Akt1磷酸化PMS2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用

akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵 巢癌治疗靶点中的应用。


背景技术：

2.目前，卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，其中上皮性卵巢癌约占 85～90％。由于其早期临床症状不明显，且缺少早期诊断方法，大多数确诊时已 属晚期。据报道2014年，美国新发卵巢癌病例为21980例，死亡病例为14270 例，约2/3的新发病例发现时已是figoiii-iv，即已有骨盆外转移。目前卵巢癌 临床治疗金标准是肿瘤细胞减灭术联合以铂为基础的化疗治疗，尽管大多数患 者初次治疗时对化疗反应好，仍有部分患者短期内复发，5年生存率仅不到30％。 目前，早期诊断困难和化疗耐药是影响卵巢癌治疗效果和预后差的主要原因。 因此寻求卵巢癌治疗新靶点、提高卵巢癌疗效，成为当前研究的热点。
3.akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称蛋白激酶b(protien kinase b，pkb)， 含3种异构体akt1，akt2和akt3，也称为pkbα，pkbβ和pkbγ。它们有相同 的结构，但编码于不同的染色体上并且生物学功能差异很大。其中akt1分布组 织广泛且在细胞生长和存活中有重要作用；akt2主要在肌肉和脂肪组织中高表 达，它的作用主要是通过胰岛素调节葡萄糖稳定；akt3表达仅局限在睾丸和脑 组织中。akt可通过磷酸化多种底物调节细胞活动如生长、增殖、抗凋亡损伤、 控制dna损伤应答和基因稳定性、代谢、转移和肿瘤发生。已发现，akt异常 与多种肿瘤相关，如乳腺癌，结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、胰 腺癌、肝细胞癌等。另外，在多种细胞系中发现顺铂作用后akt活化导致顺铂 耐药性增加。活化的akt1可以识别和磷酸化靶蛋白中的共有基序rxrxx(s/t) 发挥相应的生物学下游。
4.dna错配修复(mmr)是从细菌到人类所有物种中一高度保守的维持基因 组稳定性的系统。它的主要功能是在合成dna时，通过特异性链去除错配碱基 和插入/缺失错配以确保复制保真性。mmr基因胚系突变可导致lynch综合征 (ls)发生，一种常染色体显性遗传病，具有发展为其他恶性肿瘤的高风险。 mmr蛋白缺乏可增加个体易癌性，如结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌等。 研究发现mmr影响了多种细胞过程，如dna损伤信号，凋亡，有丝分裂和减 数分裂重组，类别转换重组，体细胞超突变和三联体扩张。pms2是mmr其中 一员，目前研究其失衡与ls，乳腺癌，前列腺癌，鼻咽癌，儿童癌症综合征， 血液系统肿瘤等多种癌症的发生有关。但现有技术中关于验证akt1磷酸化pms2 蛋白能否作为卵巢癌治疗靶点的技术方案尚未见报导。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于验证akt1 磷酸化pms2蛋白能否作为卵巢癌治疗靶点的技术方案尚未见报导。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：前期研究发现卵巢癌中pms2的表达与磷 酸化gsk-3β(p-gsk-3β)呈负相关，免疫共沉淀发现gsk-3β和pms2能 够相互结合，提示gsk-3β可通过磷酸化pms2影响其稳定性，但受限于pms2 磷酸化位点不清楚，国内外没有厂商进行相关研究及相关磷酸化位点的抗体制 备，导致不能进一步证实其确切的作用机制。通过软件
发现，pms2上存在akt1 磷酸化的共有基序rxrxx(s/t)，并且发现活化的akt1(p-akt s473)与pms2 蛋白表达呈负相关，且co-ip发现两者可以直接结合，断定其存在相互作用位 点，结合蛋白结构学，最终选择了pms2156苏氨酸位点，需要后续大量实验验 证。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：通过构建针对pms2156位点苏氨酸的磷酸 化抗体，westernblot检测发现卵巢癌细胞中p-akt1 s473与p-pms2 t156具有 一致性，转染pms2-t156a后，上调akt1活性后p-pms2 t156无明显变化， 表明akt1活化后可以磷酸化pms2156位点苏氨酸，这是首次明确证实akt1 可以磷酸化pms2。mmr蛋白缺乏导致对一些化疗药物耐药，如甲基化药物、 铂化合物和氟嘧啶药物，其中对铂化合物耐药如治疗卵巢癌和子宫内膜癌的卡 铂和顺铂，主要原因是mlh1甲基化导致mmr蛋白缺失，更重要的是既往有 研究证实在乳腺癌中pms2高表达可能是蒽环霉素化疗耐药的生化指标。本发 明首次证实akt1磷酸化pms2156位点的苏氨酸，抑制p-pms2 t156后，肿瘤 细胞恶性表现如迁移、侵袭、克隆形成能力和细胞凋亡抑制明显下降，将pms2 的作用机制进一步阐述，为卵巢癌研究和治疗提供了一个新的方向及靶点。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种akt1磷酸化pms2蛋白在作 为卵巢癌治疗靶点中的应用。
