一种重组胶原蛋白复合注射剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及美容及软组织注射填充技术领域，更具体的说是涉及一种重组胶原蛋白复合注射剂及其制备方法。


背景技术：

2.随着生活质量的提高，人们不仅追求生活得健康，更追求生活得美丽。人们寻找安全、有效、经济的方式减轻老化迹象，减少脸部皱纹，注重面部肌肤护理和滋润，改善容貌状态。
3.近年来，相对安全有效的医疗美容方式是在面部软组织直接注射填充剂，起深层滋润皮肤，改善皮肤状态的功效。注射美容技术已经成为软组织注射美容手术的主要项目之一，其不开刀、不流血的微创性及操作方便、见效快等特点被广大爱美人士所推崇。
4.重组胶原蛋白是近年来随着生物技术发展而产生一种非动物源生物蛋白材料，具有生物相容性高，无明显免疫排斥反应，无动物病毒风险等优势。但是，目前专利报道的产品大多制备周期较长，化学交联工艺复杂，试剂残留难控制。
5.如，中国专利cn101648989公开了一种长效型胶原蛋白及其制造方法，该专利是将一猪皮经过刮除多余组织、去除油脂、膨润、消化、离心分离、盐析、收集下层沉淀物、冷冻干燥后即可得一胶原蛋白，再将该胶原蛋白与γ-聚麸胺酸(γ-pga)混合，同时加入一戊二醛溶液并搅拌均匀，进行第一交联，再重复加入该戊二醛溶液搅拌均匀，进行第二次交联后，即可得该长效型胶原蛋白。但是，该专利制备工艺复杂，且所用戊二醛为高危害性试剂，同时产品无有效的保湿、补水效果，会随着机头高渗透压而快速失水，影响产品效果。
6.因此，如何开发一种创伤小、有效避免化学试剂残留影响、补充水分和营养、改善皮肤状态且制备工艺简单安全的美容注射剂是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组胶原蛋白复合注射剂及其制备方法，该注射剂针对面部皱纹、颈部皱纹及其它需填充的软组织部位，具有创伤小、生物安全性高、有效避免化学试剂残留影响、补充水分和营养、滋润肌肤和安全性高且制备工艺简单安全等优点。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种重组胶原蛋白复合注射剂，由包括胶原蛋白、透明质酸钠和磷酸盐缓冲液；其中，胶原蛋白的质量百分数为0.5％-10％，透明质酸钠的质量百分数为0.1％-0.9％，余量为磷酸盐缓冲液。
10.进一步，上述胶原蛋白由真核系统工程菌发酵并纯化重组制得。
11.采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明制得的胶原蛋白是一种纯生物制品，具有无病毒残留、无免疫原性、无内毒素等特点，且无动物病毒风险和免疫原性排异风险。
12.进一步，上述胶原蛋白的分子量为20-100kda。
13.采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选胶原蛋白是肌体自然蛋白，有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用，且对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性，可降解吸收，粘着力好。
14.进一步，上述透明质酸钠分子量为1000-2600kda。
15.采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选透明质酸钠具有较强的黏弹性和润滑性，能渗透到真皮层，促进血液微循环，有利于皮肤对营养物质的吸收，起到美容抗皱的保健作用；促进皮肤营养的供给和废物的排泄，从而防止皮肤老化，起到美容养颜作用；且具有良好的保湿作用。
16.一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
17.(1)按上述重组胶原蛋白复合注射剂的质量百分数称取各原料；
18.(2)在酸性环境下，将胶原蛋白和透明质酸钠混合均匀，得到复合溶液；
19.(3)将复合溶液进行反复冻融，得到重组复合物；
20.(4)将重组复合物加入磷酸盐缓冲液中进行酸碱度平衡，然后灌装于预灌封注射器中，即得重组胶原蛋白复合注射剂。
21.本发明制备方法的有益效果在于，可以获得补水效果佳，安全性高，生物相容性更好的美容修复及软组织注射填充产品。
22.进一步，上述步骤(2)中，酸性环境为ph＝1-3。
23.进一步，上述步骤(3)中，反复冻融的冷冻温度为(-30)-(-20)℃，复融温度为20-37℃；反复冻融的间隔为12h，次数为3-12次。
24.采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过反复冻融，能够使重组胶原蛋白和透明质酸钠充分形成分子间及分子内氢键。
25.进一步，上述步骤(4)中，酸碱度平衡至ph＝6.0-7.0。
26.进一步，上述步骤(4)中，灌装过程在负压和无菌条件下进行。
