生物、泛酸钙、绿茶提取物和混合的多酚，以及上面所述的物质的混合物。所使用的抗氧化剂是组合物总重量的大约0.02至0.5重量％，更最优选的是从大约0.002至0.1重量％的用量范围。
[0043]
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种润肤剂，通过其保持在皮肤表面上或在角质层中的能力，起到润滑剂的作用，以减少剥落，改善皮肤的外观。典型
的润肤剂包括脂肪酯、脂肪醇、矿物油、聚醚硅氧烷共聚物等等。适宜的润肤剂的例子非限定地包括，聚丙二醇(“ppg”)-15十八烷基醚，ppg-10十六烷基醚，steareth-10，oleth-8，ppg－4十二烷基醚，维生素e醋酸酯，羊毛脂，鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯，羟基硬脂酸辛脂，二甲基聚硅氧烷，以及它们的组合。鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯以及它们的组合是优选的。使用时，润肤剂是基于组合物总重量的大约0.1至大约30重量％，优选大约1至大约30重量％的用量范围。
[0044]
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，还可以使用一种或多种保湿剂。保湿剂也称为湿润剂，其有助于提高润肤剂的效果，减少剥落，刺激组成的鳞皮的去除和提高皮肤触感。可使用多元醇作为保湿剂，包括但并不限于，甘油，聚亚烷基二醇，亚烷基多元醇及其衍生物，包含丁二醇、丙二醇、双丙二醇，聚丙三醇，聚乙二醇及其衍生物，山梨醇，羟丙基山梨醇，己二醇，1,3－二丁二醇，1,2,6-己三醇，乙氧基化甘油，丙氧基化甘油，以及它们的组合。使用时，基于组合物的总重量，保湿剂的用量为大约0.1至大约20重量％，优选是大约1至大约15重量％。
[0045]
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种乳化剂。乳化剂可在有效稳定量的范围内使用。优选地，在组合物总重量的基础上，以大约1.0至大约10.0重量％，更优选的是大约3.0至大约6.0重量％的用量来使用乳化剂。可以使用任何与组合物中的组分相容的乳化剂。适宜的乳化剂包括硬脂酸，鲸蜡醇，甘油硬脂酸酯，卵磷脂，十八烷醇，steareth-2，steareth-20，丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，以及它们的组合。
[0046]
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种ph调节剂。本发明的皮肤外用剂中有益的ph调节剂包括氨丁三醇。使用时，基于组合物的总重量ph调节剂的用量为大约0.1至大约2重量％，优选是大约0.1至大约1重量％。
[0047]
在本发明的一个具体实施方式中，皮肤外用剂包含丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、甘油、对羟基苯乙酮、甘油硬脂酸酯和卵磷脂、十六/十八醇、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、氨丁三醇或它们的组合。
[0048]
在本发明的一些实施方式中，本发明的组合物在皮肤外用剂中的用量为0.001％-100％(w/w)，优选的重量百分比为0.01％-60％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-40％(w/w)。
[0049]
实施例
[0050]
下面结合具体实施例，以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
[0051]
以下实施例中采用的实验材料包括：
[0052]
三油精，商品名微藻油，购自lubrizol advanced materials，inc.
