一种针药一体化水凝胶微针

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种针药一体化的水凝胶微针。


背景技术：

2.传统中医理论认为穴位(腧穴)是气血输注出入脏腑经络的特殊部位，穴位与深部组织器官密切联系、互相输通。通过针灸、推拿、给药等方式刺激人体的穴位，可以起到疏通经络、调和阴阳、行气活血的作用，激发穴区效应，达到扶正祛邪、防治疾病的目的。脐部给药为中医常用的脐疗方法之一。中医认为在脐部给药后，药物经皮进入穴区组织，可刺激穴区激发特殊调节作用，同时发挥药物的治疗作用。近年来，腹针、揿针、脐针等用于痛经治疗的临床报道日益增多，通过细针、浅刺，刺激神阙穴区，结合艾灸、药物敷贴等，起到调节脏腑经络、行气、散瘀、止痛的效果。当前临床应用中，针灸需要专业医技人员，穴位给药的主要途径为穴位注射和穴区敷药，而穴位注射患者依从性较差，穴区敷药由于皮肤的屏障作用及皮内微血的快速转运，难以将药物浓集于皮下深层的穴区组织。
3.微针(microneedles,mns)是一种集注射和透皮为一体的新兴的经皮给药促透技术，具有无痛、微创的特点。微针可用金属、陶瓷、硅或高分子聚合物材料制备，长度为100～1000μm，有单根微针和多枚集成的微针阵列，可根据需要制成笔式、滚轮、贴片等不同形式。微针与药物相结合的治疗方法，可先行针刺再给药，也可将药物附着、包载于针体后直接输送到体内。由于针刺后可在皮肤表面形成药物输送孔道，能有效促进药物经皮吸收，增强治疗效果。微针具有无痛、微创的特点，患者依从性高。
4.肉桂油具有温中散寒的效果，在穴位疗法的临床中，如果能够递送到穴位皮肤深层，能充分发挥功效，达到治疗的目的；尤其是脐部穴区给药。
5.如果将肉桂油附着在微针针体上，进行针刺治疗，载药量可能不足；如果包载于针体，在体内的释放问题并未解决。
6.因此，需要对现有技术加以改进，开发一种包载药物的微针，将针刺与穴位给药相结合，实现“针”“药”的一体化治疗。
7.水凝胶微针(hydrogel forming microneedles,hfmns)由溶胀材料和药物贮库组成。水凝胶微针刺入皮肤后，微针阵列中的溶胀材料和药物贮库可吸收细胞间隙液从而使针体溶胀，释放药物。因此，以微针包载药物，可以将脐区针刺与穴位给药相结合，实现“针”“药”的一体化治疗。


技术实现要素：

8.本发明旨在克服现有技术缺陷，将脐区针刺与穴位给药相结合，实现“针”“药”的一体化穴位治疗策略，易于操作，并增强治疗效果。
9.一种针药一体化水凝胶微针(hfmns-cio@ncs)，包括微针基质和包载于微针基质内的药物。微针基质为明胶与单宁酸交联产物形成的水凝胶。
10.优选的，包载于微针基质内的药物为纳米胶囊，更优选为肉桂油纳米胶囊，即所述
的针药一体化水凝胶微针为肉桂油纳米胶囊水凝胶微针(hfmns-cio@ncs)。
11.所述的肉桂油纳米胶囊(cio@ncs)，是将肉桂油包载于壳聚糖与海藻酸钠形成的壳-核结构中；肉桂油纳米胶囊粒径为50～500nm，其中桂皮醛的载药量为26wt％～36wt％。
12.分别以明胶和肉桂油用量计，微针基质与肉桂油纳米胶囊的质量比为0.2-0.5:1。
13.所述的微针基质为明胶与单宁酸交联产物(gel-tan)，由明胶中的氨基与羧基与单宁酸中的羟基发生交联反应而得，制备方法包括以下步骤：
14.(1)将单宁酸溶液缓慢滴加到明胶溶液中，调节ph至5-6，45-65℃反应2-16h；
15.(2)反应液中加入甘油并搅拌均匀。
16.所述单宁酸、甘油和明胶的质量比为0.02-0.05:0.05-0.2:1，优选为0.04:0.1:1；所述的明胶溶液浓度为100-200mg/ml，所述的单宁酸溶液浓度为40-80mg/ml。
17.优选的，步骤(1)中，ph调节至5.5，50-60℃反应2-16h。
