一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用

一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌及其应用
技术领域
1.本发明属于医药生物化工技术领域，具体地说，是关于一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌及其拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。


背景技术：

2.6-氟-色满-2-羧酸是重要医药中间体。化学名称是6-氟-3，4-二氢-2h-1-苯并吡喃-2-甲酸，化学分子式是c
10
h9o3f分子量是196.18，结构式为：
[0003][0004]
在许多具有生物活性的分子结构中，都能发现6-氟-色满的色满结构单元的存在。譬如，该结构广泛包含在维生素e及许多拮抗β受体的抗高血压药中。光学纯的6-氟-色满-2-羧酸用于新型降血压药物(s,r,r,r)-奈必洛尔的合成。(s,r,r,r)-奈必洛尔是第三代兼有血管扩张作用的心脏高度选择性β1受体阻滞剂，主要用于治疗原发性高血压，能有效地控制高血压和保持左心室功能，并且具有剂量低、副作用少，耐受性好等优点。
[0005]
6-氟-色满-2-羧酸是制备奈必洛尔的关键中间体，其拆分效率决定制备奈必洛尔合成方法的最终结果。但是关于6-氟-色满-2-羧酸(r)-，(s)-光学异构体拆分方法文献报道较少。迄今为止，化学方法、生物拆分法等是几种拆分有机酸常用的办法。文献曾有报道使用脱氢枞胺拆分外消旋的6-氟-3,4-二氢-2h-1-苯并吡喃-2-甲酸，总拆分收率经实验证明约为32％。此化学拆分方法过程较冗长，并且脱氢枞胺手性拆分试剂价格较贵，效率不高。ep2646426报道过利用来源于真菌ophiostoma novo-ulmi的酯酶拆分外消旋的6-氟-色满-2-羧酸乙酯，分离纯化得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸，ee值是90.72％，转化率是50.28％。此类方法操作简便，条件温和。但是立体选择性不高。因此急需找到其他的高活性和高立体选择性的脂肪酶/酯酶。。基于此，开发了脂肪酶拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，利用离体的酯酶estr或高效表达estr的重组大肠杆菌的冻干菌体(fdcestr)作为催化剂，选择性催化(r)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解反应，由此制备获得光学纯的(r)-6-氟-色满-2-羧酸，具有转化率高、立体旋转性强。因此本发明的第一个目的是提供一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌。本发明的第二个目的是提供一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明的第三个目的是提供一种微生物酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
作为本发明的第一个方面，一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如seq id no.3所示的estr基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中制备获得。
[0009]
根据本发明，所述表达载体为pet-28a(+)表达载体。
[0010]
作为本发明的第二个方面，一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
[0011]
步骤一、提取热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna；
[0012]
步骤二、以热链状地芽孢杆菌的estr序列设计上下游引物，上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示；
[0013]
步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到目的dna片段，序列如seq id no.3所示；
[0014]
步骤四、将目的dna片段克隆到pet-28a(+)表达载体，得重组质粒；
[0015]
步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得重组菌株。
[0016]
作为本发明的第三个方面，一种含酯酶estr基因的重组质粒，其是将具有序列如seq id no.3所示的estr基因序列的目的片段克隆到表达载体中制备获得。
[0017]
根据本发明，所述表达载体为pet-28a(+)表达载体。
[0018]
作为本发明的第四个方面，一种含酯酶estr基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：
[0019]
步骤一、提取热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna；
[0020]
步骤二、以热链状地芽孢杆菌的estr序列设计上下游引物，上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示；
[0021]
步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到目的dna片段，序列如seq id no.3所示；
[0022]
步骤四、将目的dna片段克隆到pet-28a(+)表达载体，得重组质粒。
[0023]
步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得重组菌株。
[0024]
作为本发明的第五个方面，一种酯酶estr基因，其具有序列如seq id no.3所示的estr基因序列。
[0025]
作为本发明的第六个方面，一种酯酶estr基因的制备方法，包括如下步骤：
[0026]
步骤一、提取热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna；
[0027]
步骤二、以热链状地芽孢杆菌的estr序列设计上下游引物，上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示；
[0028]
步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到目的dna片段，序列如seq id no.3所示。
[0029]
作为本发明的第七个方面，一种如上述所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌在酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的应用。
[0030]
进一步，一种如上述所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌用作酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂。
[0031]
作为本发明到第八个方面，一种微生物酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其是以上述所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色
满-2-羧酸甲酯为底物，在ph为6.0-8.5的缓冲液中，加入有机溶剂，在20-60℃温度下反应1-12小时，接着，进行分离纯化。
[0032]
根据本发明，所述的有机溶剂为异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷或异辛烷中的一种。
[0033]
进一步的，所述的有机溶剂为甲苯。
[0034]
根据本发明，所述的甲苯的体积百分比为10-50％。
[0035]
优选的，甲苯的体积百分比为20-30％。
[0036]
根据本发明，所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌的浓度为10g/l，所述的外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度为100-40omm。