[0053]
氢化卵磷脂，商品名氢化卵磷脂，购自nikko chemicals co.，ltd.。
[0054]
实施例中采用的实验仪器包括：
[0055]
称量天平：mettler toledo公司pb4002-n型；
[0056]
ph计：mettler toledo公司sevenmulti型；
[0057]
水浴锅：上海一恒科技有限公司hws28型电热恒温水浴锅；
[0058]
均质机：polytron公司pt 3100d型；
[0059]
台式搅拌机：ika@eurostar,power control-visc.。
[0060]
实施例1：制备组合物
[0061]
称取0.5质量份氢化卵磷脂于烧杯中，加入99.5质量份的去离子水，搅拌均匀，待用。
[0062]
实施例2：制备包含微生物油脂的组合物
[0063]
称取0.5质量份氢化卵磷脂和1质量份微藻油于烧杯中，边搅拌边加热至75-80℃，后再称取98.5质量份75-80℃的去离子水于烧杯中，开启均质，速度为3000转/分钟，均质5-10分钟，待用。
[0064]
实施例3：制备包含微生物油脂的组合物
[0065]
称取0.5质量份氢化卵磷脂和3质量份微藻油于烧杯中，边搅拌边加热至75-80℃，后再称取96.5质量份75-80℃的去离子水于烧杯中，开启均质，速度为3000转/分钟，均质5-10分钟，待用。
[0066]
实施例4：制备包含微生物油脂的组合物
[0067]
称取0.5质量份氢化卵磷脂和5质量份微藻油于烧杯中，边搅拌边加热至75-80℃，后再称取94.5质量份75-80℃的去离子水于烧杯中，开启均质，速度为3000转/分钟，均质5-10分钟，待用。
[0068]
实施例5：制备包含微生物油脂的组合物
[0069]
称取0.5质量份氢化卵磷脂和7质量份微藻油于烧杯中，边搅拌边加热至75-80℃，后再称取92.5质量份75-80℃的去离子水于烧杯中，开启均质，速度为3000转/分钟，均质5-10分钟，待用。
[0070]
实施例6：制备包含微生物油脂的组合物
[0071]
称取0.5质量份氢化卵磷脂和9质量份微藻油于烧杯中，边搅拌边加热至75-80℃，后再称取90.5质量份75-80℃的去离子水于烧杯中，开启均质，速度为3000转/分钟，均质5-10分钟，待用。
[0072]
测试例1：3d重组皮肤表皮模型屏障相关基因表达测试
[0073]
3d表皮重组模型是一种人源的3d表皮模型，可以模拟角质形成细胞分化的表皮各层结构。将适量样品覆盖在表皮模型上24小时，然后收集表皮组织总核糖核酸(rna)，采用rna反转录技术和基因微阵列技术对皮肤屏障相关基因进行定量检测，进而评估样品的皮肤屏障保湿和修复能力。
[0074]
1.试验材料
[0075]
1.1细胞：皮肤模型为3d表皮皮肤模型(episkin)。
[0076]
1.2试剂：
[0077]
3d皮肤模型维持培养基、3d皮肤模型检测培养基(episkin)；十二烷基硫酸钠(sds)(sigma)；含钙镁dpbs(gibco)；mtt(sigma)；异丙醇、浓盐酸(国药集团)。
[0078]
1.3主要设备
[0079]
co2培养箱heracell 240i、生物安全柜1300series a2、酶标仪multiskan mk3
(thermo)；正向移液器m25(gilson)；50ml连续加样器枪头multipette plus(eppendorf)；皮肤打孔器(面积0.38cm2)。
[0080]
2.实验方法：
[0081]
3d重组表皮模型接收及复苏
[0082]
接收3d表皮重组模型，检查包装完整性、核对模型数量，检查维持培养基、检测培养基的颜色和体积。确认无误后，开始进行模型复苏。
[0083]
在生物安全柜中进行复苏操作。取一定数量的12孔板，在第一行中加入2毫升/孔的维持培养基，然后用镊子将3d重组表皮模型取出，用棉签小心去除表面凝胶，放入含维持培养基的孔中，复苏24小时。一块12孔板可复苏4个3d重组表皮模型。培养条件：5％co2，37℃恒温培养箱培养。
[0084]
3d重组表皮模型样品处理
[0085]
将模型分为实施例1-6样品组(每个样品3个重复)及阳性对照组(罗格列酮，3个重复)。
[0086]
先在12孔板第二行中加入2毫升/孔的维持培养基，然后用镊子将位于第一行中的3d重组表皮模型转移至对应的第二行中。
[0087]
用活塞排代式移液器(m25)在阳性对照组中加入15微升罗格列酮溶液(100微摩尔，溶于1
×
dpbs)，在样品组中加入15微升样品，并用吸嘴在皮肤模型表面轻轻将样品涂布均匀，每个样品三个重复。所有模型放入细胞培养箱中，培养24小时。培养条件：5％co2，37℃恒温培养箱培养。
[0088]
3d重组表皮模型收集总rna样品
[0089]
