一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用。


背景技术：

2.甘油又称1,2,3-丙二醇，是无色无味的有机液体，除了用作汽车和飞机燃料以及油田的防冻剂，在食品、造纸、化妆品、制革、纺织、照相、印刷、金属加工、电工材料和橡胶等工业中都有着广泛的用途，也可作为生产各种化学品的原料。此外，它也被认为是工业发酵的原料，主要通过微生物发酵生产一些高附加值的产品，例如黄原胶，海藻糖，鼠李糖脂，柠檬酸，乳酸，dha，epa，1,3-丙二醇等，其中1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-pd)作为新型高分子材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)的纤维单体，就是比较经典且具优势的产品之一。ptt纤维，综合了尼龙的柔软性、腈纶的蓬松性、涤纶的抗污性,加上本身固有的弹性，以及能常温染色等特点，把各种纤维的优良服用性能集于一身,成为当前国际上最新开发的热门高分子新材料之一。据有关专家估计，ptt纤维的需求量大约55％来自地毯领域，其余的45％为其他纺织品领域。但目前ptt的市场价格偏高，因而限制它只能在成本消化能力较强的产品和品种方面取得有限的发展成果，因此通过微生物发酵法合成ptt纤维单体1,3-丙二醇成为目前国内外学者研究的一个热点。
3.此外，1,3-pd独特的物理性质使其本身就是一种良好的溶剂、保护剂、抗冻剂，在1998年就已被美国食品药物管理局(fda)认定为gras(美国fda使用的检验标记，表示食品安全可用)，在食品领域可作为乳化剂、调味剂、增稠剂、保鲜剂、添加剂和吸湿剂等，不仅能改善食品的感官质量，提高食品的耐藏性和稳定性，同时也可以大大提高食品的营养价值。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在大肠杆菌中通过emp途径利用底物葡萄糖产生中间产物磷酸二羟丙酮，引入来自酿酒酵母的两个密码子经过优化设计后的关键酶3-磷酸甘油酶和3-磷酸甘油脱氢酶，将其过表达，实现磷酸二羟丙酮向甘油的转变，从而构建利用葡萄糖产甘油的通路。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种高效生产甘油的基因工程菌，所述基因工程菌同时强化表达优化密码子后的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶。
7.根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的大肠杆菌，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)、e.coli bl21(star)或e.coli rosetta。
8.根据本发明优选的，所述3-磷酸甘油脱氢酶为来自酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶，其编码基因为gpd1o，核苷酸序列如seq id no.2所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应大肠杆菌。
9.根据本发明优选的，所述3-磷酸甘油酶为来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酶，其编码
基因为gpp2o，核苷酸序列如seq id no.4所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应大肠杆菌。
10.根据本发明优选的，所述基因工程菌构建所用的表达载体中3-磷酸甘油脱氢酶基因位于3-磷酸甘油酶的上游。
11.根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的e.coli bl21(de3)时，还在基因工程菌中插入分子伴侣1和分子伴侣2。
12.进一步优选的，所述分子伴侣1来自大肠杆菌，其编码基因为grol，核苷酸序列如seq id no.5所示；所述分子伴侣2来自大肠杆菌，其编码基因为gros，核苷酸序列如seq id no.6所示。
13.进一步优选的，所述基因工程菌构建所用的表达载体中分子伴侣1位于3-磷酸甘油脱氢酶下游，3-磷酸甘油酶的上游；分子伴侣2位于3-磷酸甘油酶的下游。
14.采用本发明的基因工程菌进行摇瓶发酵70h，甘油的产量比对照菌株提高了58倍。
15.上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
16.(1)将酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1o插入载体质粒prsfduet中，构建表达载体prsfduet-gpd1o；
17.(2)将酿酒酵母的3-磷酸甘油酶基因gpp2o插入载体质粒prsfduet-gpd1o中，构建表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o；
18.(3)将大肠杆菌的分子伴侣1基因grol插入载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o中，构建表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol；
19.(4)将大肠杆菌的分子伴侣2基因gros插入载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol中，构建表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros；
20.(5)将表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o分别转化进大肠杆菌e.coli bl21(star)和e.coli rosetta中，将表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros转化进大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，挑选阳性重组子，得基因工程菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros、e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o和e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o。
21.根据本发明优选的，所述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
22.(1)以酿酒酵母s288c基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到3-磷酸甘油脱氢酶gpd1o序列，pcr引物序列如下：
23.primer1:5
′‑
cgcctgcaggtcgacaagcttatgagcgcggcggctgac-3
′
(含bamh i酶切位点)，
24.primer2:5
′‑
agctgccatctccttgcggccgcttagtcctcgtgcagatccagtt-3
′
(含hind iii酶切位点)；
25.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃40sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
26.将载体质粒prsfduet用hind iii和not i双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o质粒；
27.(2)以酿酒酵母s288c基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到3-磷酸甘油酶基因gpp2o序列，pcr引物序列如下：