27.采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过负压和无菌，能够保证产品的完整性和无菌性。
28.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
29.1、本发明采用的重组胶原蛋白是以基因工程技术进行的微生物发酵法表达，是一种纯生物制品，具有无病毒残留、无免疫原性、无内毒素等特点，且无动物病毒风险和免疫原性排异风险。
30.2、本发明采用胶原蛋白与透明质酸钠高分子多糖物理交联的方式，有效保障了产品的补水效果，增加了产品的填充功效，同时保证胶原的刺激自体胶原再生作用，无其他毒性试剂的不良影响。
31.3、本发明采用物理交联对胶原蛋白和透明质酸钠复合溶液进行改性，能够有效控制胶原缓释效率，改善局部细胞生长微环境，保证了产品对机体长期的胶原刺激增生作用，也提高了产品耐降解性和补水保湿效果，增加了临床的使用优势。
32.4、本发明开发了一种物理交联状粘稠溶液形式的胶原蛋白复合制剂，适用于医疗美容领域，针对面部皱纹、颈部皱纹及其它软组织部位，便于微注射的美容填充用，具有安全性高，创伤小、补充水分和营养、改善皮肤状态等优点。
具体实施方式
33.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.重组胶原蛋白复合注射剂，以质量百分数计，由包括5％分子量为80kda的胶原蛋白、0.5％分子量为1000kda的透明质酸钠和余量的磷酸盐缓冲液经物理交联制得；其中，胶原蛋白由真核系统工程菌发酵并纯化重组制得。
36.上述重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
37.(1)按上述重组胶原蛋白复合注射剂的质量百分数称取各原料；
38.(2)在ph＝2的酸性环境下，将胶原蛋白和透明质酸钠混合均匀，得到复合溶液；
39.(3)将复合溶液先在-30℃下冷冻12h，之后20℃复融12h，此为1个循环，反复6个循环，使重组胶原蛋白与透明质酸钠充分形成分子间及分子内氢键，得到重组复合物；
40.(4)将重组复合物加入100倍体积的磷酸盐缓冲液中进行酸碱度平衡至ph＝6.5，然后在负压和无菌条件下，将其灌装于预灌封注射器中，即得重组胶原蛋白复合注射剂。
41.实施例2
42.重组胶原蛋白复合注射剂，以质量百分数计，由包括8％分子量为100kda的胶原蛋白、0.35％分子量为2600kda的透明质酸钠和余量的磷酸盐缓冲液经物理交联制得；其中，胶原蛋白由真核系统工程菌发酵并纯化重组制得。
43.上述重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
44.(1)按上述重组胶原蛋白复合注射剂的质量百分数称取各原料；
45.(2)在ph＝1.5的酸性环境下，将胶原蛋白和透明质酸钠混合均匀，得到复合溶液；
46.(3)将复合溶液先在-22℃下冷冻10h，之后25℃复融12h，此为1个循环，反复3个循环，使重组胶原蛋白与透明质酸钠充分形成分子间及分子内氢键，得到重组复合物；
47.(4)将重组复合物加入100倍体积的磷酸盐缓冲液中进行酸碱度平衡至ph＝7.0，然后在负压和无菌条件下，将其灌装于预灌封注射器中，即得重组胶原蛋白复合注射剂。
48.实施例3
49.重组胶原蛋白复合注射剂，以质量百分数计，由包括10％分子量为20kda的胶原蛋白、0.9％分子量为1800kda的透明质酸钠和余量的磷酸盐缓冲液经物理交联制得；其中，胶原蛋白由真核系统工程菌发酵并纯化重组制得。
50.上述重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
51.(1)按上述重组胶原蛋白复合注射剂的质量百分数称取各原料；
52.(2)在ph＝1的酸性环境下，将胶原蛋白和透明质酸钠混合均匀，得到复合溶液；
53.(3)将复合溶液先在-20℃下冷冻12h，之后37℃复融12h，此为1个循环，反复12个循环，使重组胶原蛋白与透明质酸钠充分形成分子间及分子内氢键，得到重组复合物；
54.(4)将重组复合物加入200倍体积的磷酸盐缓冲液中进行酸碱度平衡至ph＝6.0，然后在负压和无菌条件下，将其灌装于预灌封注射器中，即得重组胶原蛋白复合注射剂。
55.性能测试
56.以下采用实施例1方法制备的样品进行性能测试，实施例2-3性能于实施例1相近。具体结果如下：
57.1、细胞学研究
58.收集生长旺盛的成纤维细胞胰酶消化，配置为1
×
105/ml的细胞悬液，接种至96孔板中。向96孔板细胞悬液中分别加入试验组(实施例1制得的重组胶原蛋白复合注射剂)、对照组(商品名称：嗨体)及空白组，每组6个孔，之后将孔板置于37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱培养，每天显微镜下观察细胞形态。
59.分别在培养第3d、5d、7d时，使用酶联免疫检测仪在490nm波长下测各孔吸光度，取平均值并记录，根据各组的吸光度均值计算细胞的相对增殖率。结果如表1所示。