[0037]
优选的，所述的外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度为300mm。
[0038]
根据本发明，所述的分离纯化，其是在反应完成后，采用过滤方法去除表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌后，加入5m氢氧化钠溶液调节ph至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。
[0039]
本发明的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌，其有益效果是，可以用作酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂，使得酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法可以提供高的立体选择性。
[0040]
本发明的微生物酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其有益效果是：转化率》46％，ee值95-96％，具有反应效率高、立体选择性高、工艺相对简单等特点。
附图说明
[0041]
图1为有机溶剂比例对反应的影响。
[0042]
图2为温度对反应的影响。
[0043]
图3为ph对反应的影响。
[0044]
图4为(r)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图。
具体实施方式
[0045]
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
[0046]
实施例1大肠杆菌基因工程菌的构建及酯酶estr的高效表达
[0047]
1.将热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1使用培养基(peptone 5g,meat extract 3g,蒸馏水1l)复苏，在60℃恒温摇床中需氧培养12小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。
[0048]
2.细菌dna提取，使用细菌基因组dna快速提取试剂盒(generay biotech,shanghai,china)进行提取，获得geobacillus thermocatenulatus基因组dna。
[0049]
3.根据geobacillus thermocatenulatus菌株的酯酶estr基因序列设计引物，所设计上游引物和下游引物如下：
[0050]
上游引物：5’cgcggatccgtgcaagaccagtttttttc 3’，seq id no.1，其中，下划线部
分为bamh i识别位点；
[0051]
下游引物：5’cgcaagctttcattgttcaccctcctccg 3’，seq id no.2，其中，下划线部分为hind iii识别位点；
[0052]
4.然后以热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus的基因组dna为模板，利用聚合酶链式反应(pcr)进行基因扩增，获得包含酯酶estr全长基因的pcr产物，核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。其中，其中，pcr扩增体系为primer star max 25μl；正向引物和反向引物各1.5μl；水22μl；模板0.5μl。
[0053]
核苷酸序列：
[0054]
gtgcaagaccagtttttttcggtcgccaagccgccgacaaaagaacaacggccgccgacggctgaaacaaggcaacatgacgagaaaatggatattgttgctcttggcgattcgttgacgagaggaacgggcgatgaaagcggcaaagggtatgttggctatatggtcgatgcgcttcgccggcaaacggatcggccgatccgtgtgacgaatttggccatccgcggccttcgctccgacgggctgcttcgccagcttggccagcctgagattcaacggcaagtcgccatggcggatttgatcgtgatgacgatcggcggcaacgacttgtttcaagggggggaagcgcttcggttgaacgccaagcagctggatgaagcgaagcgccggtatgcagccaacctagaccacattttcgccgcgctgcgccgcttcaacagcgaagcggtcatttttgcaatcggtttgtacaacccgtttggcgatttaaacgatgccaaacggacgtcggccgttgtgcgcgattggaattttgcatcagcggaagtggcggcccgctatccgaacatcgtcgcggtgccgacgtttgatttgtttgccctccatgtcaatgactatttgtacagcgaccattttcatccaaacgcggcaggctacaagcggattggagagcgcgtcgcctcgctcatcacgttgacggaggagggtgaacaatga，seq id no.3。
[0055]
氨基酸序列：
[0056]
vqdqffsvakpptkeqrpptaetrqhdekmdivalgdsltrgtgdesgkgyvgymvdalrrqtdrpirvtnlairglrsdgllrqlgqpeiqrqvamadlivmtiggndlfqggealrlnakqldeakrryaanldhifaalrrfnseavifaiglynpfgdlndakrtsavvrdwnfasaevaarypnivavptfdlfalhvndylysdhfhpnaagykrigervaslitlteegeq，seq id no.4。
[0057]
5.将pet-28a(+)空载质粒，以及步骤4得到的带有bamh i和hind iii酶切位点的基因(序列如seq id no.3所示)，分别用bamh i和hind iii进行双酶切。回收大片段，用t4dna连接酶连接，热激法转化大肠杆菌bl21，用含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行筛选，pcr法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，从而构建得到酯酶estr基因工程菌株lycestr。
[0058]
6.将阳性重组菌株(步骤5的酯酶estr基因工程菌株lycestr)接种于含有50μg/ml卡那霉素的5ml lb培养基中37℃过夜培养，随后以1％转接量接入50ml含有50μg/ml卡那霉素的新鲜lb培养基中继续繁殖，当od600达到0.6～0.8时，加入iptg至终浓度0.1mm。在20℃下诱导16～18小时后，离心收集菌体，然后放在冷冻干燥机冷冻12小时，制备冻干菌粉储存冰箱，备用。
[0059]
实施例2(r)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法
[0060]
在0.1m磷酸盐缓冲液中，用实施例1制备的冻干菌粉(lycestr)进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解动力学拆分，但是没有观察到良好的活性和选择性。因此，反应在包含不同有机溶剂的双相体系(有机溶剂与磷酸盐缓冲液)中进行。
[0061]
反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5m氢氧化钠溶液调节ph11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除
去溶剂即可得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱chirasil-ad-h)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0ml/ml，检测波长254nm。
[0062]
实施例3以冻干大肠杆菌菌体(lycestr)为催化剂，考察(r)-6-氟-色满-2-羧酸制备的条件
[0063]