9.本发明是这样实现的，一种akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点 中的应用。
10.本发明的另一目的在于提供一种实施所述akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵 巢癌治疗靶点中的应用的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方 法，所述鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法包括以下步骤：
11.步骤一，通过western blot检测活化akt1和p-pms2关系；
12.步骤二，检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化；
13.步骤三，检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞侵袭能力的变化；
14.步骤四，通过平板克隆法检测转染pms2-t156a后卵巢癌细胞克隆形成能 力的变化；
15.步骤五，通过流式细胞仪及westernblot检测转染pms2-t156a卵巢癌细胞 凋亡的影响。
16.进一步，步骤一中，所述通过westernblot检测活化akt1和p-pms2关系， 包括：
17.(1)通过western blot检测卵巢癌细胞系p-akt s473和p-pms2 t156的表 达情况；
18.(2)通过westernblot检测突变质粒pms2-t156a转染效果；
19.(3)上调akt1活性后，检测p-pms2 t156表达情况。
20.进一步，步骤(1)中，所述通过western blot检测卵巢癌细胞系p-akt s473 和p-pms2 t156的表达情况，包括：
21.通过western blot法检测4种卵巢癌细胞株中p-akt s473和p-pms2 t156 的表达情况，因hela细胞中存在正常的mmr功能和异常活化的akt1而作为阳 性对照。
22.进一步，步骤(2)中，所述通过western blot检测突变质粒pms2-t156a 转染效果，
包括：
23.选取p-pms2 t156高表达的a2780和skov3作为转染对象，通过westernblot验证转染效果。
24.进一步，步骤(3)中，所述上调akt1活性后，检测p-pms2 t156表达情 况，包括：
25.选取a2780和skov3细胞作为实验对象，加入akt1活化剂igf-1上调p-akts473的表达，通过western blot法检测，验证akt1对pms2的作用。
26.进一步，步骤二中，所述检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞迁移能力的 变化，包括：
27.细胞划痕实验转染pms2-t156a后a2780和skov3迁移能力的改变，计 算两细胞系各组划痕间隙融合率，间隙融合率＝(起始时间间隙宽度-终止观察时 间间隙宽度)/起始时间间隙宽度。
28.步骤三中，所述检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞侵袭能力变化，包括：
29.通过transwell检测转染pms2-t156a后a2780和skov3细胞侵袭能力的 改变，计数膜中央部分和周围部分随机视野x100内侵袭细胞的数目。
30.步骤四中，所述通过平板克隆法检测转染pms2-t156a后卵巢癌细胞克隆 形成能力的变化，包括：
31.六孔板细胞培养10～14天后观察，将直径为3.5cm的六孔板分成若干 10mm
×
10mm视野，随机选择4个视野计算细胞克隆数。
32.进一步，步骤五中，所述通过流式细胞仪及western blot检测转染 pms2-t156a卵巢癌细胞凋亡的影响，包括：
33.(1)通过流式细胞仪检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡变化情况；
34.(2)通过western blot检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡相关蛋白表 达情况。
35.进一步，步骤(1)中，所述通过流式细胞仪检测抑制p-pms2 t156卵巢癌 细胞凋亡变化情况，包括：
36.通过annexinv-apc/pi双染色方法检测a2780和skov3细胞中nc组， nc组+cddp，突变组，突变组+cddp各组凋亡变化情况。
37.进一步，步骤(2)中，所述通过western blot检测抑制p-pms2 t156卵巢 癌细胞凋亡相关蛋白表达情况，包括：
