复合氮源及其制备方法及用其制备微生物发酵培养基的用途与流程
：
1.本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种复合氮源及其制备方法及用其制备微生物发酵培养基的用途。
背景技术：
2.微生物在发酵过程中利用大量氮源来生长菌体，常见的氮源有酵母粉、玉米浆、玉米浆水解液、豆粕水解液、棉粕水解液等；其中，酵母粉的特点为：蛋白含量高，但细菌类微生物不能利用蛋白，又因其价格昂贵，发酵成本高，不适合作为大量氮源使用，仅可提供维生素等物质；玉米浆、玉米浆水解液、豆粕水解液、棉粕水解液等，这些氮源虽然价格便宜，工艺简单易制得，但因其营养指标受原料影响大，因此在使用这些氮源时发酵指标通常受影响而波动。
3.另外，目前氨基酸、有机酸、核苷等发酵完毕后，第一步分离时将用于发酵的微生物分离出来。微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、酵母菌(saccharomycetes)等，目前这些菌体的处理方式是将菌体制成微生物菌体蛋白，蛋白质含量可达50％，可以作为饲料添加剂，但是微生物菌体蛋白的风味差，添加到饲料中导致动物食欲不振；并且在制作菌体蛋白过程中会产生大量的废气，对环境污染严重。
4.处理微生物菌体另一种方式是，将微生物菌体用浓硫酸水解，将菌体中的蛋白质水解为氨基酸，可以用在氨基酸、核苷酸、有机酸发酵中，用于替代豆粕水解液。但从目前的水解方式来看，都是单一微生物菌体制作氨基酸营养物，其优势是废弃的菌体得到了重复利用，但还没有专门针对氨基酸、核苷、有机酸等发酵制作复合配方，其营养相对单一，对细菌的发酵促进效果有限。
技术实现要素：
5.本发明的第一个目的在于提供一种废弃菌体得到重复利用的、无污染物排放的、能够促进微生物发酵生长和产酸的、原料成本更低的复合氮源的制备方法。
6.本发明的第二个目的在于提供一种能够促进微生物发酵生长和产酸的、原料成本更低的复合氮源。
7.本发明的第三个目的在于提供一种能够明显提高发酵液中产酸量的、发酵过程中葡萄糖转化率更高的利用所述复合氮源制备微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加的用途。
8.本发明的第一个目的由如下技术方案实施：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
9.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到大肠杆
菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按比例混合制备得到酵母菌混合液；
10.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：取大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液；取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液；
11.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液；取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液；
12.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
13.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按比例混合制备得到复合氮源成品。
14.进一步的，所述步骤(1)中，大肠杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-5:1；谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-3:1；枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5：1；酵母菌截留液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5:1。
15.进一步的，所述步骤(2)中，大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；
16.谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；
17.枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；
18.酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解。
19.进一步的，所述步骤(2)中，大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；
20.谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至
70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；
21.枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；
22.酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解。
23.进一步的，所述步骤(3)中，混合液加碱水解制备碱水解液的具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；
24.谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；
25.枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；
26.酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解。
27.进一步的，所述步骤(4)中，大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合。
28.进一步的，所述步骤(5)中，大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液的质量比为：2:1:1:3。
29.本发明的第二个目的由如下技术方案实施：利用所述的复合氮源的制备方法制备得到的复合氮源。
30.本发明的第三个目的由如下技术方案实施：利用所述复合氮源制备微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加的用途。
31.具体的，利用所述复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，豆粕水解液5g/l，菌体蛋白水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。
32.本发明的优点：
33.1、本发明通过将玉米稀浆分别与发酵后的截流液：大肠杆菌截流液、谷氨酸棒杆菌截流液、枯草芽孢杆菌截流液和酵母菌截留液按比例混合，分别经过酸水解及碱水解后再按一定比例复配得到复合氮源成品，其中包含多种氨基酸，供菌体利用，可以对氨基酸、
核苷、有机酸有针对性的调配，更适合微生物发酵生长和产酸。
34.2、发酵后的截流液：大肠杆菌截流液、谷氨酸棒杆菌截流液、枯草芽孢杆菌截流液和酵母菌截留液，无需经脱水干燥处理，直接与玉米稀浆复配后，用浓硫酸及氢氧化钠水解后复配，整个工艺过程简化了提取过程中截流液的后续处理步骤，节省了后续处理的设备投入，同时处理过程无污染环境的气体产生，更加安全环保。
35.3、利用本发明复合氮源制备的微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加，较利用豆粕水解液或菌体蛋白水解液制备的微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加，发酵后产酸水平和葡萄糖转化率均显著提高。
36.4、本发明将玉米稀浆与多种发酵后截流液混合后水解复配制备的复合氮源，应用在发酵培养基中或充当营养液在发酵过程流加，以替代高成本的豆粕水解液，在提升发酵产量的同时降低了发酵成本，从而达到增产增效的目的。
具体实施方式：
37.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
38.以下实施例中的大肠杆菌截流液是以大肠杆菌(escherichia coli)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液；
39.谷氨酸棒杆菌截流液是以谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液；
40.枯草芽孢杆菌截流液是以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液；
41.酵母菌截流液是以酵母菌(saccharomycetes)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液。
42.实施例1：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
