一种四型胶原蛋白的制作方法

一种四型胶原蛋白
ɑ
3的抗体、检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫检测技术领域，具体地，涉及一种四型胶原蛋白
ɑ
3的抗体、检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.遗传性肾炎，即阿尔波特综合征(alport综合征，as)是一种主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜疾病，是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分-iv胶原基因突变而产生的疾病。基因突变的发生率约为1/10000～1/5000。根据遗传方式可分为：
①
x连锁显性遗传(x-linkeddominant，xl，约占80％)，致病基因在x染色体上，遗传与性别有关。
②
常染色体隐性遗传(autosomalrecessive，ar；约占15％)，致病基因在常染色体上。
③
常染色体显性遗传(autosomaldominant，ad；极少数)。三种遗传方式分别因编码iv型胶原不同
ɑ
链的基因col4a5、col4a6、col4a3和/或col4a4突变所致。
3.遗传性肾炎的发病原因为：iv型胶原6条
ɑ
链聚合成3条三股螺旋分子结构称为单体，单体聚合形成二聚体或四聚体，再相互绞连形成胶原网状结构。x连锁显性遗传alport综合征得基因突变主要发生在编码iv型胶原
ɑ
5链的基因(col4a5)。常染色体隐性遗传alport综合征的基因突变则发生在2号染色体上编码iv型胶原
ɑ
3链或者
ɑ
4链的基因(col4a3/col4a4)上，而iv型胶原
ɑ
1链或iv型胶原
ɑ
2链的基因还是正常表达，即不管是遗传性肾小球肾炎还是正常肾小球，iv型胶原
ɑ
1链或iv型胶原
ɑ
2链都会正常表达。
4.目前对于遗传性肾炎的检测方法有：1、光镜检测。遗传性肾炎病理改变不具特征性，在电镜技术应用前，曾认为alport综合征属于慢性间质性肾炎，并误将肾间质泡沫细胞作为诊断依据。(2)应用特异性的抗iv型胶原不同
ɑ
链的抗体在肾脏以及皮肤组织进行免疫荧光检测，可以诊断x连锁显性遗传型男性、女性以及常染色体隐性遗传型alport综合征。(3)电镜观察：电镜下可观察到alport综合征特征性的病理改变，gbm广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变。
5.目前现有技术中有2类试剂盒用于遗传性肾炎的鉴别诊断：一类是瑞典公司的wieslabalprot’ssyndromekit。其试剂盒组成包含抗小鼠col4a1、col4a3的单克隆抗体及其对应的fitc偶联的小鼠二抗；抗大鼠col4a5的单克隆抗体及其对应的fitc偶联的大鼠二抗，该体系适用于免疫荧光细胞化学染色。另外该试剂盒还可用于石蜡包埋的组织，用于免疫组织化学染色，但是该方法需要分别对三个四型胶原蛋白抗体进行单独的ihc染色，方法比较复杂。另一类是日本cosmo公司的荧光免疫化学染色试剂盒，该方法使用col4a2和col4a5分别标记红色荧光和绿色荧光，再按照一定的配比作为一抗与肾组织上的抗原进行结合反应。使用荧光显微镜进行结果观察。理论上col4a2在肾小球及肾小管上均有基底膜的定位，col4a5的表达谱比较窄，正常情况下一般只定位在肾小球上，肾小管基本不染色。若病理存在遗传性肾炎(即alport综合征)，那么col4a5在肾小球上缺失表达。
6.目前，现有技术中缺少col4a3和col4a5重组兔单克隆抗体，同时应用于alport综
合征的col4a1重组兔单克隆抗体也明显不足。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供3个四型胶原蛋白即四型胶原蛋白α1(col4a1)、四型胶原蛋白α3(col4a3)、四型胶原蛋白α5(col4a5)单克隆抗体及其可变区序列，并由此组成病理诊断试剂盒，及其在alport综合征辅助诊断中的应用。为了达到该目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明第一方面提供一种col4a1单抗，所述col4a1单抗的重链可变区cdr-h1、 cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq idno:1～6所示。
9.本发明第二方面提供一种col4a3单抗，所述col4a3单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α3如seq id no:7所示的蛋白片段。在本发明的一些实施方案中，所述col4a3单抗利用氨基酸序列如seq id no:7所示的人col4a3蛋白多肽片段交联klh后免疫兔得到。
10.在本发明的一些实施方案中，所述col4a3单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、 cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:9～14 所示。
11.本发明第三方面提供一种col4a5单抗，所述col4a5单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α5如seq id no:15所示的蛋白片段。在本发明的一些实施方案中，所述col4a5单抗利用氨基酸序列如seq id no:15所示的人col4a5蛋白多肽片段经修饰并交联klh后免疫兔得到，优选地，所述修饰是指在多肽氨基酸序列氨基端添加一个半胱氨酸，以便于进行交联反应。
