猪细小病毒中和性单克隆抗体及制备方法和应用

1.本发明涉及一种猪细小病毒中和性单克隆抗体及应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.猪细小病毒(porcine parvovirus,ppv)是导致猪繁殖失败的主要病原体之一，1965年首次在德国发现，临床上以怀孕母猪发生死胎、木乃伊胎、胚胎死亡和发情延迟等为主要特征，给全世界的养猪业造成了相当大的经济损失。近年来，由于与猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,pcv2)等其他病毒的混合感染，ppv受到了广泛关注，被认为是导致母猪繁殖失败最常见的感染因子之一。
3.ppv属于细小病毒属、细小病毒科，是一种单链、无囊膜的二十面体dna病毒，直径为18～26nm。ppv基因组全长5000bp左右，主要包含两个开放阅读框(open reading frames,orf)，其中orf1编码非结构蛋白ns1、ns2和ns3，主要参与病毒dna复制、调控基因的表达；orf2编码病毒结构蛋白vp1、vp2和vp3，在病毒组装和感染过程中发挥重要作用，与病毒的附着、进入、定位和自组装密切相关。ppv病毒的衣壳中结构蛋白vp1和vp2的比例约为1:20。vp1蛋白包括整个vp2序列和n端的150个氨基酸，是ppv衣壳的次要组成蛋白。vp2蛋白是其主要的衣壳蛋白，在体外可自组装成病毒样颗粒(viral-like particles,vlp)，包含ppv的血凝(hemagglutination,ha)活性位点和多个病毒中和性抗原位点，可诱导病毒中和性免疫应答。
4.本研究采用大肠杆菌重组表达的ppv vp2蛋白免疫balb/c小鼠，通过杂交瘤融合和亚克隆筛选技术，制备一株具有中和ppv感染活性的单克隆抗体，对单克隆抗体的特异性、灵敏性和中和效价进行鉴定，并对基于该单抗的ppv免疫层析快速检测试纸进行研究，为ppv病毒免疫诊断试剂的研发打下基础。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种猪细小病毒中和性单克隆抗体及应用。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.一种抗猪细小病毒的中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株5f7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202180，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月19日。
8.所述的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。
9.所述单克隆抗体为单克隆抗体5f7。
10.所述单克隆抗体5f7的轻链为kappa，重链为igg2a。
11.所述的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)动物免疫
13.免疫原制备：将250μl纯化后的ppv vp2蛋白分别与等体积的弗氏完全佐剂、弗氏
不完全佐剂混合后乳化，制备得到两种ppv vlp免疫原，备用；
14.balb/c免疫程序：将5只balb/c小鼠分为两组，第1组3只，免疫ppv vlp抗原；第2组2只，免疫pbs作为阴性对照；共免疫3次，每次100μl，每隔2周对小鼠进行皮下多点免疫；初次免疫使用与弗氏完全佐剂制备的ppv vlp抗原，二免和三免采用弗氏不完全佐剂制备的ppv vlp抗原；第三次免疫后14d，对小鼠进行尾静脉采血，利用血凝抑制试验对血清中的ppv特异性抗体进行测定；
15.(2)细胞融合
16.选择第1组中抗体效价最高的小鼠进行加强免疫，在融合前3d腹腔注射50μl不含佐剂的ppv vp2蛋白，融合当天小鼠眼球放血后进行脱颈，无菌条件下研磨脾脏，制备脾细胞悬液；采用杂交瘤融合技术，进行杂交瘤细胞的融合；于37℃、5％co2培养箱中培养7～10d；
17.(3)杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
18.细胞板底部出现肉眼可观察到的明显细胞团时，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验检测细胞上清；利用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行2～3次亚克隆，获得单克隆细胞株；