43.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1.2:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1.5:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比1.5:1比例混合制备得到酵母菌混合液；
44.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
45.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
46.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
47.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
48.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表1。
49.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
50.取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
51.取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
52.取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解。大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果见表2。
53.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
54.酸水解得到氨基酸为未消旋的(l型)氨基酸，在发酵过程中均能够被细菌利用，但在水解过程中色氨酸被沸酸完全破坏，因此硫酸水解液中缺少了色氨酸(见表1氨基酸检测数据)，而碱水解得到的氨基酸多为消旋型(d型)氨基酸，在发酵过程中未见显著促进效果，但在碱水解过程中色氨酸并未被破坏(见表2氨基酸检测数据)。
55.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
56.表1：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
57.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌9.65.591.79.811.51.85.48.46.42.93.54.12.41.71.107.9酵母菌4.75.612.70.913.45.69.15.27.93.14.744.32.21.4401.7芽孢杆菌104.89.61.414.99.22.44.37.55.61.73.44.73.12.33.106.4谷棒杆菌7.26.19.11.11310.34.24.47.14.13.14.24.23.12.33.504.4
58.表2：大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果
59.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌2.61.52.002.81.50.81.43.41.10.91.52.11.11.70.36.62.9酵母菌1.72.62.703.42.63.13.24.92.12.72.43.33.21.41.411.51.7芽孢杆菌3.11.82.604.91.21.42.32.52.60.71.41.72.12.31.18.63.4谷棒杆菌2.22.13.104.03.31.21.43.11.11.12.22.22.11.31.58.12.4
60.实施例2：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
61.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比2:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比2:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到酵母菌混合液；
62.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
63.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解；
64.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解；
65.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解；
66.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表1。
67.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
68.取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
69.取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
70.取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解。大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果见表2。
71.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
72.酸水解得到氨基酸为未消旋的(l型)氨基酸，在发酵过程中均能够被细菌利用，但在水解过程中色氨酸被沸酸完全破坏，因此硫酸水解液中缺少了色氨酸(见表3氨基酸检测数据)，而碱水解得到的氨基酸多为消旋型(d型)氨基酸，在发酵过程中未见显著促进效果，但在碱水解过程中色氨酸并未被破坏(见表4氨基酸检测数据)。
73.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
74.表3：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
75.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌7.33.56.31.08.87.12.14.16.24.32.53.34.33.41.01.004.2酵母菌4.25.18.30.69.28.05.85.57.17.17.34.14.23.32.53.503.1芽孢杆菌6.16.17.32.010.37.61.54.15.52.53.54.13.34.13.02.105.5谷棒杆菌3.54.37.51.18.88.23.02.55.02.62.53.21.53.34.22.503.3
76.表4：大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果
77.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌2.11.31.502.21.30.31.23.20.70.41.21.31.01.40.36.22.1酵母菌1.72.52.203.22.13.02.34.02.02.12.03.02.81.11.110.31.4芽孢杆菌3.11.52.104.11.01.01.81.92.30.71.11.41.71.90.87.53.1谷棒杆菌1.82.23.304.13.10.91.12.91.00.81.72.32.51.51.27.72.0
78.实施例3：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
79.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比5:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比3:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比2.5:1比例混合制备得到酵母菌混合液；
80.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
81.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解；
82.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解；
83.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解；
84.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表1。
85.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解；
86.取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解；
