用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)属于杯状病毒科疱疹病毒属。猫感染该病毒后，主要表现为上呼吸道症状，部分病例会伴有跛行和全身性疾病。fcv不仅可以感染猫，也可以感染虎、狮等野生猫科动物，是流行于猫科动物中的一种重要病原。fcv的主要传染源是带毒猫和临床康复猫，感染后发病率较高，但是死亡率较低，通常死亡以幼苗为主。近期一些报道认为fcv病毒的致病性呈逐渐增强趋势，fcv强毒变异株不断爆发，不仅会引起上呼吸道疾病，还可引起脾脏、肝脏的病变，更严重的会引起致命的全身性疾病。
3.目前实验室诊断fcv的方法有病毒分离鉴定、免疫扩散、免疫荧光、pcr、elisa、电镜镜检等，临床常用的检测方法为rt-pcr。pcr技术因敏感性高、特异性强、费用低等优点已成为一种经典的检测方法，广泛用于猫杯状病毒的检测。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术对猫杯状病毒的检测灵敏毒低的问题。
5.为此，本发明提供了一种用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物，包括：
6.正向引物，其序列为：5
’‑
taaggttgctgcaggttg-3’；
7.反向引物，其序列为5
’‑
acaccataatgaccaagga-3’；
8.探针，其序列为：5
’‑
acaatccttaggccctttgctcaaccca-3’。
9.具体的，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
10.具体的，上述荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
11.本发明还提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，包括pcr反应液；所述pcr反应液包括上述任意一项所述的用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物。
12.具体的，上述pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1μm的正向引物、0.1-1μm的反向引物、0.1-1μm的探针。
13.具体的，上述用于检测猫杯状病毒的试剂盒还包括酶混合液；所述酶混合液40u/μl的rna酶抑制剂、25u/μl的逆转录酶和5u/μl的taq酶。
14.具体的，上述上述用于检测猫杯状病毒的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为合成的猫杯状病毒的假病毒；所述阴性对照为超纯水。
15.本发明还提供了一种用于检测猫杯状病毒的方法，包括以下步骤：
16.(1)提取待测样本的dna；
17.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于猫杯状病毒的引物探针组合物；
18.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
19.具体的，上述步骤(2)中pcr反应程序为：42℃，15min；95℃，3min，95℃，10s，58℃，20s，40个循环。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
21.本发明提供的这种以用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物作为主要成分的试剂盒耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，接近现有技术中检测猫杯状病毒的最高水平，为诊断猫杯状病毒提供可靠的实验依据。
22.以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
23.图1是本发明实施例2中pcr反应结果。
具体实施方式
24.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
25.本发明提供了用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物，包括：
26.正向引物，其序列为：5
’‑
taaggttgctgcaggttg-3’；
27.反向引物，其序列为5
’‑
acaccataatgaccaagga-3’；
28.探针，其序列为：5
’‑
acaatccttaggccctttgctcaaccca-3’。
29.探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中，荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
30.本发明还提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，包括pcr反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。
31.其中，pcr反应液包括上述任意一项所述的用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物。具体的，pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1μm的正向引物、0.1-1μm的反向引物、0.1-1μm的探针。
32.酶混合液40u/μl的rna酶、**的抑制剂、25u/μl的逆转录酶和5u/μl的taq酶；
33.阳性对照为猫杯状装甲rna病毒；阴性对照为超纯水。
34.本发明还提供了一种用于检测猫杯状病毒的方法，包括以下步骤：
35.(1)提取待测样本的dna；
36.(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括上述任意一项所述的用于猫杯状病毒的引物探针组合物；pcr反应程序为：42℃，15min；95℃，3min，95℃，10s，58℃，20s，40个循环；
37.(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。
38.下面通过具体实施例对本发明的用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒
及方法的效果进行研究。
39.实施例1：
40.本实施例提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，包括如下组分：
41.(1)pcr反应液：2mm的mgcl2、50mm的tris、500mg/l的bsa、100μm的dntps、0.1μm的正向引物、0.1μm的反向引物、0.1μm的探针。
42.其中，正向引物序列为：5
’‑
taaggttgctgcaggttg-3’；
43.反向引物序列为5
’‑
acaccataatgaccaagga-3’；
44.探针序列为：5
’‑
acaatccttaggccctttgctcaaccca-3’。
45.探针的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有bhq1荧光淬灭基团。
46.(2)酶混合液：40u/μl的rna酶抑制剂、25u/μl的逆转录酶和5u/μl的taq酶。
47.(3)阳性对照：委托金唯智生物科技有限公司合成猫杯状病毒rna假病毒；
48.阴性对照：超纯水。
49.实施例2：
50.本实施例提供了一种使用实施例1中试剂盒检测猫杯状病毒的方法，包括以下步骤：
51.(1)在试管中加入2.9μl的pcr反应液和0.1μl的酶混合液，充分混匀后瞬时离心，作为一份pcr-mix备用；
52.(2)取患猫样本体液200μl，使用苏州中科先进技术研究院有限公司的病毒dna/rna共提试剂盒(磁珠法)，按照其说明书操作，提取获得样本的核酸提取物，作为待测样本备用；
53.(3)取三份pcr-mix，向其中分别加入2μl待测样本、2μl阴性对照、2μl阳性对照，将加样后的试管放入q3 plus荧光定量pcr仪，进行pcr扩增，反应程序为：42℃，15min；95℃，3min，95℃，10s，58℃，20s，40个循环。
54.阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
55.阳性对照ct值小于38，阴性对照ct无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的s型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
56.采用本发明提供的方法检测猫杯状病毒时，判断标准如下：
57.1、检测样本ct≤38.0者判为阳性。
58.2、38.0＜ct≤40的检测样本建议重做，重做结果中ct值《40者为阳性，否则为阴性。
59.以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物，其特征在于，包括：正向引物，其序列为：5
’‑
taaggttgctgcaggttg-3’；反向引物，其序列为5
’‑
acaccataatgaccaagga-3’；探针，其序列为：5
’‑
acaatccttaggccctttgctcaaccca-3’。2.如权利要求1所述的用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。3.如权利要求2所述的用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物，其特征在于：所述荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。4.一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于：包括pcr反应液；所述pcr反应液包括权利要求1-3任意一项所述的用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物。5.如权利要求4所述的用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括：1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1μm的正向引物、0.1-1μm的反向引物、0.1-1μm的探针。6.如权利要求4所述的用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于：还包括酶混合液；所述酶混合液40u/μl的rna酶抑制剂、25u/μl的逆转录酶和5u/μl的taq酶。7.如权利要求4所述的用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为合成的猫杯状病毒的假病毒；所述阴性对照为超纯水。8.一种用于检测猫杯状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本的dna；(2)以待测样本的dna为模板，进行荧光定量pcr反应，所述pcr反应体系包括权利要求1-3任意一项所述的用于猫杯状病毒的引物探针组合物；(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。9.如权利要求8所述的用于检测解脲脲原体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中pcr反应程序为：42℃，15min；95℃，3min，95℃，10s，58℃，20s，40个循环。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体提供了用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。本发明提供的这种以用于检测猫杯状病毒的引物探针组合物作为主要成分的试剂盒耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，接近现有技术中检测猫杯状病毒的最高水平，为诊断猫杯状病毒提供可靠的实验依据。状病毒提供可靠的实验依据。状病毒提供可靠的实验依据。


技术研发人员：张炳为 周树民 辜嘉
受保护的技术使用者：苏州中科先进技术研究院有限公司
技术研发日：2021.12.24
技术公布日：2022/3/8