一种检测抗生素抗性基因绝对定量PCR试剂盒的制作方法

一种检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒
技术领域
1.本实用新型涉及机械领域，具体地，涉及试剂盒。


背景技术：

2.自从20世纪发现抗生素以来，被广泛应用于人类疾病、家禽畜牧水产养殖等，促进了人类社会的经济发展，但是抗生素滥用的情况和危害近些年来逐渐被大众所认识。抗生素是抗微生物药物里最主要的一大类，抗生素的过度使用和滥用导致了地球环境中抗生素耐药细菌(antibiotic resistance bacteria,arb)和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)的出现。
3.抗生素抗性基因已被确定为“新兴的环境污染物”，目前在污水处理厂、养殖水域、地表水、饮用水、土壤、沉积物以及空气等不同的环境介质中已发现。它不但会对我们生存环境造成破坏，而且会通过食物链进入人体内，对公共健康构成威胁。世界卫生组织已将抗生素抗性基因作为21世纪威胁人类健康的最大挑战之一。
4.目前抗生素抗性基因检测主要通过高通量测序和高通量定量pcr完成，当前由于技术发展的原因，高通量测序和高通量定量pcr比较适合筛选高丰度的抗性基因，对于低丰度的抗性基因检测效果不是很稳定，另外对于抗性基因的具体在环境样品中的含量，没办法进行计算，所以得到的数据只能是相对含量，没办法进行通用比较，导致不同地方得到的数据不能横向比较，且现有试剂盒的存储效果不佳。
5.针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。