87.取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解；
88.取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解。大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果见表2。
89.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
90.酸水解得到氨基酸为未消旋的(l型)氨基酸，在发酵过程中均能够被细菌利用，但在水解过程中色氨酸被沸酸完全破坏，因此硫酸水解液中缺少了色氨酸(见表5氨基酸检测数据)，而碱水解得到的氨基酸多为消旋型(d型)氨基酸，在发酵过程中未见显著促进效果，但在碱水解过程中色氨酸并未被破坏(见表6氨基酸检测数据)。
91.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
92.表5：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
93.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌6.53.15.81.07.25.82.03.85.93.52.23.13.82.80.91.003.8酵母菌4.14.67.50.47.97.76.04.76.86.56.53.83.83.12.12.802.9芽孢杆菌5.85.96.51.89.96.41.13.74.52.43.84.82.43.52.13.302.4谷棒杆菌4.24.66.81.07.16.81.92.14.62.11.82.81.13.13.82.803.5
94.表6：大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果
95.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌1.81.12.102.01.00.11.13.10.60.41.21.01.01.90.38.91.5酵母菌1.21.71.502.82.12.82.13.21.61.81.71.92.11.11.612.11.8芽孢杆菌2.31.22.503.50.80.71.11.42.10.61.00.91.91.70.78.82.9谷棒杆菌0.92.23.502.82.70.41.82.30.70.51.12.12.21.51.48.13.1
96.实施例4：复合氮源的制备方法，其与实施例1不同之处在于：步骤(2)混合液加酸水解制备酸水解液，加盐酸进行水解：
97.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％
盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解；
98.谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解；
99.枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解；
100.酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表7。
101.其余步骤及参数与实施例1相同。
102.表7：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
103.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌8.14.27.01.19.18.31.34.36.15.23.13.75.13.81.21.106.5酵母菌5.06.110.51.112.27.16.56.18.56.88.54.13.72.52.64.703.5芽孢杆菌7.26.510.10.911.18.12.13.56.13.54.14.44.23.12.12.506.1谷棒杆菌5.65.58.60.710.19.33.13.36.53.13.35.12.82.83.13.104.3
104.实施例5：利用实施例1制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
105.实施例6：利用实施例2制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
106.实施例7：利用实施例3制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
107.实施例8：利用实施例4制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
108.对比实施例1：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)将不同酸水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
109.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1.2比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1.5比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比1:1.5比例混合制备得到酵母菌混合液；
110.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
111.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
112.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
113.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
114.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解。
115.(3)将不同酸水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
116.对比实验：
117.试验方法：
118.制备冷冻甘油管，超纯水配制50％甘油，121℃灭菌20min，吸取500μl分装至2ml甘油管内，以大肠杆菌(escherichia coli)为发酵菌种，将od
600
为10的种子1ml，-70℃冷冻备用。取出冻存的甘油管解冻，吸取100μl种子液，涂布lb斜面活化，37℃培养12h；将斜面转接至容积为500ml的三角摇瓶(摇瓶内装有100ml lb培养基)中，接种后，放置37℃摇床，220rpm回转摇床振荡培养5～6h。摇瓶种子od
600
生长至10，即为一级种子液；将一级种子液接种至容积为10l的种子罐(种子罐内装有4l种子培养基)中，培养条件：37℃、25-28％氨水控制ph7.0，溶氧20％-50％；待种子液od
600
生长至20(od
600
指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值，本技术中指的是种子液在600nm波长处的吸光值)，即为二级种子液；将二级种子液2.5l接种至容积为50l的发酵罐(发酵罐内装有17.5l发酵培养基)中进行发酵培养，培养条件：37℃、25-28％氨水控制ph7.0，溶氧20％-50％，发酵总时长32h。发酵结束后，检测发酵液中的l-苏氨酸含量，检测并计算葡萄糖转化率。
119.lb培养基为：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l。
120.种子培养基为：葡萄糖25g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆20g/l，kh2po
4 1.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l；ph为7.0，121℃灭菌20min。
121.实验组1：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例5发酵培养基。
122.实验组2：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例6发酵培养基。
123.实验组3：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例7发酵培养基。
124.实验组4：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例8发酵培养基。
125.对照组1：采用上述实验方法，其中，发酵培养基为：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，豆粕水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
126.豆粕水解液常用常规方法制备得到，具体方法不再详细阐述。
127.对照组2：采用上述实验方法，其中，发酵培养基为：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，菌体蛋白水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