28.primer3:5
′‑
taagaaggagatatacatatg atgggtctgaccaccaaaccg-3
′
(含nde i酶切位点)，
29.primer4:5
′‑
gccgatatccaattgagatct ttaccatttcagcagatcatctttcg-3
′
(含bgl ii酶切位点)；
30.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
31.将步骤(1)得到的载体质粒prsfduet-gpd1o分别用nde i和bgl ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒；
32.(3)以大肠杆菌mg1655基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到分子伴侣1基因grol序列，pcr引物序列如下：
33.primer5:5
′‑
caggtcgacaagcttgcggccgc aaggagatggcagctaaagacgtaaaattcg-3
′
(含not i酶切位点)，
34.primer6:5
′‑
ttactttctgttcgacttaag ttacatcatgccgcccatg-3
′
(含afl ii酶切位点)；
35.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，65℃30sec；延伸，72℃45s(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
36.将步骤(2)得到的载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o用not i和afl ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒；
37.(4)以大肠杆菌mg1655基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到分子伴侣2基因gros序列，pcr引物序列如下：
38.primer7:5
′‑
gtctactagcgcagcttaattaaaaggagatgaatattcgtccattgcatgat-3
′
(含pac i酶切位点)，
39.primer8:5
′‑
cagcggtggcagcagcctaggttacgcttcaacaattgccaga-3
′
(含avr ii酶切位点)；
40.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，65℃30sec；延伸，72℃15s(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
41.将步骤(3)得到的载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol用pac i和avr ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒；
42.(5)将步骤(2)得到的prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒分别化学转化进大肠杆菌感受态细胞bl21(star)和rosetta中，将步骤(4)得到的prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒化学转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，挑选阳性重组子，得基因工程菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros、e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o和e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o。
43.上述基因工程菌在生产甘油中的应用。
44.根据本发明优选的，所述应用是以葡萄糖为底物发酵生产甘油，生产工艺如下：
45.将上述基因工程菌在lb固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入lb液体培养基中，在37℃、200r/min培养12h，按照2％～10％的接种量接入发酵培养基中，37℃发酵生产甘油；
46.其中，发酵培养基组成(/l)：mgso4·
7h2o 0.48g，nah2po
4 6.0g，cacl
2 0.0111g，
nh4cl2.0g，nacl 0.5g，kh2po
4 3.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖40g。
47.本发明的有益效果：
48.1、本发明在大肠杆菌中同时表达了优化密码子后的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶，构建了新的基因工程菌，由于两个来自真核细胞的关键酶基因优化过密码子，更加适合在大肠杆菌中表达，因此在使用该工程菌以葡萄糖为底物发酵生产甘油时，极大地提高了甘油的产量，尤其是重组大肠杆菌e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o在1l发酵罐中甘油产量达到了10.89g/l，在摇瓶发酵中甘油产量达到了6.816g/l，相较于表达未优化密码子的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶的对照菌株e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1-gpp2的摇瓶发酵来说，甘油产量提高了58倍。
49.2、本发明在构建基因工程菌时选用e.coli bl21(de3)、e.coli bl21(star)或e.coli rosetta作为宿主菌，不但具有较高的甘油耐受力、转化率，并且属兼性菌，可在微氧或厌氧条件下发酵。且大肠杆菌代谢过程较为明晰，操作简便，这就为菌种的基因改良和利用基因工程构建新的菌种提供了便利，此外宿主菌e.coli bl21(star)能够增强宿主细胞内mrna的稳定性，能够进一步提高外源基因尤其是真核细胞基因的表达水平，而宿主菌e.coli rosetta自带氯霉素抗性，补充了大肠杆菌缺乏的六种稀有密码子对应的trna，从而进一步提高真核基因在原核细胞中的表达水平，在摇瓶发酵中甘油产量分别达到了5.318g/l和6.816g/l，相较于以e.coli bl21(de3)为宿主菌的重组菌株e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o的摇瓶发酵来说，甘油产量提高了15倍。当宿主菌为e.coli bl21(de3)时在基因工程菌中插入分子伴侣1和分子伴侣2相较于对照菌株能够进一步提高甘油的产量，在摇瓶发酵中达到4.425/l，是未插入分子伴侣的对照菌株e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o的25倍。
附图说明
50.图1为四种质粒图谱；图中，a为prsfduet-gpd1o质粒，b为prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒，c为prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒，d为prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒。
51.图2为阳性重组大肠杆菌e.coli/prsfduet-gpd1o的菌落pcr凝胶电泳图；
52.图中，各泳道均为gpd1o基因片段条带。
53.图3为阳性重组大肠杆菌e.coli/prsfduet-gpd1o-gpp2o的菌落pcr凝胶电泳图；
54.图中，各泳道均为gpp2o基因片段条带。