18.所述肉桂油纳米胶囊为利用阳离子诱导的海藻酸盐的可控凝胶作用制备而得，制备方法包括以下步骤：
19.(a)将肉桂油与磷脂溶解于醇，加入到海藻酸钠溶液中，超声分散，得到o/w乳液；
20.(b)氯化钙溶液滴加到步骤(a)的o/w乳液中，搅拌15-60min；
21.(c)步骤(b)的溶液中滴加壳聚糖溶液，滴加后继续搅拌，静置；
22.(d)分离取沉淀即为肉桂油纳米胶囊。
23.所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰胆碱，且磷脂纯度大于95％，更优选为大于98％。
24.优选的，所述的醇为乙醇。
25.所述的肉桂油与磷脂、氯化钙和壳聚糖的重量比为4-6:1:0.4-0.6:0.2-0.4，步骤(a)所述的海藻酸钠溶液浓度为0.3-1mg/ml，肉桂油与醇的用量比为30-60mg/ml；步骤(b)所述的氯化钙溶液浓度为0.3-1mg/ml；步骤(c)所述的壳聚糖溶液浓度为0.3-1mg/ml。
26.所述的肉桂油按照药典之规定制取，是肉桂的挥发油，其中桂皮醛的含量符合2020年版《中国药典》中关于肉桂油(cinnamon oil，cio)的质量标准规定。
27.优选的，步骤(a)中，海藻酸钠在纯水中以200-600rmp搅拌至溶解，制得海藻酸钠溶液；步骤(a)中，肉桂油与磷脂的醇溶液边超声边加入到海藻酸钠溶液中，混合后继续超声10-20min，再于冰浴条件下探头超声10-20min。
28.步骤(b)中，氯化钙以6-10ml/h的速度滴加到步骤(a)的o/w乳液中，滴加完毕后，200-500rpm继续搅拌20-40min。
29.步骤(c)中，壳聚糖用0.5％-2％醋酸水溶液溶解，并调节ph至4.5-5.5，优选的ph值为5；并且壳聚糖溶液以8-15ml/h的速度边搅拌边加入到步骤(b)的溶液中，滴加完毕后，200-500rpm继续搅拌2-6h，静置8-16h。
30.步骤(d)中，100000-150000
×
g离心45-120min，取沉淀。
31.上述针药一体化水凝胶微针的制备方法，步骤包括：将药物溶液与微针基质溶液混匀后成型并干燥。
32.药物为肉桂油纳米胶囊时，肉桂油纳米胶囊水凝胶微针的制备方法步骤包括：将肉桂油纳米胶囊溶液与微针基质溶液混匀后成型并干燥。具体为：肉桂油纳米胶囊溶液与微针基质溶液混合均匀，再浇铸于微针模具内，经减压入模、真空干燥后脱模制成。
33.采用明胶与单宁酸交联得到的微针基质，易于成型和脱模，机械强度好，溶胀性高。纳米胶囊的载入可以加强微针的强度。
34.上述肉桂油纳米胶囊水凝胶微针可用于制备治疗寒凝血瘀型痛经的药物。利用这种微针能够实现针药一体化治疗策略。本发明的微针可将肉桂油纳米胶囊递送至穴区深部，同时，水凝胶微针吸水溶胀，不断地刺激穴区组织，激发穴区效应，达到针刺疏通经络、行气散瘀、止痛等的治疗效果。
35.纳米胶囊(nanocapsules,ncs)技术利用高分子聚合物薄膜将微量的药物分子包埋封装，其中被包埋的物质被称为芯材，包覆芯材的高分子聚合物被称为壁材。一般纳米胶囊粒径为纳米级别，其纳米尺寸效应使其具有良好的生物相容性、靶向性以及缓释性。壳聚糖(chitson,cs)是甲壳素的n-脱乙酰化产物，是一种线性多糖，由氨基葡萄糖和n-乙酰氨基葡萄糖单元通过β-(1
→
4)糖苷键连接。壳聚糖经脱乙酰处理后，能在酸性介质中溶解，由于其主链上的氨基质子化而成为唯一一种具有高正电荷密度的多糖。壳聚糖还具有如无毒性、生物相容性和生物降解性等特点。海藻酸钠(sodium alginate,sa)是从褐藻和海藻中提取的一种天然多糖，它是一种水溶性线性多糖，羧酸基团使海藻酸盐带负电荷，因此能够与带正电荷的分子静电作用。本发明中，以海藻酸钠与钙离子交联产物作为纳米胶囊外壳，以肉桂油作为内核，通过离子凝胶法制备肉桂油纳米胶囊，并以壳聚糖修饰。以明胶与单宁酸交联产物作为水凝胶微针基质，将肉桂油纳米胶囊与微针基质混合均匀，浇铸法制备水凝胶微针，可以较好地包载肉桂油，用于脐区给药，可将肉桂油纳米胶囊递送至穴区深部更好地发挥药效。
