一种用于青年水牛同期发情-定时输精的处理方法

1.本发明属于畜牧业繁殖技术领域，具体涉及一种用于青年水牛同期发情-定时输精的处理方法。


背景技术：

2.同期发情-定时输精技术是现代畜牧生产中重要的繁殖控制技术之一，是提高动物繁殖力的有效措施。同期发情-定时输精技术无需发情鉴定，操作简单，可显著提高受胎率和繁殖率。gnrh-pg-gnrh(gpg，ovsynch)同期发情方案在牛繁殖管理中应用广泛，同期发情效果相对较好，但在青年水牛上应用，同期发情效果还不理想，主要原因是青年水牛与成年水牛生理、生殖系统有一定的差异，例如青年水牛发情周期第1和2波的优势卵泡发育速度低于经产水牛(phulia et al 2004)；同一发情周期内，青年水牛第1和第2波的持续时间比经产水牛短(phulia et al 2004；刘楚沛等2015)；青年水牛排卵卵泡的最大直径小于初产水牛和经产水牛(giorgio et al.2005；马会明等2005；刘瑞鑫等2006)。采用之前发明的gpgmh同期发情定时输精方案处理青年牛配种时，发现受胎率比较低，主要原因是青年牛的卵巢小，卵泡发育不规律，米非司酮的注射剂量有点高，发情和排卵率很低，导致配种受胎率很低，水牛还有更多的繁殖问题，如季节性发情，安静发情，假发情，发情排卵不明显、卵泡发育和排卵不规则，很难预测排卵时间，胚胎早起死亡率较高等。另一方面，水牛产犊间隔时间长，达到性成熟的年龄较晚，发情持续时间较长(4～64h)，且发情症状不易被察觉等，使得配种员不好确定适时的输精时间，限制了人工授精技术在青年水牛上的应用。
3.此外，在繁殖季节采用gpg同期发情方案对青年牛、初产水牛和经产水牛进行同期发情处理，经产牛受胎率达到51％，显著高于青年水牛的受胎率35％(paul and prakash 2005，baruselli et al 2002)；据presicce et al(2005)研究报道，繁殖季节意大利地中海青年牛(n＝30)和经产牛(n＝31)利用ovsynch同期发情方案处理，结果发现青年牛和经产牛的排卵率分别为50.5％和80％，受胎率分别为30.2％和40％；在繁殖季节对沼泽型水牛进行同期发情处理(pg+pmsg)，青年牛和经产母牛，发情率分别为52.9％和81.5％，受胎率分别为35.1％和45.5％(凌泽继等2010)。因此如何能有效提高青年水牛的发情率和受胎率，筛选适合青年水牛最佳的同期发情定时输精方法，来提高青年水牛繁殖率和利用率是需要解决的技术难题。


