线粒体分子标记引物及用于早期鉴定烟草品种种子来源的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及线粒体分子标记引物及用于早期鉴定烟草品种种子来源的应用技术领域。


背景技术：

2.植物细胞质雄性不育(cytoplasmic malesterility,cms)是由细胞质基因控制的雄蕊发育异常或花粉败育的现象，在作物杂种优势利用中具有重要的作用。细胞质雄性不育系在烟草育种和烟草生产上具有很重要的价值，目前已经有三十多种雄性不育系被开发出来，但其中多数胞质类型对烟草的产量性状或烟叶质量有负面影响。sua-cms的不育细胞质来源于n.suaveolens，是由烟草和苏云金杆菌体细胞融合得到的，因其对烟草综合性状没有明显的不良影响，目前已成为我国烟草生产中使用最广泛的不育胞质类型。然而生产上使用的不育胞质类型过于单一会造成遗传基础脆弱，生产风险增大。gla-cms是来源于n.glauca 的另一种不育细胞质，经过胞质效应评价，gla-cms和可育烟草相比在农艺性状和主要病害抗性方面没有太多显著性差别，具有用于杂交育种和杂交种生产的潜力。
3.形态学观察是鉴定细胞质雄性不育的重要手段，但存在不能早期鉴定问题。烟草种子的管控非常严格，烟草生产上的种子包含常规种和不育系种子。常规种可以自花授粉，生产种子，下一代能够继续种植。烟草不育系种子是细胞质雄性不育类型，由细胞质基因控制的雄蕊发育异常或花粉败育，无法自交授粉，无种子产生。然而，烟农种植的时候，可能将收获种植的常规种种子，用于下一年度的烟草种植，冒充不育系种子，而在烟草植株开花之前，无法用肉眼辨别该植株的育性情况，因此，严重影响烟草生产双控政策，对烟叶生产的可持续发展发出挑战。
4.利用分子标记对细胞质雄性不育系进行鉴定可以克服上述问题，具有准确、快速、稳定等优点。cn102199655a公开了一种特异的caps标记，可以区分烟草big、gla和sua三种不同的不育细胞质类型，cn113151537a公开了烟草细胞质雄性不育系tab1-cms的特异分子标记，两者都是针对叶绿体基因组上的特异序列开发的共显性标记。cn108823329a公开了烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记，是在线粒体基因组的特异序列上开发的显性标记。目前尚未见到有关鉴定烟草gla-cms胞质雄性不育系线粒体显性分子标记的技术报道。