12.在本发明的一些实施方案中，所述col4a5单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、 cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:17～22 所示。
13.本发明第四方面提供一种检测四型胶原蛋白的抗体组合，所述抗体组合包括本发明第一方面所述的col4a1单抗，还包括本发明第二方面所述的col4a3单抗和/或本发明第三方面所述的col4a5单抗。
14.在本发明的一些实施方案中，所述抗体组合包括本发明第一方面所述的col4a1单抗，还包括任意方法制备或获得的col4a3抗体和/或任意方法制备或获得的col4a5抗体，优选地，所述抗体为单抗。
15.在本发明的另一些实施方案中，所述抗体组合包括本发明第二方面所述的col4a3单抗，还包括任意方法制备或获得的col4a1抗体，优选地，还包括任意方法制备或获得的 col4a5抗体，优选地，所述抗体为单抗。
16.在本发明的又一些实施方案中，所述抗体组合包括本发明第三方面所述的col4a5单抗，还包括任意方法制备或获得的col4a1抗体，优选地，还包括任意方法制备或获得的 col4a3抗体，优选地，所述抗体为单抗。
17.本发明第五方面提供本发明第一方面所述的col4a1单抗、本发明第二方面所述的 col4a3单抗、本发明第三方面所述的col4a5单抗或本发明第四方面所述的抗体组合在制备四型胶原蛋白免疫检测试剂盒中的应用。
18.在本发明的一些实施方案中，所述免疫检测选自包括免疫组织化学法、免疫荧光
法、酶联免疫法、免疫印迹法的组中的至少一种。
19.本发明第六方面提供一种四型胶原蛋白免疫检测试剂盒，所述试剂盒第一方面所述的 col4a1单抗、本发明第二方面所述的col4a3单抗、本发明第三方面所述的col4a5单抗或本发明第四方面所述的抗体组合。
20.在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒用于诊断alport综合征。
21.在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的col4a3单抗以及任意方法制备或获得的col4a1单抗，其中，所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与不同荧光素偶联，或者所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与不同酶标记物偶联。优选地，所述col4a1单抗为本发明第一方面所述的col4a1单抗。
22.在本发明的一些实施方案中，所述荧光素选自fitc、alexa fluor 488、gfp、fluo-3、 pe、pi、pe-cy5、pe-cy5.5、percp、percp-cy5.5、texas red、7-aad、pe-cy7、pe
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alexa fluor 750、apc、cy5、alexa fluor 647、alexa fluor 660、alexa fluor 700、apc-cy7、 apc-alexa fluor 750、hoechst33342-blue、dapi、hoechst33342-red、alexa fluor 405、 pacific blue和pacific orange中的两种。在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1 单抗和所述col4a3单抗分别与texas red和fitc偶联。
23.在本发明的一些实施方案中，所述酶标记物选自辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶 (ap)、β-半乳糖苷酶(β-gal)中的两种，在本发明的一些实施的实施方案中，所述 col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与hrp和ap偶联。
24.在本发明的另一些实施方案中，所述试剂盒包括本发明第三方面所述的col4a5单抗以及任意方法制备或获得的col4a1单抗，其中，所述col4a1单抗和所述col4a5单抗分别与不同荧光素偶联，或者所述col4a1单抗和所述col4a5单抗分别与不同酶标记物偶联。优选地，所述col4a1单抗为本发明第一方面所述的col4a1单抗。
25.在本发明的一些实施方案中，所述荧光素选自fitc、alexa fluor 488、gfp、fluo-3、 pe、pi、pe-cy5、pe-cy5.5、percp、percp-cy5.5、texas red、7-aad、pe-cy7、pe
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alexa fluor 750、apc、cy5、alexa fluor 647、alexa fluor 660、alexa fluor 700、apc-cy7、 apc-alexa fluor 750、hoechst33342-blue、dapi、hoechst33342-red、alexa fluor 405、 pacific blue和pacific orange中的两种。在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1 单抗和所述col4a5单抗分别与texas red和fitc偶联。。
