RABGGTB在治疗TDP-25型肌萎缩侧索硬化中的应用

rabggtb在治疗tdp-25型肌萎缩侧索硬化中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及rabggtb在治疗tdp-25型肌萎缩侧索硬化中的应用。


背景技术：

2.肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，als)是一种原因不明进行性加重的神经系统变性疾病，主要累及脊髓前角、脑干及大脑皮质的运动神经元，也称为运动神经元病。临床表现为进行性加重的肌无力、肌肉萎缩，言语不利、吞咽困难，腱反射亢进病理征阳性，多在发病3-5年后因呼吸肌麻痹、呼吸衰竭死亡。
3.研究表明tdp43(tar dna bingding protein of 43kda)基因突变/功能异常参与或者影响了als的发生和发展。tdp43由细胞核向细胞质的转定位和蛋白聚集体的累积是遗传性和散发als的典型特征，常被认为是als中运动神经元的病理性标志之一。tdp-43被认为是在als及额颞叶痴呆患者大脑中发现的泛素化包涵体的主要成分，主要功能为参与特定的前mrna的剪接、转录、维持其稳定性及微小mrna的生物合成。tdp43是由tardbp基因中的6个外显子编码，tdp-43蛋白由414个氨基酸组成，由2个rna识别序列和1个富含甘氨酸的c末端组成，具有dna以及rna结合蛋白的能力。同时，tdp-43可在富含甘氨酸的末端被截断，形成两个c末端的片段，分别为25kd、35kd，tdp25、tdp35都具有细胞毒性，其中tdp25的细胞毒性是其中最强的。研究发现，tdp25可以促进tdp43包涵体形成，对运动神经元具有毒性作用，引起神经元变性，在疾病的发病过程中起重要作用，但其机制尚未明确。最初的观点认为：兴奋性毒性可以引起运动神经元损伤。然而，对als患者的神经传导的研究发现，轴索膜兴奋性的提高，及过兴奋性的程度与病人的生存期呈负相关。兴奋性的提高包括持续性钠电流的增加及钾电流的减小。然而对tdp43模型是否存在高兴奋性尚不清楚。有研究在运动神经元样细胞上成功检测出延迟整流钾电流(delayed rectifierpotassium current，ikdr)，并发现tdp25通过改变延迟整流钾电流的激活性质，抑制了延迟整流钾通道的活性，减小电流密度，延长动作电位的复极化时程，增大了细胞的放电频率，从而引起神经元兴奋性增高，对神经元产生兴奋毒性作用，据此推测tdp25对钾电流的抑制产生的细胞兴奋性升高可能是其引起运动神经元变性的可能的机制之一。
4.als仍是一种无法治愈的疾病，目前缺乏有效的治疗方法，美国fda认证的力如太、依达拉奉对其治疗作用非常有限，因此迫切需要早期诊断，早期治疗，寻找有效的治疗靶点开发药物来延缓疾病的进程，延长生存期。治疗中除使用延缓病情发展的药物外，还应包括营养管理、呼吸支持和心理治疗等综合治疗。