技术实现要素：

5.本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一系列线粒体分子标记引物及用于早期鉴定烟草品种种子来源的应用。
6.本发明采用如下技术方案实现。
7.线粒体分子标记引物，本发明该分子标记的引物组为：如seq id no：1和 seq id no：2所记述。
8.本发明上述线粒体分子标记引物在标记烟草保持系/不育系中的应用。
9.本发明所述的应用包括使用该引物针对烟草保持系进行pcr扩展，扩展出的特异性条带序列为154bp。
10.本发明所述的应用包括使用该引物对烟草sua-cms不育系进行pcr扩展，扩展出的特异性条带序列为149bp。
11.本发明所述的应用包括使用该引物对烟草gla-cms不育系进行pcr扩展，扩展出的特异性条带序列为162bp。
12.本发明所述的应用包括使用该引物对烟草保持系k326、hd进行pcr扩展，扩展出的特异序列如seq id no:5所示。
13.本发明所述的应用包括使用该引物对烟草sua-cms不育系suak326、suahd 进行pcr扩展，扩展出的特异序列如seq id no:3所示。
14.本发明所述的应用包括使用该引物对烟草gla-cms不育系glak326、glahd 进行pcr扩展，扩展出的特异序列如seq id no:4所示。
15.本发明所述的pcr反应的反应体系为总计10μl：模板dna(100ng/μl) 1μl、2
×
taq master mix(vazyme，中国)5μl、正向引物(10ng/μl)0.5μl、反向引物(10ng/μl)0.5μl、ddh2o 3μl；所述的pcr反应的反应程序为： 94℃预变性，2min；95℃变性，15s；57℃退火，15s；72℃延伸，30s；72℃， 5min；其中变性、退火、延伸设置35个循环。
16.本发明的有益效果为，(1)本发明提供的烟草细胞质雄性不育系sua-cms 和gla-cms特异性分子标记，可以应用于sua型和gla型烟草细胞质雄性不育系的鉴定和分子标记辅助育种。(2)本发明提供的烟草细胞质雄性不育系sua-cms 和gla-cms特异性分子标记，是一种共显性标记，其准确性比显性标记更高。(3) 本发明提供的烟草细胞质雄性不育系sua-cms和gla-cms特异性分子标记应用方法，程序简单，结果稳定可靠，易于规模化应用。
17.下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
18.图1为本发明特异性分子标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
19.图2为本发明标记hgs2可以区分3种不同类型的胞质的区分图。
20.图3为本发明实施例2聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
21.材料
22.烟草sua-cms不育系：suak326、suahd，
23.gla-cms不育系：glak326、glahd，
24.及对应的保持系：k326、hd。
25.实施例1
26.把烟草sua-cms、gla-cms不育系和对应的保持系进行线粒体dna测序并组装，在三者共线性区域搜索indel差异，并设计特异的分子标记引物，所述分子标记引物的序列如下：
27.hgs-f：5
’‑
tggtgtaataaaccgcaagc-3’(核苷酸序列如seq id no：1所述)
28.hgs-r：5
’‑
tccaaacaaaggcgaacatc-3’(核苷酸序列如seq id no： 2所述)
29.所述分子标记引物在sua-cms不育系中扩增出特异序列如seq id no:3所示，
30.在gla-cms不育系中扩增出特异序列如seq id no:4所示，
31.在保持系中扩增出特异序列如seq id no:5所示。
32.选用烟草sua-cms不育系suak326、suahd，gla-cms不育系glak326、glahd，及对应的保持系k326、hd材料，用植物基因组dna提取试剂盒 (tiangen biotech，中国)提取叶片总dna。
33.以提取的叶片基因组dna为模板，以引物hgs-f和hgs-r进行pcr扩增，pcr反应体系(10ul)如下：
34.模板dna(100ng/μl) 1μl，
[0035]2×
taq master mix(vazyme，中国) 5μl
[0036]
正向引物(10ng/μl) 0.5μl，
[0037]
反向引物(10ng/μl) 0.5μl
[0038]
ddh2o 3μl。
[0039]
pcr扩增程序为：
[0040]
95℃预变性2min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，进行 35个循环；72℃延伸5min。
[0041]
用8％浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，使用2-9v/cm的电压电泳1 小时。电泳结束后，将凝胶片在银染液(1l蒸馏水+2g硝酸银)中染色10min。染色结束后，将凝胶片放在显影液(1l蒸馏水+20gnaoh+0.4gna2co3+4ml 甲醛)中显色，至条带清晰。之后在观片灯上读取条带，并拍照保存。
[0042]
结合图1、图2所示，图2为标记hgs2可以区分3种不同类型的胞质。
[0043]
其中泳道1为sua-k326，泳道2为sua-hd，泳道3为gla-k326，泳道4为 gla-hd，泳道5为k326，泳道6为hd。
[0044]
在sua-cms不育系材料suak326、suahd中可以扩增出149bp的特异性条带，
[0045]