技术实现要素：

6.本实用新型的目的是提供一种检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒，以解决上述至少一个技术问题。
7.为了达到上述目的，本实用新型采用下述技术方案：
8.一种检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于，所述试剂盒本体包括呈长方体状的盒体，所述盒体内设有96孔板、封板膜、金属固定盘、固定海绵垫，所述金属固定盘设置在所述固定海绵垫的上方，所述96孔板与所述封板膜均设置在所述金属固定盘的上方；
9.所述固定海绵垫上设有6个用于存放离心管的插槽，6个所述插槽包括第一插槽、第二插槽、第三插槽、第四插槽、第五插槽与第六插槽，所述第一插槽处设有用于存储抗性基因检测正向引物的第一离心管，所述第二插槽处设有用于存储抗性基因检测反向引物的第二离心管，所述第三插槽处设有用于存储定量pcr反应酶预混液的第三离心管，所述第四插槽处设有用于存储阳性质粒标准品的第四离心管，所述第五插槽处设有用于存储阴性对照试剂的第五离心管，所述第六插槽处设有用于存储无核酸酶的超纯水的第六离心管。
10.所述第一离心管、第二离心管、第三离心管、第四离心管、第五离心管与第六离心管均采用1.5ml离心管。
11.所述盒体的左侧内壁上设有呈横向设置的第一条状凸起，所述盒体的右侧内壁上设有呈横向设置的第二条状凸起，所述金属固定盘的两侧部分别架设在所述第一条状凸起与所述第二条状凸起上。
12.所述金属固定盘的两侧均设有横截面呈半圆状的缺口。
13.所述盒体的左侧内壁上设有至少两根呈纵向设置的第三条状凸起，所述固定海绵垫的左侧部上设有与所述第三条状凸起相匹配的第一嵌入槽；
14.所述盒体的右侧内壁上设有至少两根呈纵向设置的第四条状凸起，所述固定海绵垫的右侧部上设有与所述第四条状凸起相匹配的第二嵌入槽。
15.所述第三条状凸起的宽度大于所述第一嵌入槽的深度，所述第四条状凸起的宽度大于所述第二嵌入槽的深度。
16.本实用新型通过此设计，提供了一种检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒，结构简单、使用便捷、准确性高，可以很好的应用于特定的抗性基因含量的测定，且提高了试剂盒的存储效果。
附图说明
17.图1为本实用新型的部分结构截面示意图；
18.图2为本实用新型的金属固定盘处的部分结构示意图；
19.图3为本实用新型的固定海绵垫处的部分结构示意图；
20.图4为通过使用本实用新型后制成的梯度标准品扩增曲线示意图；
21.图5为通过使用本实用新型后制成的标准曲线示意图。
具体实施方式
22.以下结合附图对本实用新型的具体实施方式作进一步地说明。
23.如图1～3所示，一种检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒，包括试剂盒本体，试剂盒本体包括呈长方体状的盒体1，盒体内设有96孔板、封板膜、金属固定盘2、固定海绵垫3，金属固定盘设置在固定海绵垫的上方，96孔板与封板膜均设置在金属固定盘的上方；固定海绵垫上设有6个用于存放离心管的插槽，6个插槽包括第一插槽、第二插槽、第三插槽、第四插槽、第五插槽与第六插槽，第一插槽处设有用于存储抗性基因检测正向引物的第一离心管，第二插槽处设有用于存储抗性基因检测反向引物的第二离心管，第三插槽处设有用于存储定量pcr反应酶预混液的第三离心管，第四插槽处设有用于存储阳性质粒标准品的第四离心管，第五插槽处设有用于存储阴性对照试剂的第五离心管，第六插槽处设有用于存储无核酸酶的超纯水的第六离心管。本实用新型通过此设计，提供了一种检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒，结构简单、使用便捷、准确性高，可以很好的应用于特定的抗性基因含量的测定，且提高了试剂盒的存储效果。
24.为了便于试剂盒的使用，第一插槽、第二插槽、第三插槽、第四插槽、第五插槽与第六插槽呈均匀排布在固定海绵垫上。第一离心管、第二离心管、第三离心管、第四离心管、第五离心管与第六离心管均采用1.5ml离心管。
25.盒体的左侧内壁上设有呈横向设置的第一条状凸起，盒体的右侧内壁上设有呈横向设置的第二条状凸起4，金属固定盘的两侧部分别架设在第一条状凸起与第二条状凸起
上。金属固定盘的两侧均设有横截面呈半圆状的缺口。缺口处设有向上延伸的翻边。通过盒壁两侧的第二条状凸起支撑金属固定盘，并在金属固定盘两侧设置半圆状的缺口，便于使用者取出金属固定盘。
26.盒体的左侧内壁上设有至少两根呈纵向设置的第三条状凸起，固定海绵垫的左侧部上设有与第三条状凸起相匹配的第一嵌入槽；盒体的右侧内壁上设有至少两根呈纵向设置的第四条状凸起5，固定海绵垫的右侧部上设有与第四条状凸起相匹配的第二嵌入槽。第三条状凸起的宽度大于第一嵌入槽的深度，第四条状凸起的宽度大于第二嵌入槽的深度。利用纵向设置的条状凸起卡入固定海绵垫两侧的嵌入槽内，便于卡紧并固定固定海绵垫，同时，纵向设置的条状凸起宽度大于嵌入槽的深度，使得固定海绵垫与盒体侧壁之间形成间隙，便于使用者取出固定海绵垫。为了便于取出固定海绵垫，固定海绵垫的长度不大于两根第二条状凸起之间的间距。
27.在使用时，用于检测抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒的使用方法包括以下步骤：
28.1、打开盒体，取出盒体内的金属固定盘，放置一旁待用，再次取出固定海绵垫，并取出装有抗性基因检测正向引物的第一离心管、装有抗性基因检测反向引物的第二离心管、装有定量pcr反应酶预混液的第三离心管、装有阳性质粒标准品的第四离心管、装有阴性对照试剂的第五离心管与装有无核酸酶的超纯水的第六离心管，在室温下充分熔解后，通过1500rpm快速离心15s，放置在冰上备用；
29.2、制备阳性标准品梯度：取上述阳性标准品10ul，按10倍梯度稀释，依次稀释4-8梯度即为阳性标准梯度；
30.3、按照表1配制一个反应为10ul的pcr反应工作液，一批样品需要2个阴性对照；
31.表1、用于抗生素抗性基因绝对定量pcr试剂盒反应工作液配制表
32.组分体积(μl)体积(μl)pcr反应酶预混液5.25.2抗性基因正向引物-f0.50.5抗性基因反向引物-r0.50.5待测样本1/阴性对照/1无核酸酶的超纯水2.82.8总体积1010
33.4、将配制完成的pcr反应工作液涡旋离心15s；
34.5、将金属固定盘上的96孔板取出，进行加样；
35.6、按照表2设置pcr反应程序；
36.表2、pcr反应程序
[0037][0038]
7、设置好pcr反应程序，开始进行pcr反应；
[0039]
8、电脑采集完数据，进行结果分析。
[0040]
采用上述步骤3的反应体系及步骤6的反应条件，对上诉标准品质量的各个梯度进行荧光定量pcr扩增，得到了如图4所示的梯度标准品扩增曲线，和如图5所示的一条标准曲线。
[0041]
最后应说明的是：以上仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限定本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。