样本密度分离液及细胞分离方法与流程

1.本发明涉及细胞学制片技术领域，尤其涉及样本密度分离液及细胞分离方法。


背景技术：

2.宫颈癌是目前唯一病因明确，可早期发现早期预防的癌症，因此对宫颈癌的早期筛查对预防宫颈癌有着重要意义。液基细胞检查，简称tct，是近年来推出的一种新的细胞学制片技术，是制片领域的重大革新。相比于传统涂片，液基细胞学通过保存液保存标本，再经过一系列前期技术处理，去掉标本中的杂质成分，制成镜下观察清晰的薄层，使阅片者更容易观察，其诊断准确性，敏感性比传统涂片明显提高，可以有效地采集及保存宫颈脱落细胞是宫颈癌筛查的关键技术。
3.现有的液基细胞学制片技术包括有膜式过滤法、离心沉降法、离心甩片法，其中自动离心沉降法制片技术是将收集到的样品加入到样本密度分离液中,利用不同细胞类型和成分之间比重不同，在离心力的作用下将样本中的不同组成成分分离,第一次离心是将保存液中的正常细胞进入到密度分离液中，血细胞和白细胞由于比重比密度分离液小，从而分为上下两层,这样样品中细胞沉降达到两者交界处，再经过二次离心，比重比较大的细胞优先沉降下来，富集后的细胞转移到玻片上自然沉降，最后在显微镜下观察诊断。
4.现有的样本密度分离液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，简称聚蔗糖，但在向保存液中加入密度分离液后，在保存液与样本密度分离液分层处的未被保存液完全裂解的红细胞会与聚蔗糖接触而凝集成串钱状而沉积于管底与下沉的具有诊断学意义的细胞(上皮细胞、肿瘤细胞)混合，影响后续制片后对样品的观察。另外传统的样本密度分离液不具有去除粘液的功能，而由于粘液将细胞包裹，无法通过密度离心进行分离，也对最终的制片效果产生影响。因此，本领域仍需要对样本密度分离液进行进一步的优化。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提高制片效果的样本密度分离液及细胞分离方法。
6.本发明提供的样品密度分离液，其由溶剂和乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素和亚硫酸钠；所述溶剂由水、丙三醇和苯氧乙醇组成。
7.本发明苯氧乙醇作为防腐剂，可以应对细胞样本中的复杂成分，能使细胞长时间保存不发生形态改变；乙二胺四乙酸二钠具有细胞抗凝作用，不易使细胞中的血液发生凝固；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠起到ph值缓冲作用，二者相互配合使用，可有助于提高缓冲效果；氯化钠和氯化钾用于维持细胞正常渗透压，保持细胞不膨胀、不固缩，保持适宜的离子浓度也能够有效保持细胞的形态；二硫苏糖醇、茶皂素、有助于细胞粘液、血液分散裂解，从而将细胞释放出来，最终收集到具有诊断意义的细胞；亚硫酸钠保护剂的抗氧化作用可防止在自动化设备长期工作过程形成结晶性物质。
8.本发明所述的样品密度分离液中所述溶剂中，水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为(70～90)：(9～29)：(0.5～2)。
9.一些具体实施例中，所述溶剂中，水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为900:99:1，或为840:159:1，或为700:299:1。
10.一些实施例中，所述样品密度分离液由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1～3g/l，磷酸氢二钠0.4～0.8g/l，磷酸二氢钾1～3g/l，氯化钾0.1～0.3g/l，氯化钠6.5～8g/l、二硫苏糖醇0～0.2g/l、茶皂素0～0.2g/l和亚硫酸钠0～0.1g/l。
11.一些具体实施例中，所述样品密度分离液由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l；
12.另一些具体实施例中，所述样品密度分离液由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.2g/l、茶皂素0.2g/l、亚硫酸钠0.08g/l；
13.另一些具体实施例中，所述样品密度分离液由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.3g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l；
14.另一些具体实施例中，所述样品密度分离液由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.3g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
15.本发明实施例中，所述样品密度分离液的ph值为6.8～7.2。一些实施例中，所述样品密度分离液的ph值为6.8、6.9、7.0、7.1或7.2。
16.一些具体实施例中，所述样品密度分离液的ph值为6.8，其溶液中水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为900:99:1；并含有乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