128.所使用的菌体蛋白水解液的方法为现有技术手段：取枯草芽孢杆菌截留液脱水干燥后制得干菌体；取干菌体，加入干菌体3倍质量的水，加入干菌体1.5倍质量的质量百分比浓度为93％的硫酸，水解温度100℃，水解25h得到菌体蛋白水解液。
129.对照组3：采用上述实验方法，其中，发酵培养基为：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
130.所使用的复合氮源采用对比实验例1制备得到。
131.表8：检测实验组1、实验组2、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5制备得到的发酵液中的l-苏氨酸含量，检测并计算葡萄糖转化率
132.指标/组别对照组1对照组2对照组3实验组1实验组2实验组3实验组4l-苏氨酸123g/l124g/l125.8g/l128g/l127.6g/l126.4g/l126.3g/l转化率56.4％57.4％58.1％59.5％59.3％59％58.5％
133.由表8数据可以看出，发酵结束后，实验组1产酸量和糖酸转化率最高，实验组1与对照组1(豆粕水解液)和对照组2(菌体蛋白水解液)相比，发酵液中l-苏氨酸分别提高5g/l和4g/l，葡萄糖转化率分别提高3.1％和2.1％；实验组2与对照组1(豆粕水解液)和对照组2(菌体蛋白水解液)相比，发酵液中l-苏氨酸分别提高4.6g/l和3.6g/l，葡萄糖转化率分别提高2.9％和1.9％。
134.术语解释：
135.发酵工艺：指利用微生物菌种来积累目标产物的全过程，包括培养基配方和配制，菌种复壮、扩培、培养过程的控制，含温度、ph、溶氧等关键参数控制，以及营养补充，培养结束控制等。
136.截留液：发酵液经过陶瓷膜过滤下来的混合物。
137.液相色谱测定苏氨酸的方法(hplc测定法)：高效液相色谱检测方法，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
138.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.复合氮源的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按比例混合制备得到酵母菌混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液：取大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液；取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液；取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按比例混合制备得到酵母菌混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按比例混合制备得到复合氮源成品。2.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，大肠杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-5:1；谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-3:1；枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5：1；酵母菌截留液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5:1。3.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解。4.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，大肠杆菌
混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解。5.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，混合液加碱水解制备碱水解液的具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解。6.根据权利要求1-5任一所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合。7.根据权利要求6所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液的质量比为：2:1:1:3。8.利用权利要求1-7任一所述的复合氮源的制备方法制备得到的复合氮源。9.利用权利要求8所述复合氮源制备微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加的用途。10.利用权利要求8所述复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其特征在于，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，豆粕水解液5g/l，菌体蛋白水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。
技术总结
本发明公开了复合氮源及其制备方法及用其制备微生物发酵培养基的用途，其中，复合氮源的制备方法，包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；以及用该方法制备得到的复合氮源及其用途。本发明方法设备投入成本低、环保；制备得到的复合氮源更适合微生物发酵生长和产酸，发酵后产酸水平和葡萄糖转化率均显著提高。本发明复合氮源，应用在发酵培养基中或充当营养液在发酵过程流加，以替代高成本的豆粕水解液，在提升发酵产量的同时降低了发酵成本。产量的同时降低了发酵成本。
技术研发人员：宫卫波 王晓平 马新悦 吴强 鲁振如 李岩 高鹏
受保护的技术使用者：通辽梅花生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2022/3/8
1.本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种复合氮源及其制备方法及用其制备微生物发酵培养基的用途。
背景技术：
2.微生物在发酵过程中利用大量氮源来生长菌体，常见的氮源有酵母粉、玉米浆、玉米浆水解液、豆粕水解液、棉粕水解液等；其中，酵母粉的特点为：蛋白含量高，但细菌类微生物不能利用蛋白，又因其价格昂贵，发酵成本高，不适合作为大量氮源使用，仅可提供维生素等物质；玉米浆、玉米浆水解液、豆粕水解液、棉粕水解液等，这些氮源虽然价格便宜，工艺简单易制得，但因其营养指标受原料影响大，因此在使用这些氮源时发酵指标通常受影响而波动。
3.另外，目前氨基酸、有机酸、核苷等发酵完毕后，第一步分离时将用于发酵的微生物分离出来。微生物包括：大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、酵母菌(saccharomycetes)等，目前这些菌体的处理方式是将菌体制成微生物菌体蛋白，蛋白质含量可达50％，可以作为饲料添加剂，但是微生物菌体蛋白的风味差，添加到饲料中导致动物食欲不振；并且在制作菌体蛋白过程中会产生大量的废气，对环境污染严重。
4.处理微生物菌体另一种方式是，将微生物菌体用浓硫酸水解，将菌体中的蛋白质水解为氨基酸，可以用在氨基酸、核苷酸、有机酸发酵中，用于替代豆粕水解液。但从目前的水解方式来看，都是单一微生物菌体制作氨基酸营养物，其优势是废弃的菌体得到了重复利用，但还没有专门针对氨基酸、核苷、有机酸等发酵制作复合配方，其营养相对单一，对细菌的发酵促进效果有限。
技术实现要素：
5.本发明的第一个目的在于提供一种废弃菌体得到重复利用的、无污染物排放的、能够促进微生物发酵生长和产酸的、原料成本更低的复合氮源的制备方法。
6.本发明的第二个目的在于提供一种能够促进微生物发酵生长和产酸的、原料成本更低的复合氮源。
7.本发明的第三个目的在于提供一种能够明显提高发酵液中产酸量的、发酵过程中葡萄糖转化率更高的利用所述复合氮源制备微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加的用途。
8.本发明的第一个目的由如下技术方案实施：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
9.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到大肠杆
菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按比例混合制备得到酵母菌混合液；
10.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：取大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液；取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液；
11.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液；取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液；