在gla-cms不育系材料glak326、glahd中可以扩增出162bp的特异性条带，
[0046]
在保持系k326、hd中可以扩增出154bp的特异性条带，说明分子标记hgs 可以特异性地区分烟草sua-cms、gla-cms和保持系材料。
[0047]
序列信息
[0048]
》seq id no:1hgs-f(20bp)
[0049]
tggtgtaataaaccgcaagc
[0050]
》seq id no:2hgs-r(20bp)
[0051]
tccaaacaaaggcgaacatc
[0052]
》seq id no:3(149bp)
[0053]
tggtgtaataaaccgcaagcccttcagaaagaaagacataatataataatg aattaattaataaaaaaaaaaaagggttggttaagaactattgactgtaaa ccatagcagttacagtcactcaatggagatgttcgcctttgtttgga
[0054]
》seq id no:4(162bp)
[0055]
tggtgtaataaaccgcaagcccttcagaaagaaagacataatataataatg aattaattaatattaattaataaaaaaaaaaaaaaagggttggttaagaac tattgactgtaaaccatagcagttacagtcactcaatgga
gatgttcgcctt tgtttgga
[0056]
》seq id no:5(154bp)
[0057]
tggtgtaataaaccgcaagcccttcagaaagaaagacataatataataatg aattaattaataaaaaaaaaaaaaaaaagggttggttaagaactattgac tgtaaaccatagcagttacagtcactcaatggagatgttcgcctttgtttg ga
[0058]
实施例2(部分失败案例展示)
[0059]
图2说明：
[0060]
引物顺序及内容：
[0061][0062][0063]
样品顺序：sua-k326，sua-hd，gla-k326，gla-hd，k326，hd
[0064]
其余试验参数同上。
[0065]
试验证明hgs2引物对了可以作为线粒体分子标记引物，且用于早期鉴定烟草品种种子来源。
[0066]
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.线粒体分子标记引物，其特征在于，该分子标记的引物组为：如seq id no：1和seq id no：2所记述。2.权利要求1所述线粒体分子标记引物在标记烟草保持系/不育系中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，该应用包括使用该引物针对烟草保持系进行pcr扩展，扩展出的特异性条带序列为154bp。4.如权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用包括使用该引物对烟草sua-cms不育系进行pcr扩展，扩展出的特异性条带序列为149bp。5.如权利要求5所述的应用，其特征在于，该应用包括使用该引物对烟草gla-cms不育系进行pcr扩展，扩展出的特异性条带序列为162bp。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用包括使用该引物对烟草保持系k326、hd进行pcr扩展，扩展出的特异序列如seq id no:5所示。7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用包括使用该引物对烟草sua-cms不育系suak326、suahd进行pcr扩展，扩展出的特异序列如seq id no:3所示。8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，该应用包括使用该引物对烟草gla-cms不育系glak326、glahd进行pcr扩展，扩展出的特异序列如seq id no:4所示。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的pcr反应的反应体系为总计10μl：模板dna100 ng/μl1μl、2
×
taq master mix5μl、正向引物10ng/μl0.5μl、反向引物10ng/μl0.5μl、ddh2o3μl；所述的pcr反应的反应程序为：94℃预变性，2min；95℃变性，15s；57℃退火，15s；72℃延伸，30s；72℃，5min；其中变性、退火、延伸设置35个循环。

技术总结
本发明涉及线粒体分子标记引物及用于早期鉴定烟草品种种子来源的应用，该分子标记的引物组为：如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所记述。该线粒体分子标记引物用于标记烟草保持系/不育系。(1)本发明提供的烟草细胞质雄性不育系sua-CMS和gla-CMS特异性分子标记，可以应用于sua型和gla型烟草细胞质雄性不育系的鉴定和分子标记辅助育种。(2)本发明提供的烟草细胞质雄性不育系sua-CMS和gla-CMS特异性分子标记，是一种共显性标记，其准确性比显性标记更高。(3)本发明提供的烟草细胞质雄性不育系sua-CMS和gla-CMS特异性分子标记应用方法，程序简单，结果稳定可靠，易于规模化应用。易于规模化应用。易于规模化应用。


技术研发人员：曾建敏 黄昌军 刘勇 袁诚 于海芹 童治军 方敦煌 肖炳光
受保护的技术使用者：云南省烟草农业科学研究院
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2022/3/8