38.检测a2780和skov3细胞中nc组，nc组+cddp，突变组，突变组+cddp 各组细胞中相关凋亡蛋白p53、bcl-2及cleaved-caspase3的蛋白表达变化。
39.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明是 国内外首次证实akt1磷酸化pms2的位点，联合公司设计制成pms2 t156的磷 酸化抗体，并且针对该位点设计了质粒，通过实验证实该位点在卵巢癌耐药中 的关键作用，该磷酸化抗体可为后期其他研究提供新的选择，鉴于前期研究证 实在乳腺癌中pms2高表达是蒽环霉素化疗耐药的生化指标，本发明精准的验 证了一个新的作用靶点，可能为后期靶向药物研发提供新的思路，具有很大的 商业价值。本发明提供的akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应 用，发现akt1可以磷酸化pms2156位点的苏氨酸，抑制pms2(t156)后可 降低卵巢癌细胞迁移、侵袭和克隆形成能力，并促进卵巢癌细胞凋亡。本发明 发现活化的akt1可以
磷酸化pms2156位点的苏氨酸，这是成为akt1一个新的 磷酸化作用底物，并且akt1磷酸化pms2后可促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和 克隆形成能力，并降低细胞凋亡，与akt1磷酸化其他作用底物对肿瘤细胞的影 响具有一致性。
40.本发明前期研究发现活化的akt1(p-akt s473)与pms2蛋白表达呈负相关， 且co-ip发现两者可以直接结合。本发明通过构建针对pms2156位点苏氨酸的 磷酸化抗体，western blot检测发现卵巢癌细胞中p-akt1 s473与p-pms2 t156 具有一致性，转染pms2-t156a后，上调akt1活性后p-pms2 t156无明显变化， 表明akt1活化后可以磷酸化pms2156位点苏氨酸，这是首次明确证实akt1可 以磷酸化pms2。
41.本发明通过流式细胞仪和western blot发现抑制p-pms2 t156，细胞凋亡明 显增加，给予顺铂刺激，其凋亡明显高于对照组顺铂刺激，表明pms2156位点 的磷酸化现象对细胞凋亡及顺铂介导的细胞凋亡具有重要意义，提示akt1磷酸 化pms2(t156)可能参与顺铂介导卵巢癌细胞的凋亡，但其对卵巢癌铂类耐药 的影响有待于进一步研究。
42.本发明前期实验发现p-akt s473与pms2蛋白表达呈负相关，pms2可促进 顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡和g2/m期停滞，影响卵巢癌对铂类药物敏感性。结 合本次研究结果p-akt s473和p-pms2 t156表达具有一致性；抑制p-pms2 t156 表达后，顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡明显增加。本发明首次证实akt1磷酸化 pms2156位点的苏氨酸，抑制p-pms2 t156后，肿瘤细胞恶性表现如迁移、侵 袭、克隆形成能力和细胞凋亡抑制明显下降，为卵巢癌研究和治疗提供了一个 新的方向及靶点。
附图说明
43.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所 需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下 还可以根据这些附图获得其他的附图。
44.图1是本发明实施例提供的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶 点的方法流程图。
45.图2是本发明实施例提供的通过western blot检测卵巢癌细胞系p-akts473和p-pms2 t156的表达情况示意图。
46.图3是本发明实施例提供的通过western blot检测突变质粒pms2-t156a 转染效果示意图。
47.图4是本发明实施例提供的上调akt1活性后，检测p-pms2 t156表达情况 的示意图。
48.图5是本发明实施例提供的pms2-t156a转染后a2780和skov3细胞后 划痕融合情况(
×
100)示意图。
49.图6是本发明实施例提供的转染pms2-t156a后a2780和skov3细胞侵 袭能力变化情况(x100)示意图。
50.图7是本发明实施例提供的平板克隆实验检测转染pms2-t156a后卵巢癌 细胞克隆形成能力变化示意图。
51.图8是本发明实施例提供的通过流式细胞仪检测a2780和skov3中nc组， nc组+
cddp，突变组，突变组+cddp各组凋亡变化情况示意图；
52.图中：a2780细胞顺铂40μm作用48h，skov3细胞顺铂30μm作用48h。
53.图9是本发明实施例提供的通过western blot检测nc组，突变组，nc组 +cddp，突变组+cddp中细胞相关凋亡蛋白p53，bcl-2和cleaved-caspase3的 变化示意图；
54.图中：a2780细胞顺铂40μm作用48h，skov3细胞顺铂30μm作用48h。