19.(4)检测单克隆抗体的elsia效价和中和抗体效价，并对单克隆细胞株亚型鉴定，得到单克隆抗体5f7。
20.所述的单克隆抗体在制备猪细小病毒检测elsia试剂盒中的应用。
21.所述的单克隆抗体在制备猪细小病毒检测试纸中的应用。
22.本发明有益效果：
23.本发明将纯化的ppv vp2蛋白与弗氏佐剂乳化后制备ppv vlp疫苗免疫balb/c小鼠，经3次免疫后，可诱导小鼠产生高滴度的针对ppv vp2蛋白和hi抗体，抗体滴度均到2
16
。经ipma法进行杂交瘤细胞的筛选，成功鉴定出一株具有中和活性的ppv单抗5f7，抗体的中和效价可达1∶2048，且该中和性单克隆抗体与其它猪源病毒，如pcv2、prsv、csfv不发生交叉反应，表明本发明的这株单抗具有良好的特异性。
24.本发明成功筛选出一株具有中和作用和良好特异性的单克隆抗体，可用于ppv病毒检测试纸，能快速、方便、直观的进行检测。
25.本发明的单克隆抗体5f7可用于免疫检测试剂开发，为ppv免疫检测试剂盒和特异性抗体免疫评价试剂盒的开发提供生物材料，也为ppv病毒的结构和抗病毒抗体分子机制的深入研究奠定了基础。
附图说明
26.图1为纯化的ppv vp2蛋白的鉴定结果图；
27.其中，a：sds-page鉴定；b：ha检测；
28.图2为筛选到的单抗5f7和11b3与ppv发生特异性反应的结果图；
29.其中，a：5f7单抗；b：11b3；c：阴性对照；
30.图3为ppv单克隆抗体的western blot鉴定结果图；
31.其中，a：5f7单抗；b：11b3；c：his单抗；
32.图4为ppv单克隆抗体亚型鉴定结果图。
33.图5为ppv单克隆抗体的elisa检测结果图；
34.其中，a：vp2蛋白为包被原；b：ppv病毒为包被原；
35.图6为ppv单克隆抗体中和效价的测定结果图；
36.图7为ppv单克隆抗体的交叉性检测结果图；
37.图8为试纸条结构示意图；
38.其中，1为支撑板，2为硝酸纤维素膜，3为样品垫，4为金标抗体垫，5为吸水纸，6为检测线t，7为质控线c；
39.图9为试纸条检测结果示意图。
具体实施方式
40.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
41.本发明所用的主要实验材料：
42.1、细胞、毒种和实验动物
43.sp2/0、pk15、mac145细胞，ppv病毒、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、由河南省农业科学院动物免疫学重点实验保存。其中sp2/0细胞用于细胞融合；pk15细胞用于ppv、csfv、pcv2病毒的增殖；mac145细胞用于prrsv病毒的增殖。实验动物balb/c雌性小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心，6～8周龄小鼠用于疫苗免疫，经产母鼠用于单克隆抗体腹水的制备。
44.2、主要试剂
45.小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗his单抗购自proteintech公司；hrp标记的羊抗鼠igg、hrp标记的羊抗猪igg购自jackson immuno research公司；dmem培养基、fbs胎牛血清购自gibco公司；ht、hat培养基、融合剂peg1500、弗氏佐剂购自sigma公司；protein g、ni柱、superdex 200 10/300gl层析柱购自ge公司。
46.实施例1 ppv vp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
47.1、动物免疫
48.抗原来源：由本实验构建、表达和纯化的ppv vp2蛋白作为免疫原。
49.ppv vp2蛋白的纯化结果：sds-page的结果表明，经ni柱子和superdex 200 10/300gl纯化后的vp2蛋白纯度可达到80％(图1a)。纯化的vp2蛋白具有较高的ha活性，ha滴度可达2
14
(图1b)。
50.免疫原的制备：将纯化后的ppv vp2蛋白(250μl)与等量的弗氏佐剂(250μl)混合后乳化，制备ppv vlp。每毫升该疫苗中含有vp2抗原的ha滴度为2
13
。
51.balb/c免疫程序：随机将5只balb/c小鼠分为两组，第1组3只，免疫ppv vlp抗原；第2组2只，免疫pbs作为阴性对照。共免疫三次，每次100μl，每隔2周对小鼠进行皮下多点免疫。初次免疫使用与弗氏完全佐剂制备的ppv vlp抗原，二免和三免采用弗氏不完全佐剂制备的ppv vlp抗原。三免后14d，即初次免疫后的第56d，对小鼠进行尾静脉采血，利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)和血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,hi)对血清中的ppv抗体进行测定。