12.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
13.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按比例混合制备得到复合氮源成品。
14.进一步的，所述步骤(1)中，大肠杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-5:1；谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-3:1；枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5：1；酵母菌截留液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5:1。
15.进一步的，所述步骤(2)中，大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；
16.谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；
17.枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；
18.酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解。
19.进一步的，所述步骤(2)中，大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；
20.谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至
70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；
21.枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；
22.酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解。
23.进一步的，所述步骤(3)中，混合液加碱水解制备碱水解液的具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；
24.谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；
25.枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；
26.酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解。
27.进一步的，所述步骤(4)中，大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合。
28.进一步的，所述步骤(5)中，大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液的质量比为：2:1:1:3。
29.本发明的第二个目的由如下技术方案实施：利用所述的复合氮源的制备方法制备得到的复合氮源。
30.本发明的第三个目的由如下技术方案实施：利用所述复合氮源制备微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加的用途。
31.具体的，利用所述复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，豆粕水解液5g/l，菌体蛋白水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。
32.本发明的优点：
33.1、本发明通过将玉米稀浆分别与发酵后的截流液：大肠杆菌截流液、谷氨酸棒杆菌截流液、枯草芽孢杆菌截流液和酵母菌截留液按比例混合，分别经过酸水解及碱水解后再按一定比例复配得到复合氮源成品，其中包含多种氨基酸，供菌体利用，可以对氨基酸、
核苷、有机酸有针对性的调配，更适合微生物发酵生长和产酸。
34.2、发酵后的截流液：大肠杆菌截流液、谷氨酸棒杆菌截流液、枯草芽孢杆菌截流液和酵母菌截留液，无需经脱水干燥处理，直接与玉米稀浆复配后，用浓硫酸及氢氧化钠水解后复配，整个工艺过程简化了提取过程中截流液的后续处理步骤，节省了后续处理的设备投入，同时处理过程无污染环境的气体产生，更加安全环保。
35.3、利用本发明复合氮源制备的微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加，较利用豆粕水解液或菌体蛋白水解液制备的微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加，发酵后产酸水平和葡萄糖转化率均显著提高。
36.4、本发明将玉米稀浆与多种发酵后截流液混合后水解复配制备的复合氮源，应用在发酵培养基中或充当营养液在发酵过程流加，以替代高成本的豆粕水解液，在提升发酵产量的同时降低了发酵成本，从而达到增产增效的目的。
具体实施方式：
37.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
38.以下实施例中的大肠杆菌截流液是以大肠杆菌(escherichia coli)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液；
39.谷氨酸棒杆菌截流液是以谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液；
40.枯草芽孢杆菌截流液是以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液；
41.酵母菌截流液是以酵母菌(saccharomycetes)为发酵菌种，发酵结束后，过滤发酵液得到的菌体截留液。
42.实施例1：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
43.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1.2:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1.5:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比1.5:1比例混合制备得到酵母菌混合液；
44.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
45.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
46.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
47.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
48.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表1。
49.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
50.取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
51.取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
52.取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解。大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果见表2。
53.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比10:1比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
54.酸水解得到氨基酸为未消旋的(l型)氨基酸，在发酵过程中均能够被细菌利用，但在水解过程中色氨酸被沸酸完全破坏，因此硫酸水解液中缺少了色氨酸(见表1氨基酸检测数据)，而碱水解得到的氨基酸多为消旋型(d型)氨基酸，在发酵过程中未见显著促进效果，但在碱水解过程中色氨酸并未被破坏(见表2氨基酸检测数据)。
55.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
56.表1：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
57.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌9.65.591.79.811.51.85.48.46.42.93.54.12.41.71.107.9酵母菌4.75.612.70.913.45.69.15.27.93.14.744.32.21.4401.7芽孢杆菌104.89.61.414.99.22.44.37.55.61.73.44.73.12.33.106.4谷棒杆菌7.26.19.11.11310.34.24.47.14.13.14.24.23.12.33.504.4
58.表2：大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果