26.在本发明的一些实施方案中，所述酶标记物选自hrp、ap、β-gal中的两种，在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与hrp和ap偶联。
27.在本发明的又一些实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第四方面所述的抗体组合，还包括：抗所述抗体组合的多抗，以及与所述抗体组合中单抗的数量和所述多抗的数量之和相等的荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。
28.在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的col4a1 单抗和本发明第二方面所述的col4a3单抗组成的抗体组合，还包括抗所述col4a1单抗和所述col4a3单抗的多抗，以及3种荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。
29.在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的col4a1 单抗和本发明第三方面所述的col4a5单抗组成的抗体组合，还包括抗所述col4a1
单抗和所述col4a5单抗的多抗，以及3种荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。
30.在本发明的又一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的col4a1 单抗、本发明第二方面所述的col4a3单抗和本发明第三方面所述的col4a5单抗组成的抗体组合，还包括抗所述col4a1单抗、所述col4a3单抗、所述col4a5单抗的多抗，以及4种荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。
31.在本发明的一些实施方案中，所述荧光染料可以是本领域熟知的任何荧光染料，只要满足不同荧光颜色均不同即可满足本发明的要求。在本发明的一些实施方案中，当需要4种荧光染料时，所述荧光染料例如是520、570、690和dapi。
32.本发明的有益效果
33.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
34.通过对蛋白片段的特定序列选择以及后续免疫原的修饰设计，制备得到了灵敏度、特异性优良的兔单抗，适用于各种免疫检测，特别是免疫组化法和免疫荧光法。
35.免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对病理组织种相应抗原进行定性、定位或定量测定的一项免疫学检测技术。免疫组织化学检测原理是：组织切片经抗原热修复处理后与一抗试剂进行孵育，在原位形成一抗与目标抗原的抗原-抗体复合物；抗原-抗体复合物中一抗分子再与酶标记的聚合物二抗通过孵育结合，在原位进一步形成抗原-抗体-二抗聚合物的复合物；最后通过酶催化的底物在抗原部位形成有颜色的沉积物。光学显微镜下通过观察棕色部位来确定是否有目标抗原及其表达情况。通过免疫组织化学染色可确定病理组织细胞类型和形态、辨认组织细胞产物的来源、确定组织细胞的分化程度；尤其在临床病理中的应用最为重要，如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后；辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。目前临床上对遗传性肾炎的特异性检测方法采用荧光法，荧光法需要标记荧光素，检测方法上需要配置荧光显微镜进行结果判断。若还可以开发出免疫组化检测试剂盒则不需要荧光显微镜对结果进行判断，普通光镜即可实现。
36.多标记免疫荧光染色试剂盒是在tsa基础上开发的一套多标记复染方案，允许在同一样本中使用相同种属来源的不同一抗，以顺次单染的方式将各色标记的酪胺共价结合到目标抗原上(抗原直标)，随后通过微波加热去除抗体(抗体没了但信号仍留在抗原上)。清除上一轮抗体后即可使用新的抗体继续染色，不需担心交叉反应。
附图说明
37.图1示出了本发明实施例1制备的col4a1多抗血清间接elisa检测滴度。
38.图2示出了本发明实施例1制备的col4a1兔单抗的elisa结合曲线。
39.图3示出了本发明实施例1制备的col4a1兔单抗在正常肾、脑组织中的ihc检测结果。
40.图4示出了本发明实施例2制备的col4a3多抗血清间接elisa检测滴度
41.图5示出了本发明实施例2制备的col4a3兔单抗的elisa结合曲线。
42.图6示出了本发明实施例2制备的col4a3兔单抗在正常肾、脑组织中的ihc检测结
果。
43.图7示出了本发明实施例3制备的col4a5多抗血清间接elisa检测滴度。
44.图8示出了本发明实施例3制备的col4a5兔单抗的elisa结合曲线。
45.图9示出了本发明实施例3制备的col4a5兔单抗在正常肾、脑组织中的ihc检测结果。
46.图10示出了本发明实施例4制备的col4a5兔单抗偶联fitc复合物的纯化峰形图。
47.图11示出了本发明实施例4制备的col4a5兔单抗偶联fitc复合物及及未标记的 col4a5在肾组织的荧光染色结果。