52.结果如表1所示，ppv vlp抗原可刺激小鼠产生高滴度的、特异性的针对ppv vp2蛋白和hi抗体，抗体滴度最高可达2
16
，明显高于阴性组，表明ppv vlp疫苗可诱导balb/c小鼠
产生强烈的抗体免疫应答。
53.表1免疫小鼠血清效价结果
[0054][0055]
2、细胞融合
[0056]
选择抗体效价最高的小鼠进行加强免疫，在融合前3d腹腔注射50μl不含佐剂的ppv vp2蛋白(25μg)，进行杂交瘤细胞的融合。
[0057]
融合当天，小鼠眼球放血后进行脱颈，无菌条件下研磨脾脏，制备脾细胞悬液。采用经典的杂交瘤融合技术，利用融合剂peg1500，按照体积比为5:1的比例将制备好的脾细胞与状态良好的sp2/0细胞进行融合，hat选择培养基稀释融合后的杂交瘤细胞后铺至96孔板中，300μl/孔，共20板。37℃、5％co2培养箱中培养7～10d。
[0058]
3、杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
[0059]
细胞板底部出现肉眼可观察到的明显细胞团时，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,ipma)对细胞上清进行检测。将ipma筛选的阳性杂交瘤细胞，利用有限稀释法进行2～3次亚克隆，获得单细胞株。
[0060]
ipma法筛选阳性克隆：将pk15细胞以6
×
105/孔的密度接种于96孔板，按照1％(wt)的比例接种ppv病毒，每孔250μl，37℃、5％co2培养箱培养72h。pbs洗板3次，室温下用4％(wt)多聚甲醛固定10min，弃掉固定液，用含有5％(wt)脱脂牛奶pbst对板子进行4℃封闭过夜。以培养7～10d的杂交瘤培养上清作为一抗，37℃、30min。pbst洗涤6次，以hrp标记的羊抗鼠igg作为二抗，37℃、45min。pbst洗涤6次，最后一次用ddh2o洗，每孔加入100μl aec显色液，室温显色10min，弃掉显色液后加入ddh2o终止显色，200μl/孔。倒置显微镜下观察，阳性孔出现特异性染色(红色)，阴性孔无染色。
[0061]
筛选到的2株具有中和活性的单抗5f7和11b3与ppv发生特异性反应，结果如图2所示。
[0062]
4、单克隆抗体腹水的制备
[0063]
将鉴定为阳性的单细胞株扩大培养，调整细胞浓度为0.5
×
107/ml～1.0
×
107/ml左右，以500μl的剂量腹腔注射石蜡预处理的经产balb/c母鼠，7d后小鼠腹部出现明显的肿胀时即可进行腹水采集。使用ge protein g亲和层析柱对收集的腹水进行纯化。
[0064]
5、western blot检测
[0065]
以杂交瘤上清为一抗，检测5f7和11b3抗体与大肠杆菌表达的ppv vp2的反应性。将纯化的vp2蛋白经sds-page电泳后进行wb分析。pvdf膜用含有5％脱脂牛奶的pbst缓冲液在4℃条件下进行过夜封闭。pbst洗膜6次，以杂交瘤细胞上清作为一抗，37℃、30min。pbst洗膜6次，以hrp标记的羊抗鼠igg抗体为二抗，37℃、45min。pbst洗膜6次，进行aec显色。结果如图3所示，与his单抗阳性对照相比，两株中和性单抗与变性的重组vp2蛋白不反应，表明vp2蛋白空间结构的完整性可能会影响抗体与蛋白的结合。
[0066]
6、单克隆抗体亚型鉴定
[0067]
按照proteintech公司小鼠单克隆亚型鉴定试剂盒说明书，对本发明筛选出的单克隆抗体进行亚型的鉴定。结果表明，单克隆抗体5f7和11b3分属于两种不同的抗体亚型，其中5f7的重链为igg2a，11b3的重链为igg2b，轻链均为kappa(图4)。
[0068]
杂交瘤细胞株5f7已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202180，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月19日。
[0069]
实施例2单克隆抗体的elisa检测
[0070]
采用间接elisa分析中和性单抗5f7和11b3与ppv vp2蛋白和ppv病毒的反应性。以纯化的ppv vp2蛋白、ppv病毒为抗原进行包板、封闭后进行elisa效价的测定。以稀释的杂交瘤细胞上清液或腹水为一抗，hrp标记的羊抗鼠igg抗体为二抗进行检测，加入tmb溶液进行显色，加入等体积的2m h2so4终止反应。每个样品三次重复，测定od