36.本发明提供一种新型针药一体化微针，可用于穴位治疗，以微针作为载体，包载中药提取物及其制剂，尤其是中药提取物的纳米胶囊，同时给予穴区针刺和给药，发挥针刺和药物治疗的综合效应。
37.本发明所制备的肉桂油纳米胶囊水凝胶微针(hfmns-cio@ncs)用于脐区(神阙穴)给药治疗寒凝血瘀型痛经，经脐部穴区(神阙穴)可将肉桂油纳米胶囊递送至穴区深部，同时，水凝胶微针吸水溶胀，不断地刺激穴区组织，激发穴区效应，达到针刺疏通经络、行气散瘀、止痛等的治疗效果。
38.与现有技术相比，本发明有益效果为：
39.以明胶与单宁酸交联产物作为水凝胶微针基质，易于成型和脱模，机械强度好，溶胀性高。而且纳米胶囊的载入可以加强微针的强度。载肉桂油纳米胶囊时，以壳聚糖与海藻酸钠形成的壳-核结构包载肉桂油，形成肉桂油纳米胶囊；采用明胶与单宁酸交联产物作为微针基质，包载肉桂油纳米胶囊，制备成的肉桂油纳米胶囊水凝胶微针不但可将肉桂油纳米胶囊递送到穴区皮肤深层，充分发挥肉桂油温中散寒的作用，同时微针本身吸水溶胀，能够刺激穴区组织，激发穴区效应，达到治疗目的。肉桂油纳米胶囊水凝胶微针脐部给药可以改善寒凝血瘀型痛经模型大鼠的寒凝症的症状，延长扭体潜伏期，减少扭体次数及扭体评分，显著升高子宫组织pge2含量，降低pgf2α含量及pgf2α/pge2比值，显著增加神阙穴区肥大细胞个数与肥大细胞脱颗粒率，从而显著提高对大鼠寒凝血瘀型痛经的治疗作用。
40.利用本发明的微针可实现针药一体化治疗策略，可望利用微针担载游离药及其制剂，包载多种药物及其制剂，进一步地用于穴位疗法的临床治疗，值得临床推广使用；另外，本发明的微针制备方法简单，无需特殊设备和苛刻条件，易于实现规模化生产，具有极强的
实用价值。
附图说明
41.图1是本发明实施例2制备的肉桂油纳米胶囊的透射电镜图；
42.图2是本发明实施例3制备的肉桂油纳米胶囊水凝胶微针扫描电镜图，其中：a放大倍数为100倍，b放大倍数为350倍；
43.图3是本发明实施例3制备的载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针(gb-tan-mns-cio@ncs)以及对照的未载药的空白水凝胶微针(gb-tan-mns)机械强度测试图谱；
44.图4是本发明实施例3制备的载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针(gb-tan-mns-cio@ncs)以及对照的未载药的空白水凝胶微针(gb-tan-mns)溶胀性测试图谱；
45.图5是本发明实施例3制备的罗丹明b标记的空白微针贴片刺入大鼠离体皮肤光学照片；
46.图6是本发明实施例4获得的大鼠神阙穴区肥大细胞甲苯胺蓝染色光镜照片，其中：(a，b)为空白组，c为模型组，d为针灸组，e为空白微针组，f为载药微针组。
具体实施方式
47.以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
48.实施例1肉桂油纳米胶囊的制备
49.1.1肉桂油的提取
50.参照2020年版《中国药典》规定之肉桂药材，称取200.2g肉桂药材，粉碎成20目的粗粉，加8倍量的水，浸泡1h，200℃水蒸气蒸馏法提取6h，收集挥发油，得3ml肉桂挥发油。采用hplc检测，肉桂挥发油中桂皮醛含量为93.1
±
4.45％，符合2020年版《中国药典》中关于肉桂油(cinnamon oil，cio)的质量标准规定。
51.1.2肉桂油纳米胶囊的制备
52.称取60mg海藻酸钠加纯化水至100ml配制成浓度为0.6mg
·
ml-1
的溶液，60℃加热并，300rpm搅拌30min至溶解，加1％醋酸水溶液调节ph至5.5，备用。