55.图4为阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros的菌落pcr凝胶电泳图；
56.图中，泳道1，2，3为e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros菌落的grol基因片段条带；泳道4，5，6为e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros菌落的gros基因片段条带。
57.图5为阳性重组大肠杆菌e.coli/prsfduet-gpd1o-gpp2o的sds-page凝胶电泳图；
58.图中,泳道1代表e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o，泳道2代表e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o，泳道3代表e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o，泳道4、5代表e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros。
59.图6为阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1-gpp2；e.coli bl21
(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o摇瓶发酵70h的甘油产量对比图。
60.图7为添加分子伴侣阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol；e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros摇瓶发酵70h的甘油产量对比图；
61.图8为不同宿主细胞阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o摇瓶发酵70h的甘油产量对比图。
62.图9为阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o在1l小型发酵罐中发酵70h的甘油产量对比图。
63.图10为阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o在1l小型发酵罐中发酵70h的甘油产量对比图。
64.图11为阳性重组大肠杆菌e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o在1l小型发酵罐中发酵70h的甘油产量对比图。
65.具体实施方法
66.下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
67.本发明中使用的酿酒酵母、大肠杆菌均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得，本发明使用的一步克隆试剂盒与质粒提取试剂盒分别为one step cloning kit c112-01，plasmid mini kit质粒小提试剂盒dc201-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司有售。
68.实施例1：质粒prsfduet-gpd1o的构建
69.酿酒酵母s288c中3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因为gpd1，核苷酸序列如seq id no.1所示，根据密码子偏好性将密码子进行优化，获得优化后的3-磷酸甘油脱氢酶，其编码基因命名为gpd1o，核苷酸序列如seq id no.2所示。利用生物信息学软件设计gpd1o序列的扩增引物primer1和primer2，再以酿酒酵母s288c基因组为模板进行pcr扩增，得到gpd1o序列。
70.引物序列如下：
71.primer1:5
′‑
cgcctgcaggtcgacaagcttatgagcgcggcggctgac-3
′
(含bamh i酶切位点)，
72.primer2:5
′‑
agctgccatctccttgcggccgcttagtcctcgtgcagatccagtt-3
′
(含hind iii酶切位点)；
73.pcr扩增体系按照试剂盒说明书配制；
74.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
75.所得的pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，得到大小约为1176bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒prsfduet用bamh i和hind iii双酶切后，经一步克隆酶连接得到prsfduet-gpd1o质粒，将prsfduet-gpd1o质粒用化学转化法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含50μg/ml卡那霉素固体lb平板上37℃过夜培
养，挑取阳性重组子-80℃保存；重组菌命名为e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o；采用质粒提取试剂盒从重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o中提取prsfduet-gpd1o质粒，其质粒图谱如图1a所示。
76.实施例2：质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o的构建：
77.酿酒酵母s288c中3-磷酸甘油酶的编码基因为gpp2，核苷酸序列如seq id no.3所示，根据密码子偏好性将密码子进行优化，获得优化后的3-磷酸甘油酶，其编码基因命名为gpp2o，核苷酸序列如seq id no.4所示。利用生物信息学软件设计gpp2o序列的扩增引物primer3和primer4，再以酿酒酵母s288c基因组为模板进行pcr扩增，得到gpp2o序列。
78.引物序列如下：
79.primer3:5
′‑
taagaaggagatatacatatg atgggtctgaccaccaaaccg-3
′
(含nde i酶切位点)，
80.primer4:5
′‑
gccgatatccaattgagatct ttaccatttcagcagatcatctttcg-3
′
(含bgl ii酶切位点)；
81.pcr扩增体系按照试剂盒说明书配制；
82.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，65℃30sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
83.所得的pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为700bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收。
84.将优化后的3-磷酸甘油酶基因gpp2o克隆入prsfduet-gpd1o质粒，优化后的3-磷酸甘油酶基因gppp2o位于启动子t7-promoter2的下游，构建得到prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒。
85.具体步骤如下：将载体质粒prsfduet-gpd1o用nde i和bgl ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接，得到prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒，将prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒用化学转化法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含50μg/ml卡那霉素固体lb平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；采用质粒提取试剂盒从重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o中提取prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒，其质粒图谱如图1b所示。