450 nm
处的吸光值进行抗体效价的测定。
[0071]
结果如图5所示，两株单克隆抗体均与ppv和重组vp2蛋白特异性结合，单克隆抗体11b3腹水与ppv的结合效价可达1∶10240(图5b)。中和性单抗5f7的杂交瘤上清稀释至1:6400时，仍然可以与ppv vp2蛋白特异性结合，单抗5f7腹水的抗体效价可达1:4096,000(表2)。
[0072]
表2单抗细胞上清与腹水效价
[0073]
单抗杂交瘤上清腹水5f71:64001:4096,00011b31:64001:4096,000
[0074]
实施例3单克隆抗体的病毒中和(virus neutralization,vn)试验
[0075]
将杂交瘤细胞上清或纯化的腹水与200tcid
50
的ppv在37℃条件下孵育1h，然后将混合物加入到含有pk15细胞(6
×
105/孔)的96孔细胞板中，37℃、5％co2培养箱中继续培养72h。pbs洗板3次，室温下用4％(wt)多聚甲醛固定10min，弃掉固定液，用含有5％(m/v)脱脂牛奶的pbst缓冲液进行4℃封闭过夜。以抗ppv病毒的猪多克隆为一抗，37℃、30min。pbst洗板6次。以hrp标记的羊抗猪igg抗体为二抗，37℃、30min。pbst洗板6次，最后一次用ddh2o洗，aec室温显色10min。显微镜下观察细胞显色，无特异性染色时，说明抗体具有中和作用，以杂交瘤克隆上清或腹水完全中和ppv病毒的最高稀释倍数作为最终的vn抗体效价。
[0076]
结果如图6所示，单克隆抗体5f7和11b3的中和效价分别可达到1∶2048和1∶1024。
[0077]
实施例4单克隆抗体的病毒检测
[0078]
分别以ppv、prsv、csfv、pcv2病毒为抗原进行包被elsia板，对单克隆抗体的特异性进行鉴定。以稀释的杂交瘤细胞上清液为一抗，hrp标记的羊抗鼠igg抗体为二抗进行检测，加入tmb溶液进行显色，加入等体积的2m h2so4终止反应。每个样品三次重复，测定od
450nm
处的吸光值，进行结果的分析。结果如图7所示，中和性单抗5f7只与ppv病毒反应，与pcv2、prsv、csfv等病毒均不反应，表明本发明筛选的中和性单细胞株具有良好的特异性。
[0079]
实施例5单克隆抗体5f7在ppv病毒检测试纸中的应用
[0080]
1.胶体金溶液的制备
[0081]
采用柠檬酸三钠法制备胶体金，方法如下：取99ml双蒸水放入200ml三角瓶中，在加热磁力搅拌器上加热并持续搅拌，加入1ml 1％(wt)的氯金酸，加热搅拌至沸腾，然后快速加入1.6ml 1％(wt)的柠檬酸三钠，持续加热搅拌，观察颜色由浅黄色逐渐变为深红色后
继续加热搅拌5min。停止加热，待三角瓶冷却，恢复室温后用无菌双蒸水定容至100ml，使用紫外扫描确定最大吸收峰波长为530nm，4℃保存待用。
[0082]
2.胶体金标记抗体的制备
[0083]
将抗ppv的单抗5f7作为金标抗体，其最佳结合ph值为7.0，胶体金和抗体的配比为每毫升胶体金加入30ug抗体。标记胶体金经1％(wt)人血清白蛋白(hsa)稳定剂处理，按每平方厘米60ul的量取标记物溶液均匀吸附于玻璃纤维膜上，37℃真空干燥1小时，得到金标抗体垫。
[0084]
3.硝酸纤维素膜的制备
[0085]
将抗ppv多克隆抗体喷到硝酸纤维素膜上，作为试纸的检测线(t线)，将金黄色葡萄球菌a蛋白(staphylococcal protein a，spa)作为试纸的质控线(c线)。质控线和检测线在湿度《30％，温度37℃烘箱中晾干10小时，备用。
[0086]
4.在支撑板(尺寸为60*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为18*300mm，玻璃纤维棉材质，先经50mm、ph8.0的tris-hcl缓冲液浸渍处理2h)、金标抗体垫(尺寸为7*300mm，玻璃纤维棉材质)、硝酸纤维素膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为16*300mm)得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
[0087]
试纸条的结构如图8所示。
[0088]
5.使用方法
[0089]
本发明为检测ppv病毒的胶体金试纸条，在使用时，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，加样窗和显示孔，加样窗对应于所述的检测ppv胶体金试纸条样品垫。