53.称取120mg肉桂油与24mg大豆卵磷脂(纯度98.6％)，加入2ml乙醇搅拌均匀。上述溶液边超声分散边加入上述海藻酸钠溶液中，继续超声15min，然后探头超声15min(冰浴)，得到蓝色乳光的o/w乳液。
54.称取12mg氯化钙，加纯化水20ml配制成0.6mg
·
ml-1
的溶液。将氯化钙溶液以8.5ml
·
h-1
的速度边搅拌(1000rpm)边滴入上述o/w乳液中，滴加完毕以300rpm继续搅拌30min。
55.称取6mg壳聚糖以10ml1％醋酸水溶液溶解，配制成浓度为0.6mg
·
ml-1
的溶液，以4％naoh溶液调节ph至5.0。然后将壳聚糖溶液以10ml
·
h-1
的速度边搅拌(1000rpm)边滴入上述海藻酸钠溶液中，滴加完毕以300rpm继续搅拌3h，静置过夜，140,000
×
g离心60min，除去上清，沉淀加20ml纯化水分散，即得肉桂油纳米胶囊(cio@ncs)，4℃贮存备用。
56.实施例2载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针的制备
57.1.3载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针的制备
58.称取4g明胶，加入15ml纯化水，于55℃加热，搅拌(300rpm)1h至全溶。称取160mg单宁酸，加入5ml纯化水，300rpm搅拌溶解。将单宁酸溶液缓慢滴加入明胶溶液中，以1％氢氧化钠溶液调节ph至5.5，于55℃加热反应4h。向明胶-单宁酸溶液中加入400mg甘油，搅拌均匀，得水凝胶微针基质。
59.取20ml肉桂油纳米胶囊溶液，与2ml水凝胶微针基质搅拌混匀，取1ml浇铸于洁净的微针模具中，
–
0.08mpa真空环境下放置15min，刮去上层未入模基质，同时补充新的基质溶液。于30℃干燥箱中干燥完全，脱模即得载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针(hfmns-cio@ncs)
60.实施例3载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针(hfmns-cio@ncs)的评价与表征
61.3.1 hfmns-cio@ncs的形态表征
62.取干燥后的hfmns-cio@ncs，表面均匀喷洒金粉，真空条件置于扫描电子显微镜下对其进行形态学观察。
63.图2是本发明实施例3制备的载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针扫描电镜图，其中，a放大倍数为100倍，b放大倍数为350倍。由图2可见，hfmns-cio@ncs脱模率达100％，脱模后针尖完整无破损，针体呈金字塔型，由四面锥型针体组成，基底厚度均一，阵列排列整齐。微针贴片为正方形，边长1.4cm，其中微针阵列为10
×
10，微针基底长度约为600μm，宽度约为600μm，微针高度约1450μm。微针基底间距为600μm，针尖间距为900μm。
64.3.2 hfmns-cio@ncs的机械强度
65.分别取干燥后的hfmns-cio@ncs，确保针体形态完好、基底平整均一。针体向上置于质构仪的测试板，设置直径为5mm的圆柱探头以30mm/min的速度压缩微针，直到挤压形变量为40％。初始触发力为0.05n，绘制微针的力—位移曲线。
66.图3是本发明实施例3制备的载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针机械强度测试图谱，由图3可见，载药前后bsp复合微针的机械强度均可达18n以上。由于微针模具为11
×
11阵列，计算hfmns和hfmns-cio@ncs的机械强度分别为0.15n/针、0.18n/针，即纳米胶囊的载入使微针强度略有增加。
67.3.3 hfmns-cio@ncs的溶胀性