86.实施例3：质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol的构建
87.将大肠杆菌中的分子伴侣1基因grol克隆入prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒，分子伴侣1基因grol位于启动子t7-promoter1 gpd1o基因下游，构建prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒，prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒的图谱如图1c所示。
88.具体操作步骤如下：
89.以大肠杆菌mg1655基因组为模板进行pcr扩增，根据大肠杆菌分子伴侣grol基因序列和表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计扩增引物primer5和primer6，扩增得到分子伴侣基因grol序列(gene id：948665)，其核苷酸序列如seq id no.5所示；引物序列如下：
90.primer5:5
′‑
caggtcgacaagcttgcggccgc aaggagatggcagctaaagacgtaaaattcg-3
′
(含not i酶切位点)，
91.primer6:5
′‑
ttactttctgttcgacttaag ttacatcatgccgcccatg-3
′
(含afl ii酶切
位点)；
92.pcr扩增体系按照试剂盒说明书配制；
93.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，70℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
94.所得的pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为1.6kb的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o用not i和afl ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒，将prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒用化学转化法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含50μg/ml卡那霉素固体lb平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol；采用质粒提取试剂盒从重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol中提取prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒。
95.实施例4：质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros的构建
96.将大肠杆菌的分子伴侣2基因gros克隆入prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒，分子伴侣2基因gros位于启动子t7-promoter2 gpp2o基因下游，构建prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒的图谱如图1d所示。
97.具体操作步骤如下：
98.以大肠杆菌mg1655基因组为模板进行pcr扩增，根据大肠杆菌分子伴侣2基因gros序列和载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计扩增引物primer7和primer8，扩增得到分子伴侣2基因gros序列(gene id：948655)，其核苷酸序列如seq id no.6所示；引物序列如下：
99.primer7:5
′‑
gtctactagcgcagcttaattaaaaggagatgaatattcgtccattgcatgat-3
′
(含pac i酶切位点)，
100.primer8:5
′‑
cagcggtggcagcagcctaggttacgcttcaacaattgccaga-3
′
(含avr ii酶切位点)；
101.pcr扩增体系按照试剂盒说明书配制；
102.pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，61℃30sec；延伸，72℃1min(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
103.所得的pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为300bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol用pac i和avr ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒。将prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒用化学转化法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含50μg/ml卡那霉素固体lb平板上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存，重组菌命名为e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros；采用质粒提取试剂盒从重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros中提取prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒。
104.实施例5：重组大肠杆菌基因工程菌的构建
105.(1)提取重组质粒
106.采用质粒提取试剂盒从保存在甘油的重组菌bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o中获得重组质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o。
107.(2)转化感受态细胞，制备重组菌
108.取10μl步骤(1)中提取的重组质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o，分别取大肠杆菌bl21(star)，rosetta感受态细胞个90μl，将重组质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o分别与感受态细胞混合，放置冰上30min，42℃准确热激45s，冰上静置2-3min，取出感受态细胞立即加入到1ml lb液体培养基中37℃、200r/min振荡培养1-2h，然后分别涂布于含50μg/ml卡那抗性，50μg/ml卡那、25ug/ml氯霉素抗性的lb固体培养基平板上37℃培养过夜，得到重组大肠杆菌e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o、e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o。