具体实施方式
55.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
56.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种akt1磷酸化pms2蛋白在作 为卵巢癌治疗靶点中的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
57.如图1所示，本发明实施例提供的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌 治疗靶点的方法包括以下步骤：
58.s101，通过western blot检测活化akt1和p-pms2关系；
59.s102，检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化；
60.s103，检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞侵袭能力的变化；
61.s104，通过平板克隆法检测转染pms2-t156a后卵巢癌细胞克隆形成能力 的变化；
62.s105，通过流式细胞仪及western blot检测转染pms2-t156a卵巢癌细胞凋 亡的影响。
63.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
64.1、本发明存在akt1识别及磷酸化的共有基序yprprgt
156
tvsv，活化的 akt1可能通过磷酸化pms2的共有基序的苏氨酸位点，使pms2蛋白的稳定性下 降；pms2促进顺铂介导的凋亡和细胞周期g2/m期停滞，可能影响卵巢癌细胞对 铂类药物的敏感性，继而参与铂类耐药的发生，有研究证实在乳腺癌中pms2高 表达是蒽环霉素化疗耐药的生化指标，因此，本发明旨在前期研究基础上探讨 akt1磷酸化pms2蛋白及其对卵巢癌细胞生物学功能的影响，为卵巢癌治疗提供 新的理论基础和治疗靶点。
65.2、内容
66.一、western blot检测活化akt1和p-pms2关系。
67.western blot检测卵巢癌细胞系p-akt s473和p-pms2 t156的表达情况， western blot法检测4种卵巢癌细胞株中p-akt s473和p-pms2 t156的表达情 况，因hela细胞中存在正常的mmr功能和异常活化的akt1而作为阳性对照， 结果显示在a2780和skov3细胞株中p-akt s473和p-pms2 t156均高表达， 而在ho8910、es2中两者均低表达。即akt1的活化形式p-akt s473与p-pms2t156表达具有一致性(见图2)。
68.westernblot检测突变质粒pms2-t156a转染效果，选取p-pms2 t156高表 达的a2780，skov3作为转染对象，western blot验证转染效果，结果显示： 转染pms2-t156a后，p-pms2 t156表达明显下调。即，将pms2156位点的苏 氨酸突变为甘氨酸后，p-pms2 t156表达明显下降，说明pms2156位点苏氨酸 存在磷酸化现象(见图3)。
69.上调akt1活性后，p-pms2 t156表达情况，选取a2780和skov3细胞作 为实验对象，
为了验证akt1对pms2的作用，本发明加入akt1活化剂igf-1 上调p-akt s473的表达，运用westernblot法检测，结果显示：nc组和突变组 加入igf-1刺激后p-akt s473表达均明显升高，相应的nc组中p-pms2 t156 表达也升高，而突变组中p-pms2 t156表达无明显变化。即，活化的akt1(p-akts473)可以磷酸化pms2156位点的苏氨酸(见图4)。
70.二、p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化
71.细胞划痕实验转染pms2-t156a后a2780和skov3迁移能力的改变，计 算两细胞系各组划痕间隙融合率，间隙融合率＝(起始时间间隙宽度—终止观察 时间间隙宽度)/起始时间间隙宽度。结果显示：a2780细胞中，突变组间隙融 合率为(39.00
±
6.25)％，明显低于control组(100.00
±
0.00)％和nc组 (96.00
±
5.29)％。同样的，在skov3细胞中，突变组间隙融合率为 (29.33
±
4.16)％，明显低于control组(100.00
±
0.00)％和nc组(86.67
±
10.02)％。 两株细胞中，突变组与对照组相比，差异具有统计学意义(p《0.001)。即，抑 制p-pms2 t156后细胞迁移能力明显下降(见图5)。
72.三、p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞侵袭能力的变化
73.应用transwell检测转染pms2-t156a后a2780和skov3细胞侵袭能力的 改变，计数膜中央部分和周围部分随机视野(x100)内侵袭细胞的数目，结果 显示：在a2780细胞中，control组和nc组平均视野侵袭细胞数分别为 (163.0