技术实现要素：

5.本发明验证了rabggtb在对照细胞和表达tdp25的细胞中的差异表达，进一步验证了在表达tdp25的细胞中过表达rabggtb后的细胞特性，为临床提供了潜在的als诊断方法和治疗方法。
6.诊断
7.一方面，本发明提供了诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的方法，所述方法包括通过rabggtb表达量的检测结果进行判断。
8.另一方面，本发明提供了一种诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括检测样品中rabggtb的表达量所使用的试剂。
9.另一方面，本发明检测rabggtb的表达量的试剂在诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性中的应用；
10.所述rabggtb在肌萎缩侧索硬化的样品中表达下调。
11.本发明所述神经元细胞活性包括以下体现方式：增殖能力、tdp25蛋白聚集情况、自噬情况、rab7的膜定位。在细胞活性好的神经元中，增殖能力强、tdp25蛋白聚集减少、自噬情况改善、rab7的膜定位增加。
12.优选地，所述增殖能力以edu检测情况判断。
13.优选地，所述tdp25蛋白聚集情况由任何蛋白检测方法进行判断。优选地，所述蛋白检测方法是western blot(本发明中也简称为wb实验)。
14.优选地，所述自噬情况由p62的检测结果判断。
15.优选地，所述样品是细胞；
16.优选地，所述检测rabggtb表达量的试剂包括检测rabggtb蛋白表达量和/或rabggtb mrna表达量的试剂。
17.优选地，所述检测rabggtb表达量是检测rabggtb蛋白表达量的试剂。
18.优选地，所述检测rabggtb蛋白表达量的试剂可以是以下任意方法中所使用的试剂：蛋白质印迹(western blot法)、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法。
19.优选地，所述检测rabggtb蛋白表达量的试剂具体地可包括特异性抗体或其片段。
20.进一步地，所述试剂还可以包括与特异性抗体或其片段结合的二抗和/或可检测标记物。
21.优选地，所述特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合性片段的制备方法本身是周知的常规方法，可以购买市售的成品抗体，也可按常规方法制备。从免疫检测的再现性等角度考虑，可优选使用单克隆抗体。
22.优选地，所述特异性抗体的片段保留了与对应抗原的结合性。
23.优选地，所述可检测标记物包括荧光染料、荧光分子、化学发光标记物、染料分子、磷光分子、生物素、放射性同位素、在uv光谱中进行吸收的分子、在近红外辐射中能够进行吸收的分子或远红外辐射中能够进行吸收的分子中的一种或多种。
24.优选地，所述检测rabggtb mrna表达量的试剂可以是以下任意方法中使用到的试剂：基于pcr的检测方法、southern杂交方法、northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、dna微阵列方法、aso法、高通量测序平台方法。
25.治疗
26.另一方面，本发明提供了治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元的方法，所述方法包括使用表达rabggtb的生物材料、或使用促进rabggtb表达的物质。
27.优选地，所述神经元是运动神经元。
28.优选地，所述保护神经元是提高神经元的细胞活性。
29.另一方面，本发明提供了一种治疗肌萎缩侧索硬化、保护运动神经元中的产品，所述产品包括表达rabggtb、促进rabggtb表达的生物材料。
30.优选地，所述生物材料包括编码基因、表达盒、重组载体、细胞、蛋白质。
31.优选地，所述重组载体是质粒表达载体或病毒表达载体。
32.优选地，所述病毒表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或其他类型病毒载体。
33.优选地，所述重组载体可以是自行构建的重组载体，也可以是成熟的商品化的表达载体，例如：pcdna3.1+/-，pcdna4/hismax b，psectag2 a，pvax1，pbudce4.1，ptracer cmv2，pcdna3.1(-)/myc-his a，pcdna6-myc/his b，pcep4，pires，piresneo，pires hyg3，pcmv-myc，pcmv-ha，pires-puro3，pires-neo3，pcaggs，psilencer1.0，psilencer2.1-u6 hygro，psilencer3.1-h1hygro，psilencer3.1-h1neo，psilencer4.1-cmv neo plko.1，plvx-ires-zsgreen1，pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato。
34.优选地，所述保护神经元是指提高神经元细胞活力。
35.更具体地，本发明所述神经元细胞活性包括以下体现方式：增殖能力、tdp25蛋白聚集情况、自噬情况、rab7的膜定位。在细胞活性好的神经元中，增殖能力强、tdp25蛋白聚集减少、自噬情况改善、rab7的膜定位增加。
36.如本领域所熟知，所述“编码基因”是在基因组上的能够被转录成rna的区域，所述rna具有调节功能、催化功能，和/或编码蛋白。本发明所述“编码基因”包括可以包含或不包含内含子的编码序列，凡可编码生成rabggtb的mrna或蛋白的dna序列皆包含在所述编码基因的范围内。
37.优选地，所述产品是药物组合物；
38.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
39.本发明中所述“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物(或人)时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
40.优选地，所述药物组合物可以为片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂，锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂，气雾剂，膜剂，注射剂等任意的剂型。
41.优选地，所述药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室、胸骨内或静脉内给药方式。
42.本发明的药物组合物可单独给药也可与其它药物联合用药；本发明所述治疗方法也可以与其他方法综合使用；所述其他方法包括但不限于：营养管理、呼吸支持和心理治疗等。
43.另一方面，本发明提供了rabggtb在治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元中的应用。
44.优选地，所述神经元是运动神经元。
45.优选地，所述rabggtb是表达rabggtb、促进rabggtb表达的生物材料、或前述包含表达rabggtb、促进rabggtb表达的生物材料的产品。
46.通用概念
47.如本发明所述“tdp25”或“tdp-25”都代表tdp43(tdp-43)断裂形成的25kd的c末端的片段，二者在本发明中可互换使用
48.本发明所述“肌萎缩侧索硬化”“als(amyotrophic lateral sclerosis)”是运动神经元受累的一种疾病，可以出现上运动神经元及下运动神经元的同时受损。
49.优选地，本发明所述肌萎缩侧索硬化包括tdp43或其片段引起的肌萎缩侧索硬化；具体地，本发明所述肌萎缩侧索硬化是tdp25蛋白聚集引起的肌萎缩侧索硬化；。