17.一些具体实施例中，所述样品密度分离液的ph值为6.9，其溶液中水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为840:159:1；并含有乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
18.一些具体实施例中，所述样品密度分离液的ph值为7.0，其溶液中水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为700:299:1；并含有乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
19.一些具体实施例中，所述样品密度分离液的ph值为7.1，其溶液中水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为840:159:1；并含有乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.3g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
20.一些具体实施例中，所述样品密度分离液的ph值为7.2，其溶液中水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为840:159:1；并含有乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸
二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.2g/l、茶皂素0.2g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
21.一些具体实施例中，所述样品密度分离液的ph值为7.2，其溶液中水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为840:159:1；并含有乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.3g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l。
22.本发明的样本密度分离液中各个组分配比合理，能够快速分散细胞，稳定细胞的ph值，防止标本中血液凝结，及时裂解标本中的红细胞，溶解标本中粘液的粘蛋白，同时防腐杀菌，使标本可以长期保存，充分保留了有诊断意义的细胞成分，其制备过程工艺简单，操作难度低，原材料无毒环保，成本低廉，易于实现规模化生产。
23.本发明所述样品密度分离液的制备方法，包括：
24.以水溶解氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠，搅拌20min，得到溶液a；
25.向溶液a中加入二硫苏糖醇、茶皂素和亚硫酸钠，搅拌5min，得到溶液b；
26.向溶液b中添加苯氧乙醇，搅拌5min，得到溶液c；
27.以氢氧化钠溶液调节ph值为6.8～7.2，制得所述样品密度分离液。
28.本发明所述样品密度分离液在制备tct涂片中的应用。
29.本发明还提供了一种tct涂片的制备方法，其包括：以本发明所述所述样品密度分离液处理样品后制片。本发明中，所述样品为宫颈拭子。
30.本发明还提供了一种液基细胞检查方法，其包括以本发明所述所述样品密度分离液对样品制片后，进行检测。所述样品为宫颈拭子。
31.本发明提供的样本密度分离液由溶剂和乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素和亚硫酸钠组成。其可以有效软化和分解样本中的粘液，检测背景清晰干净，细胞形态观察清楚。对红细胞和白细胞的裂解效果好，能够有效避免其对观察结果的干扰。且该样本密度分离液保存时间长、检测效果稳定。其中组分环保无毒，对目标细胞没有损害，且无需预处理步骤，配方简单，操作简便，保存成本较低。并且，其中含有的保护剂的抗氧化作用可防止在自动化设备长期工作过程形成结晶性物质，非常适合在自动化设备上使用。
附图说明
32.图1示实验组1的样品密度分离液(ph7.2)处理宫颈拭子后制片效果；
33.图2示对照组1的样品密度分离液(ph6.5)处理宫颈拭子后制片效果；
34.图3示实验组2的样品密度分离液(ph7.2)处理宫颈拭子后制片效果；
35.图4示对照组2的样品密度分离液(ph7.5)处理宫颈拭子后制片效果。
具体实施方式
36.本发明提供了样本密度分离液及细胞分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施
例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
37.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
38.实施例1
39.按照如下配比制备分离液：
40.表1实验组样品分离液配方
[0041][0042]