48.图12示出了本发明实施例4制备的col4a1兔单抗偶联texas red复合物的纯化峰形图。
49.图13示出了本发明实施例4制备的col4a1兔单抗偶联texas red复合物及未标记的col4a1兔单抗在荧光显微镜下的染色结果。
50.图14示出了本发明实施例4制备的col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒的3个不同浓度配方的荧光染色结果。
51.图15示出了本发明实施例4制备的col4a1生col4a5荧光双重染色试剂盒检测 alport综合征染色结果。
52.图16示出了对照品一步法荧光双重染色试剂盒检测alport综合征染色结果。
53.图17示出了本发明实施例5制备的4色多标记免疫荧光染色试剂盒检测alport综合征染色结果。
54.图18示出了本发明实施例6制备抗col4a1-hrp、col4a5-ap可见光检测试剂盒检测alport综合征染色结果。
具体实施方式
55.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
56.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
57.关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然 (例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
58.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任
何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
59.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
60.实施例
61.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
62.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
63.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
64.下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(j.萨姆布鲁克、m.r.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
65.实施例1col4a1抗体制备
66.抗人col4a1兔单抗的制备步骤如下：
67.(1)使用人col4a1天然蛋白免疫4只新西兰大白兔，经过4次免疫之后取兔血清，使用elisa方法检测血清中抗体滴度。elisa滴度检测数据见图1，其中兔号为兔3的血清滴度最高。
68.(2)取兔3的全血分离pbmc(外周血淋巴细胞)，进行b细胞克隆培养，培养9 天左右b细胞上清送检elisa、ihc，ihc阳性孔的细胞使用细胞裂解液进行裂解，-80℃保存备用。
69.(3)利用重组技术，获取抗体的重链质粒和轻链质粒，转染hek293细胞，5-8天后收获细胞培养上清；使用proteina纯化获得的col4a1兔单抗。
70.(4)对该col4a1兔单抗进行ielisa和ihc鉴定，鉴定结果见图2、图3。由图2 可知开发的col4a1兔单抗效价为2.09ng/ml。由图3可知获得的抗人col4a1兔单抗在人肾组织的肾小球、肾小管、血管基底膜均有阳性的棕色染色；在脑组织中的血管基底膜有阳性的棕色染色。显示该抗体阳性定位准确，特异性好，且无非特异性染色。
71.利用vbase2软件分析该col4a1兔单抗，结果显示，该抗体的可变区序列信息如下：
72.(1)cdr-h1氨基酸序列包括：siyyiy(seq id no:1)。
73.(2)cdr-h2氨基酸序列包括：ciyggssgtsyyaswakg(seq id no:2)。
74.(3)cdr-h3氨基酸序列包括；dagylgydyvl(seq id no:3)。
75.(4)cdr-l1氨基酸序列包括：qasqnianlla(seq id no:4)。
76.(5)cdr-l2氨基酸序列包括：kastlqs(seq id no:5)。
77.(6)cdr-l3氨基酸序列包括：qsvaygstyvaa(seq id no:6)。
78.实施例2col4a3抗体制备
79.由于人col4a3蛋白与兔col4a3蛋白有很高的同源性，故很难通过随意设计抗原进行免疫获得较好的人col4a3蛋白兔抗体。在抗原的选择上，选择人col4a3蛋白的 aa1557-1570多肽作为免疫原及检测原，该段免疫原与兔col4a3蛋白的aa1381-1394多肽有3个氨基酸不同，前者的氨基酸序列为：aiavhsqttdippc(seq id no:7)，后者的氨基酸序列为：aiaihsqstdvppc(seq id no:8)，针对人col4a3蛋白的aa1557
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1570多肽可产生尽可能多的识别人col4a3的抗体。
80.具体地，抗人col4a3兔单抗的制备步骤如下：
81.(1)使用上述人col4a3蛋白的aa1557-1570多肽交联klh免疫4只新西兰大白兔，经过4次免疫之后取兔血清，使用elisa方法检测血清中抗体滴度。elisa滴度检测数据见图4，其中兔号为兔2的血清滴度最高。