50.所述tdp-43片段是其发生断裂后的c端片段，按分子量大小可以分为25kd(又称tdp25)、35kd(又称tdp35)，tdp25、tdp35可以促进tdp-43包涵体形成，对运动神经元具有毒性作用。
51.具体地，本发明是在神经元细胞中表达tdp-25而构建的als细胞系模型。构建表达具体基因的细胞系是本领域技术人员所熟悉的常规实验操作。
52.优选地，本发明具体实施例中是通过慢病毒转染构建的als细胞系模型。
53.优选地，所述神经元细胞可以是任意动物的神经元细胞系，包括但不限于鼠神经元细胞，示例性的包括：nsc-34鼠神经元细胞、ht-22小鼠海马神经元细胞、rn-c大鼠皮层神经元细胞、mn-9d小鼠中脑多巴胺能神经元细胞、h19-7大鼠海马神经元细胞。
54.更优选地，本发明具体实施例中所使用的神经元细胞是nsc-34鼠神经元细胞。
55.本发明所述“rabggtb”是一种生物标志物，可以用于标记神经细胞的活性，诊断疾病、评价新药/新疗法在目标人群中的安全性和有效性。rabggtb即rab异戊二烯基转移酶(ggtaseⅱ，type ii protein geranyl-geranyltransferase)的β亚基，ggtase ii-β，其ensembl id是ensg00000137955。
附图说明
56.图1是不同细胞系中荧光检测结果图。
57.图2是不同细胞系中rabggtb的蛋白表达检测结果图。
58.图3是不同细胞系中edu染色检测结果图。
59.图4是不同细胞系中tdp25蛋白表达量检测结果图。
60.图5是不同细胞系中p62染色检测结果图。
61.图6是不同细胞系中rab7膜定位的检测结果图。
具体实施方式
62.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
63.本发明所使用的材料和实验方法
64.本发明所涉及细胞系及构建方法：
[0065][0066]
1.细胞培养和细胞处理
[0067]
将细胞系从液氮中取出，快速复苏，然后在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养，其中含有10％热灭活胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素，并补充0.2mg/mlgeneticin 418硫酸盐(g418)。细胞在37℃、5％co2环境中培养。在所有实验中，细胞在无血清dmem中饥饿6小时。
[0068]
2.分组及慢病毒转染
[0069]
慢病毒转染：调整细胞状态，待细胞状态较好时，一般转染前细胞密度为50％左右，依据moi为10加入病毒原液37℃孵育、培养。在荧光显微镜下观察细胞转染情况，待细胞可见红色荧光后，换用嘌呤霉素培养基(浓度2μg/ml)进行筛选，待镜下可见明显荧光，可进行下一步实验。
[0070]
3.免疫荧光
[0071]
将细胞接种在无菌玻璃盖玻片上，用4％多聚甲醛固定30分钟，然后在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤三次，使用0.5％triton x-100破膜15min，使用1x pbs洗3遍，并在室温下用10％山羊血清(在0.3％triton x-100中稀释)处理30分钟。接下来，细胞在4℃下与抗体一起培养过夜。用二级抗体，具体是山羊抗兔alexa-fluor 647(1:1000；thermo-fisher)、驴抗鼠alexa-fluor 405(1:300；thermo-fisher)、山羊抗鸡alexa-fluor 405(1:500；thermo-fisher)在室温下染色1小时。然后，用dapi-fluoromount-g固定细胞，对细胞核进行染色。用共焦显微镜对标记细胞进行成像。
[0072]
本发明涉及的抗体包括：gfp(1:500,abcam)，p62(1:1000,sigma)，rabggtb(genetex,1:500)，tdp-43(1:500,proteintech)，β-actin(1:1000,proteintech)，rab7(abcam,1:500)。
[0073]
4.cck-8
[0074]
细胞活力通过cck-8测定法进行评估，将细胞接种到96孔板中(每孔1.5
×
104个细胞)进行培养。并在黑暗中在37℃条件下向每个孔中添加100μl新鲜培养基和10μl cck-8溶液2小时。然后，使用微孔板读取器在450nm波长处测量吸光度。
[0075]
5.western blotting
[0076]
使用bca蛋白质分析试剂盒(thermo fisher scientific，23225，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)提取蛋白质。用10％或12％的sds-page分离等量的蛋白质(30μg)，然后转移到pvdf膜上。在用5％脱脂牛奶封闭后，在4℃下将膜与一级抗体孵育过夜，然后清洗三次(10分钟/次)，随后在室温下与二级抗体孵育1小时。最后，使用奥德赛红外成像系统(美国东北部林肯市li-cor)扫描膜上的条带。
[0077]
6.edu染色
[0078]
将细胞接种在无菌玻璃盖玻片上，用4％多聚甲醛固定15分钟，然后在含有3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤两次，用使用0.5％triton x-100破膜20min，在
含有3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤两次，加入click-it plus反应体系，轻轻摇动确保反应混合物均匀，避光室温30min，用含有3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤一次，加入含dapi封片剂封片。用共焦显微镜对标记细胞进行成像。
[0079]
实施例1、过表达rabggtb对nsc34-tdp25运动神经元起到保护作用
[0080]
首先，我们验证了nsc34-e、nsc34-tdp25及过表达rabggtb的nsc34-tdp25细胞中rabggtb的表达量，结果显示nsc34-tdp25细胞中内源性rabggtb表达与nsc34-e相比明显减少(图2)。
[0081]
然后，我们通过慢病毒转染的方式在als细胞模型：nsc34-tdp25细胞中过表达rabggtb，并检测rabggtb的表达量，结果如图1、2，图1结果显示：稳定转染的nsc34-e细胞系携带空质粒绿色荧光蛋白(gfp)；稳定转染的nsc34-tdp25细胞系携带tdp25绿色荧光蛋白(gfp)；稳定转染的nsc34-tdp25-rabggtb-oe细胞系同时携带tdp25绿色荧光蛋白(gfp)和rabggtb过表达红色荧光蛋白(mcherry)。
[0082]
图3结果显示：与nsc34-e比较，nsc34-tdp25细胞中edu表达下降，nsc34-tdp25中过表达rabggtb后edu上调，细胞增殖增加。
[0083]
实施例2、过表达rabggtb减少nsc34-tdp25细胞中tdp25蛋白聚集
[0084]
nsc34-tdp25细胞模型中存在大量tdp25蛋白聚集，我们通过wb实验检测每组细胞中tdp25的聚集。结果显示，与nsc34-e比较，nsc34-tdp25运动神经元中存在大量聚积的tdp25，过表达rabggtb后明显低了nsc34-tdp25运动神经元中tdp25水平(图4)。
[0085]
实施例3、过表达rabggtb改善nsc34-tdp25细胞自噬情况、可以增加细胞中rab7的膜定位
[0086]
p62染色如图5所示，说明过表达rabggtb可以改善nsc34-tdp25细胞中自噬流的异常。
[0087]
自噬体与溶酶体的融合在自噬流调控过程中起着关键作用，研究结果表明rab7在晚期自噬体成熟及自噬体与溶酶体融合过程中发挥重要作用。通过wb检测了各组细胞中rab7的膜定位情况。结果如图6显示：过表达rabggtb可以增加nsc34-tdp25细胞中rab7的膜定位，促进tdp25蛋白聚集体的自噬降解。