用50毫升连续加样器吸取1
×
dpbs，将模型表面的样品冲洗掉(不能直接对准样品进行冲洗，需对准皮肤模型支持框架侧壁)，然后用棉签吸去残余液体。用打孔器将表皮组织切下，并用两把小号弯头镊子将表皮组织与其下的胶原底座分离，将表皮组织放入含有1毫升总rna抽提试剂(trizol)的ep管中，用1毫升无rna酶的移液器吸嘴反复吹打表皮组织，至仅剩透明状的角质层。随后，在原ep管中加入0.2毫升氯仿，剧烈振荡，低温高速离心15分钟。用无rna酶的移液器吸嘴取上层水相500微升，然后加入等体积的预冷(负20度)的异丙醇颠倒混匀，低温高速离心10分钟。离心后的rna在ep管底部形成白色片状沉淀，用75％乙醇漂洗两次，用离心机和吸嘴去掉残留乙醇，开盖室温晾干至透明状。用40微升无rna酶的h2o溶解，混匀。再用微量分光光度计nanodrop测rna浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。溶解后的表皮模型组织总rna用于后续实验或分装后放-80℃长期保存。
[0090]
rt-qpcr法定量检测皮肤屏障相关基因
[0091]
取1微克总rna进行反转录，采用反转录试剂盒iscript cdna synthesis kit反转录得到cdna。
[0092]
反转录体系如下：
[0093][0094]
反转录程序如下：25℃，5分钟；42℃，30分钟；85℃，5分钟。
[0095]
用荧光实时定量聚合酶链式反应(pcr)试剂itaq
tm universalgreen supermix进行荧光实时定量检测，分析屏障相关基因信使rna(mrna)表达情况。
[0096]
反应体系如下：
[0097][0098]
反应程序如下：95℃，30秒；95℃，15秒，60℃，30秒，40个循环；65-95℃，每次降低0.5℃(熔解曲线)。
[0099]
本实施例所用引物序列设计如下：
[0100][0101]
采用2
‑△△
ct
法，分析实施例样品组及阳性对照组(罗格列酮)基因表达相对于实施例1对照组的基因变化情况。
[0102]
3.结果判断
[0103]
实施例1样品组基因表达量作为100％，各组与之相比，大于100％，表明基因表达上调，小于100％，表明基因表达下调。flg、lor等基因上调，表明该样品组有保湿和促进屏障修复的能力；flg、lor等基因下调，表明该样品组不具有保湿和促进屏障修复的能力。
[0104]
表2：各组样品处理后的皮肤屏障因子表达情况
[0105][0106]
如表2所示，实施例1样品(微藻油0％)作为对照，其基因相对表达量为100％，实施例4、7和8样品和阳性对照样品的基因表达情况与之相比，得到相应百分比。
[0107]
具体来说，屏障因子flg在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为288％、319％、340％、395％、562％和362％。
[0108]
具体来说，屏障因子lor在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为266％、329％、319％、342％、595％和351％。
[0109]
具体来说，屏障因子ivl在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为94％、101％、75％、132％、112％和103％。
[0110]
具体来说，屏障因子tgm1在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为148％、182％、134％、208％、209％和161％。
[0111]
具体来说，屏障因子casp14在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为243％、256％、316％、431％、505％和330％。
[0112]
具体来说，屏障因子hmgcr在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为238％、284％、281％、281％、387％和229％。
[0113]
具体来说，屏障因子aqp3在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为126％、107％、131％、192％、217％和131％。
[0114]
具体来说，屏障因子zo-1在实施例2样品(微藻油1％)、实施例3样品(微藻油3％)、实施例4样品(微藻油5％)、实施例5样品(微藻油7％)、实施例6样品(微藻油9％)和阳性对照(罗格列酮)处理后，与实施例1样品(微藻油0％)相比，分别为228％、202％、214％、307％、380％和246％。