[0090]
其检测结果判定方法：
[0091]
将待检测的样品加到样品垫上，若待测物中含有ppv抗原，则在上行过程中与试纸条上胶体金标记的抗ppv单克隆抗体结合，形成相应免疫复合物，免疫复合物继续上行与被包被在硝酸纤维膜上检测线处的抗ppv多克隆抗体结合，并被拦截在检测线处，形成红色指示线，即检测线t线。无论是否含有ppv抗原，胶体金标记的单克隆抗体在上行过程中都将与包被在硝酸纤维膜上质控线处膜上的spa结合并拦截，在质控线处形成红色条带。此条带即为质控线，若此线不出现，说明胶体金试纸条失效。
[0092]
如图9所示，出现两条结合线，检测线t和质控线c显示红色表示样品中有ppv抗原，检测结果为阳性；仅质控线c显色，t不显色，表示样品中没有ppv，判定结果为阴性；若c条带位置不显色，无论t线是否显色，都表示试剂条无效，检测结果无法判断。
[0093]
上面结合实施例对本发明作了详细的说明，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，可以对上述实施例中的各个具体参数进行调整，形成多个具体实施例，均为本发明的变化范围，在此不再一一详述。

技术特征：
1.一种抗猪细小病毒的中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株5f7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202180，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月19日。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为单克隆抗体5f7。4.如权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体5f7的轻链为kappa，重链为igg2a。5.如权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)动物免疫免疫原制备：将250μl纯化后的ppv vp2蛋白分别与等体积的弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂混合后乳化，制备得到两种ppv vlp免疫原，备用；balb/c免疫程序：将5只balb/c小鼠分为两组，第1组3只，免疫ppv vlp抗原；第2组2只，免疫pbs作为阴性对照；共免疫3次，每次100μl，每隔2周对小鼠进行皮下多点免疫；初次免疫使用与弗氏完全佐剂制备的ppv vlp抗原，二免和三免采用弗氏不完全佐剂制备的ppv vlp抗原；第三次免疫后14d，对小鼠进行尾静脉采血，利用血凝抑制试验对血清中的ppv特异性抗体进行测定；(2)细胞融合选择第1组中抗体效价最高的小鼠进行加强免疫，在融合前3d腹腔注射50μl不含佐剂的ppv vp2蛋白，融合当天小鼠眼球放血后进行脱颈，无菌条件下研磨脾脏，制备脾细胞悬液；采用杂交瘤融合技术，进行杂交瘤细胞的融合；于37℃、5％co2培养箱中培养7～10d；(3)杂交瘤细胞的筛选和亚克隆细胞板底部出现肉眼可观察到的明显细胞团时，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验检测细胞上清；利用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行2～3次亚克隆，获得单克隆细胞株；(4)检测单克隆抗体的elsia效价和中和抗体效价，并对单克隆细胞株亚型鉴定，得到单克隆抗体5f7。6.如权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体在制备猪细小病毒检测elsia试剂盒中的应用。7.如权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体在制备猪细小病毒检测试纸中的应用。

技术总结
本发明提供一种猪细小病毒中和性单克隆抗体及应用。将纯化的PPV VP2蛋白与弗氏佐剂乳化后制备PPV VLP疫苗免疫BALB/c小鼠，经3次免疫后，可诱导小鼠产生高滴度的针对PPV VP2蛋白和HI抗体，抗体滴度均到2


技术研发人员：刘运超 张改平 王聚财 尚延丽 杨苏珍 魏蔷 陈玉梅 王方雨 金前跃
受保护的技术使用者：河南省农业科学院动物免疫学重点实验室
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8