反应体系包括：菌体，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯，有机溶剂，反应温度，反应时间，反应ph，底物浓度，buffer，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯即底物。
[0064]
以上述实例1中的重组大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶estr基因工程菌株)为酶源，考察有机溶剂的选择、有机溶剂添加的比例、反应温度、反应ph、底物浓度等因素，以提高目标产物(r)-6-氟-色满-2-羧酸的时空产率。
[0065]
1、考察所选有机溶剂对反应的影响
[0066]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；有机溶剂与pb buffer(ph7.4)的比例是1:4；反应温度为30℃；反应时间为12h。所选的有机溶剂包括异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷、异辛烷。结果见表1。
[0067]
表1有机溶剂对反应的影响
[0068]
有机溶剂log p转化率(％)ee(％)异丙醇0.3852.345.3丁醇0.887.81.6甲苯2.548.695.6正己烷3.542.589.7正庚烷4.026.611.6异辛烷4.55.42.1
[0069]
结果显示：所选的有机溶剂中，甲苯的转化率和ee值均良好。
[0070]
2、考察甲苯与pb buffer(ph7.4)对反应的影响。
[0071]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；反应温度为30℃；反应ph是7.4；反应时间为12h。所选甲苯占总体积的比例是10％、20％、30％、40％，50％(v/v)。结果如图1所示。
[0072]
图1结果显示，甲苯占总体积为20-30％时，转化率和ee值均良好。
[0073]
3、考察温度对反应的影响。
[0074]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；甲苯与pb buffer(ph7.4)的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应温度是10～50℃。结果如图2所示。
[0075]
图2结果显示，反应温度为30℃时，转化率和ee值均良好。
[0076]
4、考察ph对反应的影响。
[0077]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；甲苯与buffer的比例是1:3；反应时间为6h。结果如图3所示。
[0078]
图3结果显示，所选反应ph是6、6.5、7、7.5、8、8.5，优选为7.5。
[0079]
5、考察底物浓度对反应的影响。在10ml的反应体系中，甲苯与buffer的比例是1:3；反应温度为30℃；反应ph是7.5。所选底物浓度是100、200、300、400mm，结果见表2。
[0080]
表2底物浓度对反应的影响
[0081][0082][0083]
表2结果显示，所选底物浓度为100mm、200mm和300mm时，转化率和ee值均良好。
[0084]
实施例4
[0085]
以大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶estr基因工程菌株)为酶源，酶法拆分(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯生产(r)-6-氟-色满-2-羧酸
[0086]
根据实施例3确定的最佳拆分条件，以上述实例1中冻干大肠杆菌菌体为催化剂，在0.2升反应液中加入菌体2g，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯300mm，甲苯与pb buffer(ph7.5)的比例是1:3；反应温度30℃，转化时间12h，进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解拆分。采用与实施例2的(r)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法，(r)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图如图4所示。
[0087]
结果，测定(r)-6-氟-色满-2-羧酸含量为138.8mm；转化率为48.7％；ee值是95.47％。
[0088]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，其是将具有序列如seq id no.3所示的estr基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中制备获得。2.如权利要求1所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述表达载体为pet-28a(+)表达载体。3.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提取热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna；步骤二、以热链状地芽孢杆菌的estr序列设计上下游引物，上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示；步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到目的dna片段，序列如seq id no.3所示；步骤四、将目的dna片段克隆到pet-28a(+)表达载体，得重组质粒；步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得重组菌株。4.一种含酯酶estr基因的重组质粒，其特征在于，其是将具有序列如seq id no.3所示的estr基因序列的目的片段克隆到表达载体中制备获得。5.一种酯酶estr基因，其具有序列如seq id no.3所示的estr基因序列。6.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌在酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的应用。7.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌用作酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂。8.一种微生物酶法拆分制备(r)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其特征在于，其是以权利要求1或2所述的表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在ph为6.0-8.5的缓冲液中，加入有机溶剂，在20-60℃温度下反应1-12小时，接着，进行分离纯化。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷或异辛烷中的一种。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的分离纯化，其是在反应完成后，采用过滤方法去除表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌后，加入5m氢氧化钠溶液调节ph至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。

技术总结
本发明公开了一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。本发明公开了该表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明还公开了一种微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其是以所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，进行反应，该方法提供了出色的立体选择性。立体选择性。


技术研发人员：高蓓 魏东芝 王风清 江敏
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2021.12.23
技术公布日：2022/3/8