59.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌2.61.52.002.81.50.81.43.41.10.91.52.11.11.70.36.62.9酵母菌1.72.62.703.42.63.13.24.92.12.72.43.33.21.41.411.51.7芽孢杆菌3.11.82.604.91.21.42.32.52.60.71.41.72.12.31.18.63.4谷棒杆菌2.22.13.104.03.31.21.43.11.11.12.22.22.11.31.58.12.4
60.实施例2：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
61.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比2:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比2:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到酵母菌混合液；
62.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
63.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解；
64.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解；
65.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解；
66.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为20％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表1。
67.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
68.取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
69.取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解；
70.取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边20ml/min加入质量百分比浓度为20％氢氧化钠水溶液；然后加热至90℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1％，完成水解。大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果见表2。
71.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比5:1比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
72.酸水解得到氨基酸为未消旋的(l型)氨基酸，在发酵过程中均能够被细菌利用，但在水解过程中色氨酸被沸酸完全破坏，因此硫酸水解液中缺少了色氨酸(见表3氨基酸检测数据)，而碱水解得到的氨基酸多为消旋型(d型)氨基酸，在发酵过程中未见显著促进效果，但在碱水解过程中色氨酸并未被破坏(见表4氨基酸检测数据)。
73.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
74.表3：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
75.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌7.33.56.31.08.87.12.14.16.24.32.53.34.33.41.01.004.2酵母菌4.25.18.30.69.28.05.85.57.17.17.34.14.23.32.53.503.1芽孢杆菌6.16.17.32.010.37.61.54.15.52.53.54.13.34.13.02.105.5谷棒杆菌3.54.37.51.18.88.23.02.55.02.62.53.21.53.34.22.503.3
76.表4：大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果
77.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌2.11.31.502.21.30.31.23.20.70.41.21.31.01.40.36.22.1酵母菌1.72.52.203.22.13.02.34.02.02.12.03.02.81.11.110.31.4芽孢杆菌3.11.52.104.11.01.01.81.92.30.71.11.41.71.90.87.53.1谷棒杆菌1.82.23.304.13.10.91.12.91.00.81.72.32.51.51.27.72.0
78.实施例3：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
79.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比5:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比3:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比2.5:1比例混合制备得到酵母菌混合液；
80.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
81.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解；
82.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解；
83.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解；
84.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为25％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表1。
85.(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解；
86.取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解；
87.取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解；
88.取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边15ml/min加入质量百分比浓度为30％氢氧化钠水溶液；然后加热至100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为2％，完成水解。大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果见表2。
89.(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比15:1比例混合制备得到酵母菌混合水解液；
90.酸水解得到氨基酸为未消旋的(l型)氨基酸，在发酵过程中均能够被细菌利用，但在水解过程中色氨酸被沸酸完全破坏，因此硫酸水解液中缺少了色氨酸(见表5氨基酸检测数据)，而碱水解得到的氨基酸多为消旋型(d型)氨基酸，在发酵过程中未见显著促进效果，但在碱水解过程中色氨酸并未被破坏(见表6氨基酸检测数据)。
91.(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
92.表5：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
93.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌6.53.15.81.07.25.82.03.85.93.52.23.13.82.80.91.003.8酵母菌4.14.67.50.47.97.76.04.76.86.56.53.83.83.12.12.802.9芽孢杆菌5.85.96.51.89.96.41.13.74.52.43.84.82.43.52.13.302.4谷棒杆菌4.24.66.81.07.16.81.92.14.62.11.82.81.13.13.82.803.5
94.表6：大肠杆菌碱水解液、谷氨酸棒杆菌碱水解液、枯草芽孢杆菌碱水解液和酵母菌碱水解液的hplc检测氨基酸结果
95.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌1.81.12.102.01.00.11.13.10.60.41.21.01.01.90.38.91.5酵母菌1.21.71.502.82.12.82.13.21.61.81.71.92.11.11.612.11.8芽孢杆菌2.31.22.503.50.80.71.11.42.10.61.00.91.91.70.78.82.9谷棒杆菌0.92.23.502.82.70.41.82.30.70.51.12.12.21.51.48.13.1