表2对照组样品分离液配方
[0043][0044][0045]
样本密度分离液的制备方法包括：
[0046]
①
在全部纯化水中加入称量好的氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠，搅拌20min，得到溶液a。
[0047]
②
向a液中加称量好的二硫苏糖醇、茶皂素、亚硫酸钠搅拌5min，得到溶液b。
[0048]
③
向b液中添加称量好的苯氧乙醇混合搅拌5min，得到溶液c。
[0049]
④
加氢氧化钠，使ph在6.8-7.2之间。
[0050]
⑤
制备环境为常温常压下进行。
[0051]
效果验证
[0052]
按照表1和表2中记载的配方各配制样本密度分离液l升试剂，实验组按照表1调节ph值，对照组分离液分别调节ph值为6.5或7.5，每瓶样本密度分离液灌装500ml。
[0053]
分别取样本放入装有各实验组或对照组密度分离液的离心管中(每个离心管中放入6ml样本，4ml分离液)，通过手工或自动制片染色机制片染色后观察染色效果(图1～4)。染色后的效果评价分为三个等级，评价指标判定如表3，评价结果如表4、表5；
[0054]
表3评价指标判定
[0055][0056]
表4评价结果
[0057]
[0058]
由表4、表5、图1～图4的实验结果所示，样本在加入样本密度分离液中后，采用实验组1～6的密度分离效果明显好于对照组1～6，说明实验组1～6的配方明显优于对比例1～6，ph值在6.8～7.2范围内，细胞量符合要求、背景干净，无血细胞、粘液细胞、白细胞数量不影响诊断要求。
[0059]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.样品密度分离液，其特征在于，由溶剂和乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素和亚硫酸钠；所述溶剂由水、丙三醇和苯氧乙醇组成。2.根据权利要求1所述的样品密度分离液，其特征在于，所述溶剂中，水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为(700～900)：(99～299)：(0～2)。3.根据权利要求1所述的样品密度分离液，其特征在于，所述溶剂中，水、丙三醇和苯氧乙醇的体积比为900:99:1，或为840:159:1，或为700:299:1。4.根据权利要求1～3任一项所述的样品密度分离液，其特征在于，由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1～3g/l，磷酸氢二钠0.4～0.8g/l，磷酸二氢钾1～3g/l，氯化钾0.1～0.3g/l，氯化钠6.5～8g/l、二硫苏糖醇0～0.2g/l、茶皂素0～0.2g/l和亚硫酸钠0～0.1g/l。5.根据权利要求4所述的样品密度分离液，其特征在于，由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l；或由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.2g/l、茶皂素0.2g/l、亚硫酸钠0.08g/l；或由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.3g/l、茶皂素0.1g/l、亚硫酸钠0.08g/l；或由溶剂和如下浓度的组分组成：乙二胺四乙酸二钠1.86g/l，磷酸氢二钠0.6g/l，磷酸二氢钾1.44g/l，氯化钾0.2g/l，氯化钠7g/l、二硫苏糖醇0.1g/l、茶皂素0.3g/l、亚硫酸钠0.08g/l。6.根据根据权利要求1～5任一项所述的样品密度分离液，其特征在于，其ph值为6.8～7.2。7.权利要求1～6任一项所述样品密度分离液的制备方法，其特征在于，包括：以水溶解氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠，搅拌20min，得到溶液a；向溶液a中加入二硫苏糖醇、茶皂素和亚硫酸钠，搅拌5min，得到溶液b；向溶液b中添加苯氧乙醇，搅拌5min，得到溶液c；以氢氧化钠溶液调节ph值为6.8～7.2，制得所述样品密度分离液。8.权利要求1～6任一项所述样品密度分离液在制备tct涂片中的应用。9.一种tct涂片的制备方法，其特征在于，包括：以权利要求1～6任一项所述样品密度分离液处理样品后制片。10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述样品为宫颈拭子。

技术总结
本发明涉及细胞学制片技术领域，尤其涉及样本密度分离液及细胞分离方法。本发明提供的样本密度分离液由溶剂和乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素和亚硫酸钠组成。其可以有效软化和分解样本中的粘液，检测背景清晰干净，细胞形态观察清楚。形态观察清楚。


技术研发人员：张明伟 刘美静 孙欣欣 李婧 盛春海 蓝皓慧
受保护的技术使用者：山东高创医疗器械国家研究院有限公司
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8