82.(2)取兔2的全血分离pbmc，进行b细胞克隆，培养9天左右上清送检elisa、 ihc，ihc阳性孔的细胞使用细胞裂解液进行裂解，-80℃保存备用。
83.(3)利用重组技术，获取抗体的重链质粒和轻链质粒，转染hek293细胞，5-8天后收获细胞培养上清；使用proteina纯化获得的col4a3兔单抗。
84.(4)使用常规间接elisa、ihc方法对该单抗进行ielisa和ihc鉴定，鉴定结果见图5、图6。由图5可知开发的col4a3兔单抗效价为20.04ng/ml。由图6可知该抗体只在正常肾组织的肾小球基底膜、脑血管的基底膜均有特异性阳性染色，且该抗体在肾小管的基底膜无棕色染色，符合该抗体的免疫组化表达谱。
85.(5)将获得的col4a3兔单抗进行测序，利用vbase2软件分析该col4a3兔单抗，结果显示，该抗体的可变区序列信息如下：
86.(1)cdr-h1氨基酸序列包括：ssywic(seq id no:9)。
87.(2)cdr-h2氨基酸序列包括：ciyvgsasstyyaswvng(seq id no:10)。
88.(3)cdr-h3氨基酸序列包括；yasrsgdfwyfnl(seq id no:11)。
89.(4)cdr-l1氨基酸序列包括：qasediesnla(seq id no:12)。
90.(5)cdr-l2氨基酸序列包括：ytstlas(seq id no:13)。
91.(6)cdr-l3氨基酸序列包括：qstyysgsvdtmnt(seq id no:14)。
92.实施例3col4a5抗体制备
93.与col4a3类似，由于人col4a5蛋白与兔col4a5蛋白有很高的同源性，故很难通过随意设计抗原进行免疫获得较好的人col4a5蛋白兔抗体。在抗原的选择上，选择人 col4a5蛋白的aa1277-1294多肽作为免疫原及检测原，该段免疫原与兔col4a5蛋白的 aa1283-1300多肽有4个氨基酸不同，前者的氨基酸序列为：nggikgekgnpgqpglpg (seq id no:15)，后者的氨基酸序列为：ngaikgergnpgppgqpg(seq id no:16)，针对人col4a5蛋白的aa1277-1294多肽可产生尽可能多的抗体。
94.具体抗人col4a5兔单抗的制备步骤如下：
95.(1)使用上述人col4a5蛋白的aa1277-1294多肽，为了便于后续交联，在氨基端添加了一个半胱氨酸，即序列为cnggikgekgnpgqpglpg，交联klh免疫4只新西兰大白兔，经过4次免疫之后取兔血清，使用elisa方法检测血清中抗体滴度。elisa滴度检测数据见图7，其
中兔号为兔3的血清滴度最高。
96.(2)取兔3的全血分离pbmc，利用百凌兔单抗开发平台技术进行b细胞克隆，培养9天左右上清送检elisa，elisa阳性孔的细胞使用细胞裂解液进行裂解，-80℃保存备用。
97.(3)利用百凌兔单抗重组平台技术，制备抗体的重链质粒和轻链质粒，转染 hek293细胞，5-8天后收获细胞培养上清；使用proteina纯化获得的col4a5兔单抗。
98.(4)使用常规间接elisa、ihc方法对该单抗进行ielisa和ihc鉴定，鉴定结果见图8、图9。由图8可知开发的col4a5兔单抗效价为8.29ng/ml。由图9可知该抗体只在正常肾组织的肾小球基底膜有阳性染色，而肾小管、肾血管、脑血管细胞的基底膜为阴性。
99.(5)将获得的col4a5兔单抗进行测序，利用vbase2软件分析该col4a5兔单抗，结果显示，该抗体的可变区序列信息如下：
100.(1)cdr-h1氨基酸序列包括：sygvs(seq id no:17)。
101.(2)cdr-h2氨基酸序列包括：mvstgyiyyaswarg(seq id no:18)。
102.(3)cdr-h3氨基酸序列包括；eysnygtgsfg(seq id no:19)。
103.(4)cdr-l1氨基酸序列包括：qasqsvynnknla(seq id no:20)。
104.(5)cdr-l2氨基酸序列包括：kastlas(seq id no:21)。
105.(6)cdr-l3氨基酸序列包括：qgefscssadcfg(seq id no:22)。
106.实施例4一步法双重染色法试剂盒及其应用
107.1.col4a5兔单抗偶联异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，fitc)
108.将实施例3制备的col4a5兔单抗与fitc偶联，具体步骤如下：
109.(1)使用ph 8.5-ph 9.5的碳酸盐缓冲液对纯化的col4a5兔单抗的igg进行透析过夜，透析后的抗体移入离心管中备用。
110.(2)取0.5ml(2mg/ml)待偶联的col4a5兔单抗装入一洁净的离心管中，加入 150μl 1mg/ml的fitc溶液(uelandy，cat#f5027)，迅速混匀。
111.(3)37℃避光反应90～150min。
112.(4)使用脱盐柱(sephadex g25)除去游离的fitc，先用25ml pbs淋洗sephadexg25柱。
113.(5)收集pbs洗脱第一个fitc结合col4a5兔单抗igg蛋白峰，测定f/p比值(即每个蛋白分子上所标记荧光素分子数量)，合适的f/p比值为2～5。第二个荧光素峰为游离荧光素，弃去。
114.计算：f/p＝(2.87
×
od
495
)/(od
280
－0.35
×
od
495
)
115.igg量(mg/ml)＝(od
280
－od