96.实施例4：复合氮源的制备方法，其与实施例1不同之处在于：步骤(2)混合液加酸水解制备酸水解液，加盐酸进行水解：
97.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％
盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解；
98.谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解；
99.枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解；
100.酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边30ml/min加入质量百分比浓度为36％盐酸；然后加热至80℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为30％，完成水解。大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果见表7。
101.其余步骤及参数与实施例1相同。
102.表7：大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液的hplc检测氨基酸结果
103.菌种类别alaargaspcysgluglyhisileleulysmetpheproserthrtyrtrpval大肠杆菌8.14.27.01.19.18.31.34.36.15.23.13.75.13.81.21.106.5酵母菌5.06.110.51.112.27.16.56.18.56.88.54.13.72.52.64.703.5芽孢杆菌7.26.510.10.911.18.12.13.56.13.54.14.44.23.12.12.506.1谷棒杆菌5.65.58.60.710.19.33.13.36.53.13.35.12.82.83.13.104.3
104.实施例5：利用实施例1制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
105.实施例6：利用实施例2制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
106.实施例7：利用实施例3制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
107.实施例8：利用实施例4制备得到的复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
108.对比实施例1：复合氮源的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)将不同酸水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，
109.(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1.2比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按质量比1:1.5比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按质量比1:1.5比例混合制备得到酵母菌混合液；
110.(2)混合液加酸水解制备酸水解液：
111.大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液，具体方法为：取2l大肠杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；完成后通过夹套加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
112.取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液，具体方法为：取2l谷氨酸棒杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
113.取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液，具体方法为：取2l枯草芽孢杆菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解；
114.取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液，具体方法为：取2l酵母菌混合液置于10l罐体中，搅拌转速设置为300rpm，边搅拌边10ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15％，完成水解。
115.(3)将不同酸水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌酸水解液、谷氨酸棒杆菌酸水解液、枯草芽孢杆菌酸水解液和酵母菌酸水解液按质量比为：2:1:1:3比例混合制备得到复合氮源成品。
116.对比实验：
117.试验方法：
118.制备冷冻甘油管，超纯水配制50％甘油，121℃灭菌20min，吸取500μl分装至2ml甘油管内，以大肠杆菌(escherichia coli)为发酵菌种，将od
600
为10的种子1ml，-70℃冷冻备用。取出冻存的甘油管解冻，吸取100μl种子液，涂布lb斜面活化，37℃培养12h；将斜面转接至容积为500ml的三角摇瓶(摇瓶内装有100ml lb培养基)中，接种后，放置37℃摇床，220rpm回转摇床振荡培养5～6h。摇瓶种子od
600
生长至10，即为一级种子液；将一级种子液接种至容积为10l的种子罐(种子罐内装有4l种子培养基)中，培养条件：37℃、25-28％氨水控制ph7.0，溶氧20％-50％；待种子液od
600
生长至20(od
600
指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值，本技术中指的是种子液在600nm波长处的吸光值)，即为二级种子液；将二级种子液2.5l接种至容积为50l的发酵罐(发酵罐内装有17.5l发酵培养基)中进行发酵培养，培养条件：37℃、25-28％氨水控制ph7.0，溶氧20％-50％，发酵总时长32h。发酵结束后，检测发酵液中的l-苏氨酸含量，检测并计算葡萄糖转化率。
119.lb培养基为：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l。
120.种子培养基为：葡萄糖25g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆20g/l，kh2po
4 1.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l；ph为7.0，121℃灭菌20min。
121.实验组1：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例5发酵培养基。
122.实验组2：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例6发酵培养基。
123.实验组3：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例7发酵培养基。
124.实验组4：采用上述实验方法，其中，发酵培养基采用实施例8发酵培养基。
125.对照组1：采用上述实验方法，其中，发酵培养基为：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，豆粕水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
126.豆粕水解液常用常规方法制备得到，具体方法不再详细阐述。
127.对照组2：采用上述实验方法，其中，发酵培养基为：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，菌体蛋白水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
128.所使用的菌体蛋白水解液的方法为现有技术手段：取枯草芽孢杆菌截留液脱水干燥后制得干菌体；取干菌体，加入干菌体3倍质量的水，加入干菌体1.5倍质量的质量百分比浓度为93％的硫酸，水解温度100℃，水解25h得到菌体蛋白水解液。
129.对照组3：采用上述实验方法，其中，发酵培养基为：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。l-苏氨酸发酵培养基的ph为7.0。121℃灭菌20min。
130.所使用的复合氮源采用对比实验例1制备得到。
131.表8：检测实验组1、实验组2、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5制备得到的发酵液中的l-苏氨酸含量，检测并计算葡萄糖转化率