±
14.4)和(150.3
±
11.1)个，突变组平均视野侵袭细胞为(53.7
±
9.3)个， 与对照组比较侵袭能力有显著的下降，p《0.001；skov3细胞各组平均视野侵袭 细胞分别为(237.3
±
11.5)、(218.0
±
15.5)、(72.7
±
7.1)个，突变组侵袭能力 有显著的下降，p《0.001。即，抑制p-pms2 t156可明显降低细胞侵袭能力(见 图6)。
74.四、平板克隆法检测转染pms2-t156a后卵巢癌细胞克隆形成能力的变化
75.六孔板细胞培养10～14天后观察，将直径为3.5cm的六孔板分成若干 10mm
×
10mm视野，随机选择4个视野计算细胞克隆数，结果显示：在a2780 细胞中，突变组每100mm2细胞克隆数为(19.00
±
3.16)个，与control组 (76.00
±
6.06)、nc组(74.00
±
5.22)比较细胞克隆数明显下降，p《0.001；在 skov3中，突变组、control组、nc组克隆数分别为(19.50
±
2.38)、(17.25
±
3.40) 和(4.75
±
2.50)个，突变组与对照组相比，克隆数明显减少，p《0.001。表明抑 制p-pms2 t156后可降低细胞克隆形成能力(见图7)。
76.五、流式细胞仪及western blot检测转染pms2-t156a卵巢癌细胞凋亡的 影响
77.流式细胞仪检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡变化情况，应用 annexinv-apc/pi双染色方法检测a2780和skov3细胞中nc组，nc组 +cddp，突变组，突变组+cddp各组凋亡变化情况，结果显示：在a2780细 胞中，突变组凋亡(14.93％)明显高于nc组(8.59％)；顺铂刺激后，nc组 与突变组凋亡明显增加，且突变组凋亡(91.85％)明显高于nc组凋亡(15.27％)， 其中nc组凋亡增加以晚期凋亡为主，而突变组早期和晚期凋亡率均显著上升， 同样的现象发生在skov3细胞中。即抑制p-pms2 t156可促进卵巢癌细胞的凋 亡以及顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡(见图8)。
78.westernblot检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡相关蛋白表达情况，检 测a2780和skov3细胞中nc组，nc组+cddp，突变组，突变组+cddp各 组细胞中相关凋亡蛋白p53、bcl-2及cleaved-caspase3的蛋白表达变化，结果 显示：在a2780和skov3中，突变组cleaved-caspase3蛋白表达明显升高，而 p53、bcl-2无明显变化；顺铂刺激后，nc组和突变
组后促凋亡蛋白p53及 cleaved-caspase3的表达均升高，并且以突变组顺铂刺激升高更明显，同时抗凋 亡bcl-2表达下降，且以突变组下降程度最明显，与流式结果一致(见图9)。
79.卵巢癌是一个多方面的基因复杂性疾病，仍是妇科恶性肿瘤中首要的致死 原因。本次研究中，本发明发现akt1可以磷酸化pms2156位点的苏氨酸，抑制 pms2(t156)后可降低卵巢癌细胞迁移、侵袭和克隆形成能力，并促进卵巢癌 细胞凋亡。
80.akt是在多种组织中表达的癌基因。akt2和akt3虽然重要，但其在人体组织 中分布局限。akt1基因位于染色体14q32.32-q32.33，其dna序列包含1440个碱 基对，编码480个氨基酸。akt1激酶包含3个保守区域：ph区，上游调控基因和 akt1膜定位识别区：cat区和ext区(富含脯氨酸和一个包含保守序列fpqfsy 的疏水序列)。akt1在pi3k信号传导通路中是关键的效应器，是细胞存活和凋亡 抑制所必须的，已发现在多种肿瘤和侵袭性乳腺癌、食管癌和肝细胞癌中其表 达增加。在乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌发现akt1激酶活性异常升高。akt可通过 磷酸化eif4e，bad，procaspase-9，ikk，gsk3β，mtor，foxo家族等作用底 物调节细胞活动如生长、增殖、抗凋亡损伤、控制dna损伤应答和基因稳定性、 代谢、转移和肿瘤发生。本次研究中，本发明发现活化的akt1可以磷酸化pms2 156位点的苏氨酸，这是成为akt1一个新的磷酸化作用底物，并且akt1磷酸化 pms2后可促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力，并降低细胞凋亡，与 akt1磷酸化其他作用底物对肿瘤细胞的影响具有一致性。