68.取空白微针贴片(hfmns)与载药微针贴片(hfmns-cio@ncs)，记录初始质量w
l
。依次用聚四氟乙烯膜和锡箔纸包裹不同处方的微针片，使针尖露出。在24孔板的每个孔内加入pbs 0.7ml，将包裹好的微针贴片倒置于孔内，使露出的针尖浸没在水中。于5、15、30、60、90min时将微针贴片从24孔板内取出，擦干表面多余水分后称定，将0时的质量记为w0，t时记为w
t
，以(w
t-w0)/w
l
表示微针贴片在t时的溶胀率，上述试验每组样品重复3次。分别以t为横坐标、溶胀率为纵坐标作图，考察载药对微针溶胀率的影响。
69.图4是本发明实施例3制备的载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针溶胀性测试图谱，由图4可见，空白微针在30min时溶胀率达350％，之后溶胀速度逐渐减小，趋于平缓，在90min时溶胀率约430％。而微针载药后溶胀率略有升高，在30min时溶胀率即达390％，且在90min时达到470％，其溶胀程度以及溶胀速度均优于空白微针。
70.3.4微针皮肤刺入性
71.取sd大鼠，10％水合氯醛麻醉，用剃毛刀腹部脱毛，生理盐水擦洗，手术刀剥离腹部皮肤，剔除皮下组织和脂肪，生理盐水洗净，-4℃冰箱中保存，一周内使用。
72.采用水溶性染料罗丹明b标记空白微针基质，制备罗丹明标记的微针。以手按压于大鼠离体皮肤表面，维持5min，取下微针贴片，观察微针刺入皮肤的能力。
73.图5是本发明实施例3制备的罗丹明b标记的空白微针贴片刺入大鼠离体皮肤光学照片，由图5可见，微针可以成功刺入大鼠离体皮肤。
74.实施例4载肉桂油纳米胶囊的水凝胶微针(hfmns-cio@ncs)对寒凝血瘀型痛经模型大鼠的镇痛效应研究
75.4.1动物分组
76.雌性sd大鼠，体质量180～220g，为以下四组：(1)空白对照组，(2)模型组，(3)脐部针灸组，(4)空白微针脐部治疗组，(5)载肉桂油纳米胶囊微针脐部刺治疗组。除空白对照组外，模型组与各治疗组在造模成功后再分组。
77.4.2寒凝血瘀型痛经模型的制备
78.按照文献方法(中华中医药学会.痛经动物模型制备规范(草案)[j].中国实验方剂学杂志，2018)建立寒凝血瘀型痛经大鼠模型。连续给予动物苯甲酸雌二醇，提高子宫敏感性；再注射缩宫素，产生类似痛经反应。冰水浴可致动物出现体温降低。
[0079]
模型组及治疗组大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇，每天1次，连续10d；第1，10天剂量为2.5mg
·
kg-1
，其余时间的剂量均为1mg
·
kg-1
；同时每天将大鼠置于冰水浴中10min，为促进血瘀模型的形成，可在第11天给大鼠皮下注射2次盐酸肾上腺素(8μg
·
kg-1
)，间隔2h，在第2次注射盐酸肾上腺素后，将动物置于冰水中5min，5min后将大鼠拿出放回笼子中饲养。第12天大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇1h后，立即腹腔注射缩宫素(剂量10u
·
kg-1
)，制备成雌激素与缩宫素联用冰水浴大鼠痛经模型。观察大鼠扭体反应行为，判断造模成功。
[0080]
空白对照组正常饲食，自由饮水，不做任何治疗，于造模第1-10天，每天给予股部皮下注射生理盐水，第1天0.25ml/只，第2-9天0.1ml/只，第10天0.25ml/只，第11天皮下注射2次，每次0.1ml/只，间隔2h。第12天皮下注射生理盐水0.25ml/只，1h后，立即腹腔注射缩宫素(剂量10u
·
kg-1
)，观察大鼠扭体反应行为。
[0081]
4.3取穴方法
[0082]