技术特征：
1.判断神经元的细胞活性的方法，所述方法包括通过rabggtb表达量的检测结果判断神经元细胞活性；优选地，所述肌萎缩侧索硬化是tdp43或其片段引起的肌萎缩侧索硬化。2.保护神经元的方法，所述方法包括使用表达rabggtb的生物材料、或使用促进rabggtb表达的物质；优选地，所述保护神经元是提高神经元的细胞活性。3.一种诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括检测样品中rabggtb的表达量所使用的试剂和/或仪器。4.权利要求3所述的试剂盒、检测rabggtb的表达量的试剂在诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性中的应用；优选地，所述检测rabggtb表达量的试剂包括检测rabggtb蛋白表达量和/或rabggtb mrna表达量的试剂；优选地，所述检测rabggtb蛋白表达量的试剂中包含与rabggtb特异性结合的抗体。5.一种治疗肌萎缩侧索硬化、保护运动神经元中的产品，所述产品包括表达rabggtb、促进rabggtb表达的生物材料。6.权利要求5所述的产品、rabggtb在治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元中的应用；优选地，所述rabggtb包括表达rabggtb、促进rabggtb表达的生物材料。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肌萎缩侧索硬化包括tdp-43或其片段引起的肌萎缩侧索硬化；优选地，所述肌萎缩侧索硬化是tdp43或其片段引起的肌萎缩侧索硬化。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经元是运动神经元。9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括编码基因、表达盒、重组载体、细胞、蛋白质。10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经元是动物来源的神经元细胞系；优选地，所述动物包括人、鼠；优选地，所述神经元是鼠神经元细胞。

技术总结
本发明属于生物医学领域，具体涉及RABGGTB在治疗TDP-25型肌萎缩侧索硬化中的应用。具体地，提供了表达RABGGTB、促进RABGGTB表达的生物材料在治疗肌萎缩侧索硬化、保护神经元中的应用。元中的应用。元中的应用。


技术研发人员：刘亚玲 李睿 马海阳 白琳 高天初 齐伟静
受保护的技术使用者：河北医科大学第二医院
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2022/3/8