81.mmr是维持基因稳定性中重要的dna修复过程。mmr缺失可通过增加基 因突变频率，细胞周期阻滞消失，应对dna的损失减少凋亡导致癌症发生。mmr 基因有7种msh2，mlh1，msh3，msh6，mlh3，pms1和pms2。mmr系统 紊乱和多种癌症相关，其中pms2缺失与lynch综合征，乳腺癌、前列腺癌、鼻 咽癌、儿童癌症综合征、宫颈癌和血液系统肿瘤等发生有关。最近，有研究表 明在自身免疫性疾病中发现抗pms2抗体。han等人研究发现卵巢癌中pms2的表 达与磷酸化gsk-3β(p-gsk-3β)呈负相关，免疫共沉淀发现gsk-3β和pms2能 够相互结合，提示gsk-3β可能通过磷酸化pms2影响其稳定性，但结果有待于进 一步证实。通过软件发现，pms2上存在akt1磷酸化的共有基序rxrxx(s/t)， 本发明前期研究发现活化的akt1(p-akt s473)与pms2蛋白表达呈负相关，且 co-ip发现两者可以直接结合。本发明通过构建针对pms2156位点苏氨酸的磷酸 化抗体，western blot检测发现卵巢癌细胞中p-akt1 s473与p-pms2 t156具有一 致性，转染pms2-t156a后，上调akt1活性后p-pms2 t156无明显变化，表明akt1 活化后可以磷酸化pms2156位点苏氨酸，这是首次明确证实akt1可以磷酸化 pms2。
82.有研究表明，akt1活化可调节顺铂耐药性。体外实验中，akt1活化促进细 胞存活、灭活抑制凋亡，通过依赖/非依赖caspase机制调节卵巢癌顺铂敏感性。 mmr蛋白缺乏导致对一些化疗药物耐药，如甲基化药物、铂化合物和氟嘧啶药 物，其中对铂化合物耐药如治疗卵巢癌和子宫内膜癌的卡铂和顺铂，主要原因 是mlh1甲基化导致mmr蛋白缺失。yong h.等人发现在乳腺癌中pms2高表达 可能是蒽环霉素化疗耐药的生化指标。本实验中，本发明通过流式细胞仪和 western blot发现抑制p-pms2 t156，细胞凋亡明显增加，给予顺铂刺激，其凋亡 明显高于对照组顺铂刺激，表明pms2156位点的磷酸化现象对细胞凋亡及顺铂 介导的细胞凋亡具有重要意义，提示akt1磷酸化pms2(t156)可能参与顺铂介 导卵巢癌细胞的凋亡，但其对卵巢癌铂类耐药的影响有待于进一步研究。
83.目前研究中发现，mmr缺失原因仅限于主要胚系突变、启动子 甲基化和两种因素共同作用所致。本发明前期实验发现p-akt s473与 pms2蛋白表达呈负相关，pms2可促进顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡和 g2/m期停滞，影响卵巢癌对铂类药物敏感性。结合本次研究结果 p-akt s473和p-pms2 t156表达具有一致性；抑制p-pms2 t156表达后， 顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡明显增加。那么是不是可能存在这样一条 机制：活化的akt1磷酸化pms2，使pms2稳定性下降，表达减少，继 而参与卵巢癌发生发展和铂类耐药这些问题将有待于进一步研究。
84.本发明首次证实akt1磷酸化pms2156位点的苏氨酸，抑制p-pms2 t156后， 肿瘤细胞恶性表现如迁移、侵袭、克隆形成能力和细胞凋亡抑制明显下降，为 卵巢癌研究和治疗提供了一个新的方向及靶点。
85.具体实施例见附图，以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的 保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术 范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用。2.一种实施如权利要求1所述的akt1磷酸化pms2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，所述鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法包括以下步骤：步骤一，通过western blot检测活化akt1和p-pms2关系；步骤二，检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化；步骤三，检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞侵袭能力的变化；步骤四，通过平板克隆法检测转染pms2-t156a后卵巢癌细胞克隆形成能力的变化；步骤五，通过流式细胞仪及westernblot检测转染pms2-t156a卵巢癌细胞凋亡的影响。3.如权利要求2所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤一中，所述通过westernblot检测活化akt1和p-pms2关系，包括：(1)通过western blot检测卵巢癌细胞系p-akt s473和p-pms2 t156的表达情况；(2)通过westernblot检测突变质粒pms2-t156a转染效果；(3)上调akt1活性后，检测p-pms2 t156表达情况。4.