按照文献方法(纪峰.成年雌性大鼠“神阙”穴定位方法探析[c].第十七届针灸对机体功能的调节机制及针灸临床独特经验研讨会会议论文集,2014)采用“比较解剖取穴法”取大鼠神阙穴：下肢自然松弛和部分拉伸状态下,大鼠“神阙”穴位于第4,5对乳头中点连线约上1/3处。下肢完全拉伸的情况,“神阙”穴基本上与第4对乳头平行。
[0083]
4.4治疗方法
[0084]
于造模第5天给予大鼠吸入异氟烷麻醉，大鼠麻醉后用电动剃毛刀剔除大鼠神阙穴周围粗毛，然后以脱毛膏除去神阙穴周围细毛。于造模第6天给予大鼠治疗，每日治疗1次，共治疗7次。
[0085]
4.4.1皮内法
[0086]
大鼠仰卧固定后，把神阙穴看做表盘，采用皮内针，取6点位，向相应的穴区方位横刺，用医用胶布固定，留针30分钟，进针深度4-5mm。
[0087]
4.4.2微针法
[0088]
将大鼠仰卧固定，将空白或载药微针置于大鼠神阙穴穴区，以手按压1min，使微针刺入大鼠神阙穴，以医用胶布固定，留针30min。
[0089]
空白组与模型组与上述各组做同步抓取、固定，不做治疗。
[0090]
4.5指标检测
[0091]
4.5.1大鼠状态变化
[0092]
记录大鼠饮食、体重，观察大鼠毛发色泽，动作行为，精神状态。
[0093]
造模过程中，模型组体重维持稳定或逐渐减轻，后期出现蜷缩少动，喜扎堆，偶有寒战，朦胧欲睡，两眼无神，反应迟钝，被毛蓬松竖立无光泽，耳部、四肢、尾部等部位肤色呈现粉紫红，大便湿润，粪质变软。根据杨佳敏(寒凝血瘀证动物模型制备方法的评价与选择[j].中医学报，2014)，造模大鼠寒症表征评分为中度。各治疗组大鼠前期造模过程中状态与模型组相同，后期治疗过程中症状有所改善，体重维持稳定或逐渐增长，精神好转，毛发转亮，耳部、四肢、尾部等部位肤色呈现粉红，大便稍湿润，粪质稍变软。
[0094]
4.5.2扭体反应
[0095]
观察空白组、模型组腹腔注射缩宫素20min内大鼠出现扭体反应的潜伏期、扭体次数及扭体评分。针灸组、空白微针脐部治疗组及载肉桂油纳米胶囊微针脐部治疗组最后一次治疗后，腹腔注射缩宫素，观察20min内每组大鼠出现扭体反应的潜伏期、扭体次数及扭体评分。
[0096]
根据schmauss(in vivo studies on spinal opiate receptor systems mediating antinociceptionⅱpharmacological profiles suggesting a differential association of mu，delta and kappa receptors with visceral chemical and cutaneous thermal stimuli in the rat[j].j pharmacol exp ther，l984)提出的行为学评分标准，将扭体行为分为0～3四个等级。0级：正常姿势(手爪平放盒底或正常探查行为)；1级：身体斜向一边；2级：后肢伸展，后爪背屈，躯体伸展伴频繁地盆骨侧向旋转；3级：腹部肌肉收缩，后肢后伸。扭体潜伏期为注射缩宫素后至出现扭体反应的时间；扭体评分＝0级(次数)
×
0分+1级(次数)
×
1分+2级(次数)
×
2分+3级(次数)
×
3分。结果如表1所示。
[0097]
与空白组相比，模型组大鼠扭体反应潜伏期明显缩短，扭体次数及扭体评分显著性增加，表明寒凝血瘀型大鼠痛经模型造模成功。与模型组相比，脐部针灸治疗组扭体次数显著减少(p﹤0.05)，空白微针脐部治疗组扭体次数及扭体评分显著降低(p﹤0.05)，载肉桂油纳米胶囊的微针脐部治疗组扭体潜伏期显著延长(p﹤0.05)，扭体次数及扭体评极显著性降低(p﹤0.01)，表明各治疗组对寒凝血瘀型痛经模型大鼠均具有一定的治疗作用，其中，载肉桂油纳米胶囊的微针脐部治疗组治疗效果最显著。
[0098]
表1各组大鼠扭体反应比较(n＝6)
[0099]
[0100]