109.挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，将实施例2中的e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o，本实施例中的e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o、e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o的单菌落采用对应的引物(primer1～4)进行pcr扩增，pcr条件与实施例1～2相同，然后将扩增产物进行pcr凝胶电泳，结果如图2、3所示。
110.将实施例4中的e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros单菌落采用用对应的引物(primer5～8)进行pcr扩增，pcr条件与实施例3～4相同，然后将扩增产物进行pcr凝胶电泳，结果如图4所示。
111.由图2、3、4可知，凝胶电泳图中均出现目的条带且条带单一，e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o单菌落的目的片段长度分别为1.1kb和700bp。
112.e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros单菌落的目的片段长度约为1.6kb和200bp，显示菌落为阳性克隆，得阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros，将重组菌保存于-80℃。
113.实施例6：对照菌株的构建
114.按照实施例1～5所述的方法，扩增未优化密码子3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因gpd1和3-磷酸甘油酶的编码基因为gpp2，再构建质粒prsfduet-gpd1和prsfduet-gpd1-gpp2，将质粒prsfduet-gpd1-gpp2转化进大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)prsfduet-gpd1-gpp2，作为对照菌株。
115.其中，基因gpd1的扩增引物如下：
116.primer9:5
′‑
tcatcaccacagccaggatccatgtctgctgctgctgatagattaa-3
′
(含bamh i酶切位点)，
117.primer10:5
′‑
gcattatgcggccgcaagcttctaatcttcatgtagatctaattcttcaatca-3
′
(含hind iii酶切位点)；
118.基因gpp2的扩增引物如下：
119.primer11:5
′‑
agatatacatatggcagatctatgggattgactactaaacctctatcttt-3
′
(含bgl ii酶切位点)，
120.primer12:5
′‑
ggtttctttaccagactcgagttaccatttcaacagatcgtcctt-3
′
(含xho i酶切位点)。
121.实施例7：重组大肠杆菌的基因表达
122.将实施例5中的阳性重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；
bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros最高产甘油浓度分别为0.175g/l，1.708/l和4.425/l，是未插入分子伴侣菌株e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o的25倍。
132.由图8可知，对比更换宿主菌的效果，摇瓶发酵70h后基因工程菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o最高产甘油浓度分别可达0.163g/l，5.318g/l和6.816g/l，葡萄糖转化为甘油的转化率分别达到0.326％，10.636％和13.632％，相较于表达未优化密码子的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶的对照菌株e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1-gpp2的摇瓶发酵来说，甘油产量提高了58倍。
133.由图9、10、11可知，在1l小型发酵罐中有氧发酵70h后基因工程菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o；e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o甘油最高产量分别为4.741g/l，8.958g/l和10.897g/l，葡萄糖到甘油转化率分别为14.78％，27.39％和33.4％。
134.同时以上结果表明在该发明中将来自酿酒酵母的两个产甘油关键酶基因的密码子进行优化并选择合适的宿主菌进行发酵后是可行的，并且成果明显。

技术特征：
1.一种高效生产甘油的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时强化表达优化密码子后的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为重组的大肠杆菌，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)、e.coli bl21(star)或e.coli rosetta。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述3-磷酸甘油脱氢酶为来自酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶，其编码基因为gpd1o，核苷酸序列如seq id no.2所示；所述3-磷酸甘油酶为来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酶，其编码基因为gpp2o，核苷酸序列如seq id no.4所示。4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌构建所用的表达载体中3-磷酸甘油脱氢酶基因位于3-磷酸甘油酶的上游。5.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为重组的e.coli bl21(de3)时，还在基因工程菌中插入分子伴侣1和分子伴侣2。6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述分子伴侣1来自大肠杆菌，其编码基因为grol，核苷酸序列如seq id no.5所示；所述分子伴侣2来自大肠杆菌，其编码基因为gros，核苷酸序列如seq id no.6所示；所述基因工程菌构建所用的表达载体中分子伴侣1位于3-磷酸甘油脱氢酶下游，3-磷酸甘油酶的上游；分子伴侣2位于3-磷酸甘油酶的下游。7.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1o插入载体质粒prsfduet中，构建表达载体prsfduet-gpd1o；(2)将酿酒酵母的3-磷酸甘油酶基因gpp2o插入载体质粒prsfduet-gpd1o中，构建表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o；(3)将大肠杆菌的分子伴侣1基因grol插入载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o中，构建表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol；(4)将大肠杆菌的分子伴侣2基因gros插入载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol中，构建表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros；(5)将表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o分别转化进大肠杆菌e.coli bl21(star)和e.coli rosetta中，将表达载体prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros转化进大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，挑选阳性重组子，得基因工程菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros、e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o和e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o。