132.指标/组别对照组1对照组2对照组3实验组1实验组2实验组3实验组4l-苏氨酸123g/l124g/l125.8g/l128g/l127.6g/l126.4g/l126.3g/l转化率56.4％57.4％58.1％59.5％59.3％59％58.5％
133.由表8数据可以看出，发酵结束后，实验组1产酸量和糖酸转化率最高，实验组1与对照组1(豆粕水解液)和对照组2(菌体蛋白水解液)相比，发酵液中l-苏氨酸分别提高5g/l和4g/l，葡萄糖转化率分别提高3.1％和2.1％；实验组2与对照组1(豆粕水解液)和对照组2(菌体蛋白水解液)相比，发酵液中l-苏氨酸分别提高4.6g/l和3.6g/l，葡萄糖转化率分别提高2.9％和1.9％。
134.术语解释：
135.发酵工艺：指利用微生物菌种来积累目标产物的全过程，包括培养基配方和配制，菌种复壮、扩培、培养过程的控制，含温度、ph、溶氧等关键参数控制，以及营养补充，培养结束控制等。
136.截留液：发酵液经过陶瓷膜过滤下来的混合物。
137.液相色谱测定苏氨酸的方法(hplc测定法)：高效液相色谱检测方法，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
138.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.复合氮源的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；其中，(1)分别配制混合液：将大肠杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到大肠杆菌混合液；将谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合液；将枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合液；将酵母菌截留液与玉米稀浆按比例混合制备得到酵母菌混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液：取大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液；取酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液：取大肠杆菌混合液加碱水解制备大肠杆菌碱水解液；取谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液；取枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液；取酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液：将大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按比例混合制备得到大肠杆菌混合水解液；将谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按比例混合制备得到谷氨酸棒杆菌混合水解液；将枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按比例混合制备得到枯草芽孢杆菌混合水解液；将酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按比例混合制备得到酵母菌混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品：将大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液按比例混合制备得到复合氮源成品。2.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，大肠杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-5:1；谷氨酸棒杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-3:1；枯草芽孢杆菌截流液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5：1；酵母菌截留液与玉米稀浆的质量比为1:1-2.5:1。3.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，大肠杆菌混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解；酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-30ml/min加入质量百分比浓度为93％浓硫酸；然后加热至100-110℃进行水解，水解至硫酸的质量百分比浓度为15-25％，完成水解。4.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，大肠杆菌
混合液加酸水解制备大肠杆菌酸水解液具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；谷氨酸棒杆菌混合液加酸水解制备谷氨酸棒杆菌酸水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；枯草芽孢杆菌混合液加酸水解制备枯草芽孢杆菌酸水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解；酵母菌混合液加酸水解制备酵母菌酸水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边以10-50ml/min加入质量百分比浓度为36-38％浓盐酸；然后加热至70-85℃进行水解，水解至盐酸的质量百分比浓度为25-35％，完成水解。5.根据权利要求1所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，混合液加碱水解制备碱水解液的具体方法为：大肠杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；谷氨酸棒杆菌混合液加碱水解制备谷氨酸棒杆菌碱水解液具体方法为：谷氨酸棒杆菌混合液中边搅拌边以10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；枯草芽孢杆菌混合液加碱水解制备枯草芽孢杆菌碱水解液具体方法为：枯草芽孢杆菌混合液中边搅拌边10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解；酵母菌混合液加碱水解制备酵母菌碱水解液具体方法为：酵母菌混合液中边搅拌边10-20ml/min加入质量百分比浓度为20-40％氢氧化钠水溶液；然后加热至90-100℃进行水解，水解至氢氧化钠水溶液的质量百分比浓度为1-2％，完成水解。6.根据权利要求1-5任一所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，大肠杆菌酸水解液与大肠杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；谷氨酸棒杆菌酸水解液与谷氨酸棒杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；枯草芽孢杆菌酸水解液与枯草芽孢杆菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合；酵母菌酸水解液与酵母菌碱水解液按质量比5:1-15:1混合。7.根据权利要求6所述的复合氮源的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，大肠杆菌混合水解液、谷氨酸棒杆菌混合水解液、枯草芽孢杆菌混合水解液和酵母菌混合水解液的质量比为：2:1:1:3。8.利用权利要求1-7任一所述的复合氮源的制备方法制备得到的复合氮源。9.利用权利要求8所述复合氮源制备微生物发酵培养基或作为营养液在微生物发酵过程中流加的用途。10.利用权利要求8所述复合氮源制备的l-苏氨酸发酵培养基，其特征在于，其包括如下组分：葡萄糖30g/l，硫酸铵10g/l，玉米浆10g/l，复合氮源5g/l，豆粕水解液5g/l，菌体蛋白水解液5g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，mnso4·
h2o 0.01g/l，vb
1 25μg/l，vb
3 4mg/l，vh 15μg/l。
技术总结
本发明公开了复合氮源及其制备方法及用其制备微生物发酵培养基的用途，其中，复合氮源的制备方法，包括如下步骤：(1)分别配制混合液；(2)混合液加酸水解制备酸水解液；(3)混合液加碱水解制备碱水解液；(4)酸水解液与碱水解液按比例混合制备混合水解液；(5)将不同混合水解液按比例混合制得复合氮源成品；以及用该方法制备得到的复合氮源及其用途。本发明方法设备投入成本低、环保；制备得到的复合氮源更适合微生物发酵生长和产酸，发酵后产酸水平和葡萄糖转化率均显著提高。本发明复合氮源，应用在发酵培养基中或充当营养液在发酵过程流加，以替代高成本的豆粕水解液，在提升发酵产量的同时降低了发酵成本。产量的同时降低了发酵成本。
技术研发人员：宫卫波 王晓平 马新悦 吴强 鲁振如 李岩 高鹏
受保护的技术使用者：通辽梅花生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2022/3/8
最新回复(0)