注：与空白组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与模型组比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01。
[0101]
4.5.3 elisa法测定大鼠子宫组织内前列腺素e2(pge2)、前列腺素f2α(pgf2α)含量
[0102]
注射缩宫素1h后，大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠1.0ml(150mg/kg)麻醉，于无菌工作台冰盘上迅速摘取子宫，称重，样品置于-80℃冰箱保存待用。
[0103]
临用前将子宫样品取出，室温下解冻。取适量样品加生理盐水制成10％的子宫组织匀浆，以3000r/min低温离心15min，取上清液，按照elisa试剂盒说明书方法测定pge2、pgf2α含量。结果如表2所示。
[0104]
与空白组相比，模型组pgf2α含量极显著性升高(p﹤0.01)，pgf2α/pge2比值显著性增大(p﹤0.05)，表明寒凝血瘀型大鼠痛经模型造模成功。与模型组相比，脐部针灸治疗组与空白微针脐部治疗组pgf2α含量极显著性减少(p﹤0.01)，pgf2α/pge2比值显著性减小(p﹤0.05)，载肉桂油纳米胶囊的微针脐部治疗组pge2含量极显著性增加(p﹤0.01)，pgf2α含量及pgf2α/pge2比值显著性减小(p﹤0.05)，表明各治疗组对低寒凝血瘀型痛经模型大鼠均有一定的治疗作用，其中载肉桂油纳米胶囊的微针脐部治疗组治疗效果最显著。
[0105]
表2各组大鼠子宫pge2、pgf2α含量及pgf2α/pge2比值比较(n＝6)
[0106][0107]
注：与对照组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与模型组比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01。
[0108]
4.5.4穴区肥大细胞数目、脱颗粒率
[0109]
注射缩宫素1h后，大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠1.0ml(150mg/kg)麻醉，于无菌工作台冰盘上迅速取大鼠神阙穴区皮肤连同皮下肌肉组织(3mm
×
3mm
×
3mm)，生理盐水冲洗，以4％多聚甲醛固定，用于甲苯胺蓝染色，在10
×
40倍光镜下拍摄照片，结果如图6所示。每只大鼠穴区取3张组织切片，随机选取3个视野，肌层1个视野、筋膜层2个视野，于10
×
20倍光镜下观察切片肥大细胞形态并计数(包括完整的和脱颗粒的)，计数结果以“个数/高倍视野(个/hpf)”表示，结果如表3所示。
[0110]
表3大鼠神阙穴区肥大细胞计数、脱颗粒率比较(n＝6)
[0111][0112]
注：与对照组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与模型组比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01。
[0113]
图6为本发明实施例4所得大鼠神阙穴区肥大细胞甲苯胺蓝染色光镜照片，其中：a、b.空白组c.模型组，d.针灸组e.空白微针组f.载药微针组；由图6与表3可知，与空白组相比，模型组大鼠神阙穴区肥大细胞个数与肥大细胞脱颗粒率明显增多，具有统计学差异(p《0.05)。与模型组比较，各治疗组神阙穴区肥大细胞个数与肥大细胞脱颗粒率极显著性增多(p《0.01)。
[0114]
由上述可见，本发明提供的一种针药一体化治疗策略可将药物递送至穴区皮肤深层，发挥其在穴区的治疗作用，同时微针针体吸水溶胀，能够刺激穴区组织，激发穴区效应，达到治疗目的。肉桂油纳米胶囊水凝胶微针脐部给药可以改善寒凝血瘀型痛经模型大鼠的症状，延长扭体潜伏期，减少扭体次数及扭体评分，显著升高子宫组织pge2含量，降低pgf2α含量及pgf2α/pge2比值，显著增加神阙穴区肥大细胞个数与肥大细胞脱颗粒率，说明肉桂油纳米胶囊水凝胶微针脐部给药可以发挥经穴针刺效应，对改善寒凝血瘀型痛经的症状具有重要作用。该针药一体化治疗策略可望利用微针包载游离药及其制剂，进一步地用于穴位疗法的临床治疗，值得临床推广使用。