495
×
0.35)/1.4
116.图10为col4a5兔单抗偶联fitc的纯化峰形图(监测od
495
)，其中左起第1个峰为 fitc结合col4a5单抗igg蛋白峰，第2个峰为游离荧光素。
117.标记浓度：通过公式经过计算本实施例标记荧光素的浓度为2.18mg/ml，偶联比(f/p) 为3.87，满足要求。
118.(6)标记复合物鉴定方法：使用正常人肾组织对标记的col4a5-fitc偶联复合物及未标记的col4a5兔单抗进行免疫荧光染色，具体步骤如下。
119.①
肾组织石蜡切片60℃烤片1h，经常规脱蜡水化后，使用高温常压，tris-edta(ph 9.0)修复液进行修复后，冷却至室温；
120.②
使用3％双氧水封闭组织上的内源性过氧化物酶，室温10min。
121.③
使用免疫组化笔在玻片上将组织画圈后，使用10％山羊血清封闭组织上的非特异性结合位点，室温30min。
122.④
pbst洗组织玻片3次后，其中1张玻片上加入100μl浓度为50μg/ml的col4a5
‑ꢀ
fitc偶联复合物，另1张玻片上加入100μl浓度为50μg/ml的未标记的col4a5兔单抗，室温孵育30min；
123.⑤
pbst洗组织玻片3次后，在玻片上滴加1滴dapi(含抗荧光淬灭剂)，使用盖玻片封片，室温避光放置，于荧光显微镜下观察染色结果。
124.图11为col4a5-fitc偶联复合物及未标记fitc的col4a5单抗在荧光显微镜下的染色结果。结果显示：col4a5-fitc偶联复合物在肾小球的包曼囊基底膜有绿色的荧光染色，细胞核为蓝色(图11左)；未标记的col4a5单抗在荧光显微镜下无绿色荧光染色，只有胞核蓝色染色(图11右)。结果表明，fitc成功偶联到col4a5兔单抗上，可用于下一组成试剂组合或包装成试剂盒进行检测。
125.2.col4a1兔单抗偶联德克萨斯红(texas red)荧光染料
126.将实施例1制备的col4a1兔单抗与texas red偶联，具体步骤如下：
127.(1)使用ph8.5-ph9.5的碳酸盐缓冲液对纯化的抗col4a1兔单抗的igg进行透析过夜，透析后的抗体移入离心管中备用。
128.(2)取0.5ml(2mg/ml)待偶联的col4a1兔单抗装入一洁净的离心管中，加入 200μl 1mg/ml的texas red溶液(uelandy，cat#t5082)，迅速混匀。
129.(3)室温避光反应60～120min。
130.(4)使用脱盐柱(sephadex g25)除去游离的荧光素，先用25ml pbs淋洗sephadexg25柱。
131.(5)收集pbs洗脱第一个texas red结合col4a1单抗igg蛋白峰，测定f/p比值 (即每个蛋白分子上所标记荧光素分子数量)，合适的f/p比值为2～4。第二个荧光素峰为游离荧光素，弃去。
132.计算：igg浓度(m)＝(od
280
－od
595
×
0.18)/203000
133.其中，203000是典型igg在cm-1
m-1
中的摩尔消光系数(ε)，0.18是280nm处荧光基团对吸光度贡献的校正因子。
134.f/p＝(od595
×
稀释倍数)/(80000
×
蛋白摩尔浓度)
135.图12为col4a1兔单抗偶联texas red的纯化峰形图(监测od
595
)，其中第1个峰为 texas red结合col4a1兔单抗igg蛋白峰，第2个峰为游离荧光素。
136.标记浓度：通过公式经过计算本实施例标记浓度为1.95mg/ml，偶联比(f/p)为2.85，满足要求。
137.(6)标记复合物鉴定方法：同上述col4a5兔单抗-fitc复合物的免疫荧光染色方法。
138.图13为col4a1-texas red偶联复合物及未标记texas red的col4a1单抗在荧光显微镜下的染色结果。col4a1-texas red偶联复合物在肾小球的包曼囊基底膜有红色的荧光染色，细胞核为蓝色(图13左)；未标记的col4a1单抗在荧光显微镜下无染色(图13 右)。结果表明，texas red成功偶联到col4a1兔单抗上，可用于下一组成试剂组合或包装成试剂盒
进行检测。
139.3.col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒
140.将步骤1制备的col4a5兔单抗-fitc复合物与步骤2制备的col4a1兔单抗-texasred复合物分别按如下表格进行混合，随后使用肾组织进行免疫荧光验证。
141.配方编号col4a5兔单抗-fitc复合物终浓度col4a1兔单抗-texas red复合物终浓度12μg/ml2μg/ml25μg/ml5μg/ml310μg/ml10μg/ml
142.图14为col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒的3个不同浓度配方的荧光染色图片，从配方1的染色结果可知，两种抗体的荧光染色偏弱；从配方2的染色结果可知，两种种抗体的荧光染色适中，同时无荧光背景产生；从配方3的染色结果可知，两种抗体荧光染色较强，但存在较高荧光背景。
143.因此，发明人选择选择两种荧光标记抗体的终浓度均为5μg/ml进行试剂盒的组装及后续检测。
144.由此，本实施例提供一种col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒，包含：
145.①
组分1：过氧化物酶阻断剂(3％h2o2)；
146.②
组分2：col4a5兔单抗-fitc复合物和col4a1单抗-texas red复合物(等浓度)；