8.如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以酿酒酵母s288c基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到3-磷酸甘油脱氢酶gpd1o序列，pcr引物序列如下：primer1:5
′‑
cgcctgcaggtcgacaagcttatgagcgcggcggctgac-3
′
(含bamhi酶切位点)，primer2:5
′‑
agctgccatctccttgcggccgcttagtcctcgtgcagatccagtt-3
′
(含hind iii酶切位点)；pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃40sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将载体质粒prsfduet用hind iii和not i双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o质粒；(2)以酿酒酵母s288c基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到3-磷酸甘油酶基因gpp2o序列，pcr引物序列如下：primer3:5
′‑
taagaaggagatatacatatg atgggtctgaccaccaaaccg-3
′
(含nde i酶切位点)，primer4:5
′‑
gccgatatccaattgagatct ttaccatttcagcagatcatctttcg-3
′
(含bgl ii酶切位点)；pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；将步骤(1)得到的载体质粒prsfduet-gpd1o分别用nde i和bgl ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒；(3)以大肠杆菌mg1655基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到分子伴侣1基因grol序列，pcr引物序列如下：primer5:5
′‑
caggtcgacaagcttgcggccgc aaggagatggcagctaaagacgtaaaattcg-3
′
(含not i酶切位点)，primer6:5
′‑
ttactttctgttcgacttaag ttacatcatgccgcccatg-3
′
(含afl ii酶切位点)；pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，65℃30sec；延伸，72℃45s(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；将步骤(2)得到的载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o用not i和afl ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol质粒；(4)以大肠杆菌mg1655基因组为模板进行pcr扩增，扩增得到分子伴侣2基因gros序列，pcr引物序列如下：primer7:5
′‑
gtctactagcgcagcttaattaaaaggagatgaatattcgtccattgcatgat-3
′
(含pac i酶切位点)，primer8:5
′‑
cagcggtggcagcagcctaggttacgcttcaacaattgccaga-3
′
(含avr ii酶切位点)；pcr扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，65℃30sec；延伸，72℃15s(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；将步骤(3)得到的载体质粒prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol用pac i和avr ii双酶切后，经一步克隆试剂盒连接得到prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒；(5)将步骤(2)得到的prsfduet-gpd1o-gpp2o质粒分别化学转化进大肠杆菌感受态细胞bl21(star)和rosetta中，将步骤(4)得到的prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros质粒化学转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，挑选阳性重组子，得基因工程菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-gpd1o-gpp2o-grol-gros、e.coli bl21(star)/prsfduet-gpd1o-gpp2o和e.coli rosetta/prsfduet-gpd1o-gpp2o。9.权利要求1所述的基因工程菌在生产甘油中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是以葡萄糖为底物发酵生产甘油，
生产工艺如下：将上述基因工程菌在lb固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入lb液体培养基中，在37℃、200r/min培养12h，按照2％～10％的接种量接入发酵培养基中，37℃发酵生产甘油；其中，发酵培养基组成(/l)：mgso4·
7h2o 0.48g，nah2po
4 6.0g，cacl
2 0.0111g，nh4cl 2.0g，nacl 0.5g，kh2po
4 3.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖40g。

技术总结
本发明涉及一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在大肠杆菌中强化表达优化密码子后的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶，构建了基因工程菌，在使用该工程菌以葡萄糖为底物发酵生产甘油时，极大地提高了甘油的产量，尤其是重组大肠杆菌E.coli Rosetta/pRSFduet-gpd1o-gpp2o在1L发酵罐中甘油产量达到了10.89g/L，在摇瓶发酵中甘油产量达到了6.816g/L，相较于表达未优化密码子的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶的对照菌株E.coli BL21(de3)/pRSFduet-gpd1-gpp2的摇瓶发酵来说，甘油产量提高了58倍。甘油产量提高了58倍。


技术研发人员：马春玲 王艺纯 王瑞明 李丕武 苏静 汪俊卿
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学
技术研发日：2021.12.09
技术公布日：2022/3/8