[0115]
综上，实施例2样品(微藻油1％)促进flg、lor、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1屏障因子的表达，有利于屏障形成，具有促进皮肤保湿和屏障修护功效。实施例3样品(微藻油3％)促进flg、lor、vil、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1屏障因子的表达，有利于屏障形成，具有促进皮肤保湿和屏障修护功效。实施例4样品(微藻油5％)促进flg、lor、ivl、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1屏障因子的表达，有利于屏障形成，具有促进皮肤保湿和屏障修护功效。实施例5样品(微藻油7％)促进flg、lor、ivl、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1屏障因子的表达，有利于屏障形成，具有促进皮肤保湿和屏障修护功效。实施例6样品(微藻油9％)促进flg、lor、ivl、tgm1、casp14、hmgcr、aqp3和zo-1屏障因子的表达，有利于屏障形成，具有促进皮肤保湿和屏障修护功效。
[0116]
综上，实施例2-6中微藻油在浓度1-9％范围内具有较好的组织修复能力。
[0117]
应用例
[0118]
本发明所述的包含微生物油脂的组合物可以作为中间体原料或功效添加剂用于药品或皮肤外用剂的制备，所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，包括但不限于膏霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾(清洁泡)、喷雾、沐浴露、按摩油、洗面奶等剂型的产品的制备。
[0119]
本发明所述包含微生物油脂的组合物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-100％(w/w)；优选的重量百分比为0.01％-60％(w/w)；更优选的重量百分比为0.01％-40％(w/w)。
[0120]
以下是实施例2-6获得的包含微生物油脂的组合物在皮肤外用剂中的具体应用例，以及这些剂型的配方和制备方法。具体应用例如下：
[0121]
应用例1：面霜的制备
[0122][0123]
应用例2：乳液的制备
[0124]
[0125][0126]
应用例3：眼霜的制备
[0127]
[0128][0129]
应用例4：面膜的制备
[0130][0131]
应用例5：精华液的制备
[0132][0133]
应用例6：本发明中的实施例2-6也可以单独作为皮肤外用剂单独使用。

技术特征：
1.一种包含微生物油脂的组合物，其中，以所述组合物的总重量计，所述组合物包含至少1重量％的微生物油脂。2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微生物油脂是微藻油、雨生红球藻油、长耳齿状藻油。3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含天然表面活性剂，所述天然表面活性剂选自：卵磷脂、胆甾醇、羊毛脂、茶皂素、蛋白质、皂苷类、糖类、烷基多苷或它们的组合。4.如权利要求2所述的组合物，其中，所述天然表面活性剂是氢化卵磷脂。5.如权利要求3或4所述的组合物，其中，所述微生物油脂与所述天然表面活性剂的重量比为1:1至20:1。6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述微生物油脂与所述天然表面活性剂的重量比为10:1至20:1。7.如权利要求1所述的组合物在增强皮肤屏障功能中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其中，所述增强皮肤屏障功能通过促进皮肤屏障相关因子的表达实现。9.如权利要求1所述的组合物在制备用于增强皮肤屏障功能的药品和/或皮肤外用剂中的应用。10.如权利要求9所述的应用，所述药品和/或皮肤外用剂包含0.001-100重量％的所述组合物。

技术总结
本发明提供了一种包含微生物油脂的组合物，其中，以所述组合物的总重量计，所述组合物包含至少1重量％的微生物油脂。本发明还涉及包含微生物油脂的组合物在增强皮肤屏障功能和/或在制备用于增强皮肤屏障功能的药品和/或皮肤外用剂中的应用。或皮肤外用剂中的应用。


技术研发人员：张瑶瑶 殷庆飞
受保护的技术使用者：上海家化联合股份有限公司
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2022/3/8