如权利要求3所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述通过western blot检测卵巢癌细胞系p-akt s473和p-pms2 t156的表达情况，包括：通过western blot法检测4种卵巢癌细胞株中p-akt s473和p-pms2 t156的表达情况，因hela细胞中存在正常的mmr功能和异常活化的akt1而作为阳性对照。5.如权利要求3所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述通过western blot检测突变质粒pms2-t156a转染效果，包括：选取p-pms2 t156高表达的a2780和skov3作为转染对象，通过western blot验证转染效果。6.如权利要求3所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述上调akt1活性后，检测p-pms2 t156表达情况，包括：选取a2780和skov3细胞作为实验对象，加入akt1活化剂igf-1上调p-akt s473的表达，通过western blot法检测，验证akt1对pms2的作用。7.如权利要求2所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤二中，所述检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化，包括：细胞划痕实验转染pms2-t156a后a2780和skov3迁移能力的改变，计算两细胞系各组划痕间隙融合率，间隙融合率＝(起始时间间隙宽度-终止观察时间间隙宽度)/起始时间间隙宽度；步骤三中，所述检测p-pms2 t156下调后卵巢癌细胞侵袭能力变化，包括：通过transwell检测转染pms2-t156a后a2780和skov3细胞侵袭能力的改变，计数膜中央部分和周围部分随机视野x100内侵袭细胞的数目；步骤四中，所述通过平板克隆法检测转染pms2-t156a后卵巢癌细胞克隆形成能力的变化，包括：六孔板细胞培养10～14天后观察，将直径为3.5cm的六孔板分成若干10mm
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10mm视野，随机选择4个视野计算细胞克隆数。
8.如权利要求2所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤五中，所述通过流式细胞仪及western blot检测转染pms2-t156a卵巢癌细胞凋亡的影响，包括：(1)通过流式细胞仪检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡变化情况；(2)通过western blot检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡相关蛋白表达情况。9.如权利要求8所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述通过流式细胞仪检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡变化情况，包括：通过annexinv-apc/pi双染色方法检测a2780和skov3细胞中nc组，nc组+cddp，突变组，突变组+cddp各组凋亡变化情况。10.如权利要求8所述的鉴定akt1磷酸化pms2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述通过western blot检测抑制p-pms2 t156卵巢癌细胞凋亡相关蛋白表达情况，包括：检测a2780和skov3细胞中nc组，nc组+cddp，突变组，突变组+cddp各组细胞中相关凋亡蛋白p53、bcl-2及cleaved-caspase3的蛋白表达变化。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种Akt1磷酸化PMS2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用，所述鉴定Akt1磷酸化PMS2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法包括：通过Western Blot检测活化Akt1和p-PMS2关系；检测p-PMS2 T156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化；检测p-PMS2 T156下调后卵巢癌细胞侵袭能力的变化；通过平板克隆法检测转染PMS2-T156A后卵巢癌细胞克隆形成能力的变化；通过流式细胞仪及Western Blot检测转染PMS2-T156A卵巢癌细胞凋亡的影响。本发明首次证实Akt1磷酸化PMS2 156位点的苏氨酸，为卵巢癌研究和治疗提供一个新的方向及靶点。为卵巢癌研究和治疗提供一个新的方向及靶点。为卵巢癌研究和治疗提供一个新的方向及靶点。


技术研发人员：高芳芳
受保护的技术使用者：郑州大学第三附属医院（河南省妇幼保健院）
技术研发日：2021.12.01
技术公布日：2022/3/8