60.表1不同组材料对成纤维细胞的增殖效果(增殖率)对比结果
[0061][0062]
由表1可知，随时间增加，相对于对照组(商品名称：嗨体)及空白组，试验组(实施例1制得的重组胶原蛋白复合注射剂)的细胞增殖效果最佳。
[0063]
以上试验说明，本发明重组胶原蛋白复合注射剂对成纤维细胞具良好的细胞相容性和更加显著的刺激增生效果。
[0064]
2、推挤力
[0065]
取实施例1制得的重组胶原蛋白复合注射剂，以恒定的速度推动注射器推进杆，注射器针头为27g，推动速度为30mm/min，检测推挤力大小。结果如表2所示。
[0066]
表2实施例1重组胶原蛋白复合注射剂推挤力检测结果
[0067]
组别推挤力外科手术适手性要求实施例1重组胶原蛋白复合注射剂10
±
1.9n《15n
[0068]
由表2可知，本发明实施例1重组胶原蛋白复合注射剂的检测结果为推挤力8-12n，符合外科手术适手性要求。
[0069]
3、保湿效果
[0070]
分别取实施例1制得的重组胶原蛋白复合注射剂和对照品(商品名：嗨体)1ml，均匀分散于称重的培养皿中，置于37℃恒温干燥箱中，于8h后观察样品的性质状态和质量。结果如表3所示。
[0071]
表3实施例1重组胶原蛋白复合注射剂保湿性评价
[0072][0073]
由表3可知，与对照品相比，本发明实施例1制得的重组胶原蛋白复合注射剂的状态和质量均更佳，保湿效果更优。
[0074]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种重组胶原蛋白复合注射剂，其特征在于，所述重组胶原蛋白复合注射剂由包括胶原蛋白、透明质酸钠和磷酸盐缓冲液的原料经物理交联制得；其中，所述胶原蛋白的质量百分数为0.5％-10％，所述透明质酸钠的质量百分数为0.1％-0.9％，余量为磷酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂，其特征在于，所述胶原蛋白由真核系统工程菌发酵并纯化重组制得。3.根据权利要求1或2所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂，其特征在于，所述胶原蛋白的分子量为20-100kda。4.根据权利要求1所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂，其特征在于，所述透明质酸钠分子量为1000-2600kda。5.一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)按权利要求1-4任一项所述重组胶原蛋白复合注射剂的质量百分数称取各原料；(2)在酸性环境下，将胶原蛋白和透明质酸钠混合均匀，得到复合溶液；(3)将复合溶液进行物理交联，得到重组复合物；(4)将重组复合物加入磷酸盐缓冲液中进行酸碱度平衡，然后灌装于预灌封注射器中，即得所述重组胶原蛋白复合注射剂。6.根据权利要求5所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酸性环境为ph＝1-3。7.根据权利要求5所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述物理交联为反复冻融，冷冻温度为(-30)-(-20)℃，复融温度为20-37℃。8.根据权利要求5或7所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述物理交联涉及的反复冻融的间隔为12h，次数为3-12次。9.根据权利要求5所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述酸碱度平衡至ph＝6.0-7.0。10.根据权利要求5所述的一种重组胶原蛋白复合注射剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述灌装过程在负压和无菌条件下进行。

技术总结
本发明公开了一种重组胶原蛋白复合注射剂，由包括胶原蛋白、透明质酸钠和磷酸盐缓冲液的原料经物理交联制得；其中，胶原蛋白的质量百分数为0.5％-10％，透明质酸钠的质量百分数为0.1％-0.9％，余量为磷酸盐缓冲液。制备方法：(1)称取各原料；(2)在酸性环境下，将胶原蛋白和透明质酸钠混合均匀；(3)物理交联；(4)加入磷酸盐缓冲液，然后灌装于预灌封注射器中，即得。本发明开发了一种物理交联状粘稠溶液形式的胶原蛋白复合制剂，适用于医疗美容领域，针对面部皱纹、颈部皱纹及其它软组织部位，便于微注射的美容填充用，具有创伤小、补充水分和营养、改善皮肤状态等优点。改善皮肤状态等优点。


技术研发人员：孙器蕾
受保护的技术使用者：三亚悦美科技有限公司
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2022/3/8