147.③
组分3：抗荧光淬灭封片剂(含dapi)。
148.4.col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒在检测alport综合征(遗传性肾小球肾炎) 中的应用
149.样本类型：石蜡切片或冰冻切片
150.(1)正常肾组织、alport综合征阳性的肾组织石蜡切片，每个组织各2张，经烤片、脱蜡、水化后，使用tris-edta(ph 9.0)进行常压/高压抗原修复后，冷却至室温。水洗后，使用免疫组化笔画圈后泡pbst。若组织类型为冰冻切片，则不需要烤片、脱蜡、水化。
151.(2)滴加2-3滴组分1封闭内源性过氧化物酶，室温10min。
152.(3)在其中1张正常肾组织切片和1张alport综合征阳性的肾组织切片上分别滴加2
‑ꢀ
3滴上述col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒中的组分2(col4a5兔单抗-fitc复合物和col4a1单抗-texas red复合物终浓度均为5μg/ml)；另2张切片上滴加2-3滴对照品(cosmo，cat#sge-cft45325)，室温避光孵育30min。
153.(4)使用pbst清洗3次后，滴加1滴(约20μl)组分3进行封片，室温避光放置5
‑ꢀ
10min。
154.将组织切片置于荧光显微镜下分别使用绿光和红光荧光通道进行拍照，最后进行合并。
155.荧光染色结果见图15，所有正常肾小管、肾小球基底膜均为红色荧光染色，肾小球基底膜同时存在绿色荧光染色。alport综合征阳性的肾组织荧光染色中，肾小管、肾小球基底膜均为红色荧光染色，但不见绿色荧光信号。图16为对照品在正常肾组织与alport综合征阳性的肾组织中的染色结果，从图16可看出，该试剂盒配方在正常肾组织中的染色结果弱于本实施制备的col4a1和col4a5荧光双重染色试剂盒的染色结果。以上结果说明，本实施例制备的试剂盒比对照试剂盒具有更高的灵敏度。
156.实施例5 4色多标记免疫荧光染色试剂盒及其应用
157.1.4色多标记免疫荧光染色试剂盒
158.本实施例利用实施例1～3制备的col4a1兔单抗、col4a3兔单抗和col4a5兔单抗作为一抗，制备4色多标记免疫荧光染色试剂盒，该试剂盒包括以下组分：
159.①
组分1：过氧化物酶阻断剂(3％h2o2)；
160.②
组分2：col4a1兔单抗(浓度:5μg/ml)；
161.③
组分3：col4a3兔单抗(浓度:10μg/ml)；
162.④
组分4：col4a5兔单抗(浓度:10μg/ml)；
163.⑤
组分5：hrp标记的羊抗兔igg(jackson,cat#111-035-144；浓度:1μg/ml，或技术指标同类型试剂)；
164.⑥
组分6：四色多标记荧光染料组合(520，570，690，dapi)；
165.⑦
组分7：酪胺信号放大反应液。
166.2.4色多标记免疫荧光染色试剂盒在检测alport综合征中的应用
167.具体实验步骤如下：
168.样本类型：石蜡切片或冰冻切片
169.(1)正常肾组织、alport综合征阳性的肾组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，使用 tris-edta(ph9.0)进行高温常压/高压抗原修复后，冷却至室温。水洗后，使用免疫组化笔画圈后泡pbst。若组织类型为冰冻切片，则不需要烤片、脱蜡、水化。
170.(2)滴加2～3滴组分1封闭内源性过氧化物酶，室温10min。
171.(3)滴加2～3滴组分2，室温孵育30min后，使用pbst洗玻片3次。
172.(4)滴加2～3滴组分5，室温孵育30min后，使用pbst洗玻片3次。
173.(5)使用组分7稀释组分6中的荧光染料520(100:1)，100μl/片滴加玻片上的组织区域，室温孵育10min；使用pbst洗玻片3次。
174.(6)将玻片放入已煮沸的抗原修复缓冲液工作液(图凌(杭州)生物科技有限公司， cat#i30082b)中煮沸10～15min，重复步骤(2)。
175.(7)滴加2～3滴组分3，室温孵育30min后，使用pbst洗玻片3次，重复步骤(4)。
176.(8)使用组分7稀释组分6中的荧光染料570(100:1)，室温孵育10min；使用pbst 洗玻片3次。
177.(9)重复步骤(6)后，滴加2～3滴组分4，室温孵育30min后，使用pbst洗玻片3 次，重复步骤(4)。
178.(10)使用组分7稀释组分6中的荧光染料690(100:1)，室温孵育10min；使用 pbst洗玻片3次。
179.(11)加1滴(约20μl)组分6中的dapi进行封片。
180.(12)将染色后的组织在荧光显微镜下进行观察，并拍照。
181.图17为4色多标记免疫荧光染色试剂盒检测正常肾组织及alport综合征患者肾组织，图17中左边显示col4a1在正常肾小球、肾小管均有基底膜阳性定位，col4a3、 col4a5在正常肾小球包曼囊基底膜均有阳性定位。图17右边显示col4a1在alport综合征患者的肾小球、肾小管均有基底膜阳性定位，col4a3、col4a5在alport综合征患者肾小球包曼囊基底膜均无阳性定位。
182.以上结果表明，本实施例制备的4色多标记免疫荧光染色试剂检测alport综合征的特异性和灵敏度均非常高，为本技术领域第一次利用该方法检测遗传性肾小球肾炎。
183.实施例6四型胶原蛋白可见光检测试剂盒及其在alport综合征中的应用