技术特征：
1.一种针药一体化水凝胶微针，其特征在于，微针基质为明胶与单宁酸交联产物形成的水凝胶，基质内包载药物。2.根据权利要求1所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，所述的药物为肉桂油纳米胶囊，粒径为50～500nm，其中桂皮醛的载药量为26wt％～36wt％。3.根据权利要求1所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，分别以明胶和肉桂油用量计，微针基质与肉桂油纳米胶囊的质量比为0.2-0.5:1。4.根据权利要求1所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，所述的微针基质的制备方法包括以下步骤：(1)将单宁酸溶液缓慢滴加到明胶溶液中，调节ph至5-6，45-65℃反应2-16h；(2)反应液中加入甘油并搅拌均匀。5.根据权利要求4所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，所述单宁酸、甘油和明胶的质量比为0.02-0.05:0.05-0.2:1；所述的明胶溶液浓度为100-200mg/ml，所述的单宁酸溶液浓度为40-80mg/ml。6.根据权利要求1或2所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，所述肉桂油纳米胶囊的制备方法包括以下步骤：(a)将肉桂油与磷脂溶解于醇，加入到海藻酸钠溶液中，超声分散，得到o/w乳液；(b)氯化钙溶液滴加到步骤(a)的o/w乳液中，搅拌15-60min；(c)步骤(b)的溶液中滴加壳聚糖溶液，滴加后继续搅拌，静置；(d)分离取沉淀即为肉桂油纳米胶囊。7.根据权利要求6所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰胆碱。8.根据权利要求6所述的针药一体化水凝胶微针，其特征在于，所述的肉桂油与磷脂、氯化钙和壳聚糖的重量比为4-6:1:0.4-0.6:0.2-0.4，步骤(a)所述的海藻酸钠溶液浓度为0.4-0.8mg/ml，肉桂油与醇的用量比为40-100mg/ml；步骤(b)所述的氯化钙溶液浓度为0.4-1mg/ml；步骤(c)所述的壳聚糖溶液浓度为0.4-1mg/ml。9.权利要求1-8任一项所述针药一体化水凝胶微针的制备方法，其特征在于，步骤包括：将药物溶液与微针基质溶液混匀后成型并干燥。10.权利要求2-8任一项所述的针药一体化水凝胶微针在制备治疗寒凝血瘀型痛经的药物方面的应用。

技术总结
本发明涉及医药技术领域，公开了一种针药一体化的水凝胶微针。微针基质为明胶与单宁酸交联产物形成的水凝胶，基质内包载药物，药物为肉桂油纳米胶囊。这种肉桂油纳米胶囊水凝胶微针(HFMNs-CIO@NCs)可以较好地包载肉桂油纳米胶囊(CIO@NCs)，并将CIO@NCs递送到穴区皮肤深层，充分发挥肉桂油温中散寒的作用，同时微针本身吸水溶胀，能够刺激神阙穴区组织，激发穴区效应，改善寒凝血瘀型痛经模型大鼠的寒凝症的症状。这种针药一体化水凝胶微针可用于多种包载药物及其制剂，进一步地用于穴位疗法的临床治疗，具有临床推广使用价值。具有临床推广使用价值。具有临床推广使用价值。


技术研发人员：张永太 冯年平 侯晓琳 王志 郭腾
受保护的技术使用者：上海中医药大学
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8