184.本实施例利用实施例1制备的col4a1兔单抗和实施例3制备的col4a5兔单抗，分别制备col4a1兔单抗-辣根过氧化物酶(hrp)复合物(naio4)及col4a5兔单抗偶联碱性磷酸酶(ap)复合物。
185.1.四型胶原蛋白可见光检测试剂盒
186.利用上述col4a1兔单抗-hrp复合物和col4a5兔单抗-ap偶联复合物制备四型胶原蛋白可见光检测试剂盒，该试剂盒包含：
187.①
组分1：过氧化物酶阻断剂(3％h2o2)；
188.②
组分2：col4a1兔单抗hrp偶联复合物(浓度：3-5μg/ml)；
189.③
组分3：col4a5兔单抗-ap偶联复合物(浓度:5-10μg/ml)；
190.④
组分4：dab色原(20
×
)(杭州百凌生物科技有限公司，cat#bx10002)、dabbuffer(杭州百凌生物科技有限公司，cat#bx10003)；
191.⑤
组分5：fast-red色原(150
×
)、fast-redbuffer(abcam，cat#ab103741或技术指标同类型试剂)；
192.⑥
苏木素染色液。
193.2.四型胶原蛋白可见光检测试剂盒在遗传性肾小球肾炎中的应用
194.具体实验步骤如下：
195.样本类型：石蜡切片或冰冻切片
196.(1)正常肾组织、alport综合征阳性的肾组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，使用tris-edta(ph9.0)进行高温常压/高压抗原修复后，冷却至室温。水洗后，使用免疫组化笔画圈后泡pbst。若组织类型为冰冻切片，则不需要烤片、脱蜡、水化。
197.(2)滴加2～3滴组分1封闭内源性过氧化物酶，室温10min。
198.(3)在正常肾组织和alport综合征阳性的肾组织上滴加2～3滴组分2，室温孵育30min后，使用pbst洗玻片3次。
199.(4)在室温孵育完的2张切片上滴加2～3滴组分3，室温孵育30min后，使用pbst洗玻片3次。
200.(5)在组织切片上滴加100μl组分4的工作液，工作液配方为dab色原(20
×
)：dabbuffer＝1:19，室温孵育2～10min，使用pbst洗玻片3次。
201.(6)在组织切片上滴加100μl组分4的工作液，工作液配方为fast-red色原：fast-redbuffer＝1:150，室温孵育10-15min，使用自来水洗玻片3次。
202.(7)使用组分6进行复染，随后进行脱水、透明、封片。
203.镜下可见光进行拍照，结果见图18。
204.图18中左边染色结果显示使用四型胶原蛋白可见光检测试剂盒的col4a1在正常肾组织的肾小球及肾小管基底膜均有棕色染色，col4a5在正常肾组织的肾小球基底膜有阳性红色染色；图18中右边染色结果显示使用四型胶原蛋白可见光检测试剂盒的col4a1在alport综合征患者的肾组织内的肾小球及肾小管基底膜均有棕色染色，而col4a5在alport综合征的肾组织内的肾小球基底膜无任何阳性染色。
205.以上结果表明，该检测试剂盒在显微镜可见光下就可实现对遗传性肾小球肾炎的病理辅助诊断，具有广阔的应用前景，能够辅助病理医师对病灶的判断。
206.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种col4a3单抗，其特征在于，所述col4a3单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α3如seq id no:7所示的蛋白片段。2.根据权利要求1所述的col4a3单抗，其特征在于，所述col4a3单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:9～14所示。3.一种检测四型胶原蛋白的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括col4a1抗体，还包括权利要求1～2任一所述的col4a3单抗。4.根据权利要求3所述的抗体组合，其特征在于，所述col4a1为单抗，且单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:1～6所示。5.根据权利要求3所述的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合还包括col4a5抗体。6.根据权利要求5所述的抗体组合，其特征在于，所述col4a5抗体为单抗，且能够特异性识别四型胶原蛋白α5如seq id no:15所示的蛋白片段。7.根据权利要求6所述的抗体组合，其特征在于，所述col4a5单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:17～22所示。8.权利要求1～2任一所述的col4a3单抗或权利要求3～7任一所述的抗体组合在制备四型胶原蛋白免疫检测试剂盒中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述免疫检测选自包括免疫组织化学法、免疫荧光法、酶联免疫法、免疫印迹法的组中的至少一种。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述四型胶原蛋白免疫检测试剂盒用于诊断alport综合征。

技术总结
本发明公开了一种检测四型胶原蛋白


技术研发人员：潘丽 李明振 蔡宁 吴佳
受保护的技术使用者：杭州百凌生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.23
技术公布日：2022/3/8