技术实现要素：

4.本发明提供了孕马血清促性腺激素结合米非司酮的一种新的用途，并提供了一种适用于青年水牛的同期发情-定时输精的处理方法，可提高青年水牛同期发情率和配种受胎率。
5.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
6.孕马血清促性腺激素结合米非司酮在促进青年水牛卵泡发育和/或促进青年水牛发情中的应用。
7.孕马血清促性腺激素结合米非司酮在促进青年水牛同期发情-定时输精中的应用。
8.如上所述的应用，优选地，孕马血清促性腺激素的用量为1000iu/头，所述米非司酮的用量为0.3mg/kg体重，在注射米非司酮后的24h时，进行人工授精。
9.米非司酮在制备用于促进青年水牛发情的试剂中的应用。
10.一种用于青年水牛同期发情-定时输精的处理方法，其包括对青年水牛注射促性腺素释放激素(gnrh)的同时，注射米非司酮。
11.如上所述的处理方法，优选地，所述米非司酮的用量为0.3mg/kg体重。
12.如上所述的处理方法，优选地，具体包括如下步骤：第0天下午注射孕马血清促性腺激素(pmsg)，(b超检查从第1天(pgf2
ɑ
注射前一天)至排卵，或至第7天(即注射gnrh后72h))第2天下午肌肉注射氯前列醇钠(pgf2ɑ
)，第4天下午(注射氯前列醇钠后48小时)肌肉注射促性腺素释放激素(gnrh)，同时注射米非司酮，第5天下午进行人工输精，第6天上午检查排卵情况，若仍为排卵，则在当天下午进行第二次人工授精；人工输精后第5天，肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)。
13.如上所述的处理方法，优选地，所述孕马血清促性腺激素的注射剂量为1000iu/头；所述氯前列醇钠的注射剂量为0.5mg/头。
14.如上所述的方法，优选地，所述肌肉注射促性腺素释放激素的剂量为400μg/头，所述米非司酮的注射剂量为0.3mg/kg体重。
15.如上所述的方法，优选地，在米非司酮注射后的24～28h时进行第一次人工输精，所述人绒毛膜促性腺激素(hcg)的注射剂量为2000iu/头。
16.进一步，优选在米非司酮注射后的24h时进行第一次人工输精。
17.如上所述的处理方法，优选地，未注射孕马血清促性腺激素(pmsg)前，第一次用b超确定牛只妊娠情况，对未妊娠的牛只第0天肌肉注射孕马血清促性腺激素pmsg；人工输精后第40～45天，第二次利用b超确定牛只妊娠情况。
18.本发明经大量实验研究发现，在研究过程中确定水牛孕马血清促性腺激素(pmsg)的最佳注射剂量为1000iu/头，剂量过高引起卵泡囊肿，过低效果不明显。促性腺激素释放激素(gnrh)在水牛上剂量一般为50-250微克/头，而本发明在研究过程中确定青年水牛注射促性腺激素释放激素(gnrh)的最佳剂量为400微克/头。
19.本发明在研究过程中确定青年水牛注射人绒毛膜促性激素最佳注射剂量为2000iu/头，剂量过低或过高都不利于早期胚胎存活。本发明中的氯前列醇钠肌肉注射，注射剂量为0.5mg/头为最佳，如果剂量过低，会导致黄体溶解不完全，影响同期发情率。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明提供了孕马血清促性腺激素结合米非司酮的一种新的用途，可用于促进青年水牛卵泡发育和促进青年水牛发情。
22.本发明提供的一种专用于青年水牛同期发情-定时输精的处理方法，将pmsg、pgf2ɑ
、经典gpg和米非司酮的有机结合，筛选适合青年水牛的最佳同期发情-定时输精方案，有效控制青年水牛发情周期，提高青年水牛同期发情率、配种受胎率，有效降低卵泡囊肿率，从而提高青年水牛繁殖率和使用年限；此外，本发明方法能有效提高早期胚胎存活率；且不需要检测发情，定时输精，操作方便。
23.本发明提供的青年水牛同期发情-定时输精的处理方法，可准确控制青年水牛发情周期和排卵时间，进行定时人工授精(tai)程序，显著提高青年水牛的发情和排卵效果，且不需要发情鉴定，简化了水牛繁殖季节和非繁殖季节人工授精程序的管理，提高了配种受胎率。
附图说明
24.图1为青年水牛pmpgmh同期发情-定时输精流程示意图。
25.图2为青年水牛不同的米非司酮剂量采用pmpgmh同期发情方案排卵卵泡直径。
26.图3为米非司酮不同的注射剂量卵泡发育规律，其中，x坐标和y坐标的值都用对数表示。
27.图4为不同的输精时间对pmpgmh同期发情方案排卵卵泡直径的影响。
具体实施方式
28.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
29.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
30.实施例1
31.选择了76头无生殖道疾病的健康青年母牛，设计了三个米非司酮剂量进行筛选，三个组中分别按照0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg的米非司酮，同时设置有对照即0mg/kg的米非司酮和gnrh同时注射；以gpg方案为对照。
32.操作流程图见图1，具体操作流程如下：
33.s1、用b超确定水牛妊娠情况，对未妊娠的水牛第0天下午3:00肌肉注射孕马血清促性腺激素(pmsg)以诱导发情，按1000iu/头进行注射，b超检查从第1天(pgf2
ɑ
注射前一天)至排卵，或至第7天(即注射gnrh后72h)，记录卵泡发育及发情状况。
34.s2、第2天下午3:00肌肉注射氯前列醇钠(pgf2ɑ
)，按0.5mg/头注射，以促进卵泡发育。
35.s3、第4天下午3:00肌肉注射促性腺素释放激素(gnrh)，按400μg/头进行，同时注射米非司酮(各组分别0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg体重进行，还设置有空白对照即0mg/kg)以促进排卵。
36.s4、第5天下午3:00进行人工授精。
37.s5、第6天上午9:00利用b超检查排卵情况，若仍未排卵，则在当天下午3:00进行第二次人工授精。
38.s6、第10天对接受配种的牛只肌肉注射hcg(2000iu)；第45天利用b超进行妊娠检查。
39.1、不同剂量的米非司酮对青年水牛发情和卵泡发育的影响
40.对各组的注射gnrh至发情间隔时间、发情持续时间、注射gnrh至排卵间隔时间、最大卵泡直径的检测结果见表1，结果显示，米非司酮不同剂量组(0，0.3，0.4，0.5mg/kg)采用上述pmpgmh同期发情方案进行同期发情定时输精处理，结果发现不同处理组间差异不显
著，但低剂量组(0.3mg/kg)注射gnrh至发情时间、发情持续时间，注射gnrh至排卵间隔时间早于其他实验组(p》0.05)，排卵卵泡最大直径大于其他组的趋势(12.4
±
1.4mm)，青年水牛不同的米非司酮剂量(0，0.3，0.4，0.5mg/kg)采用pmpgmh同期发情方案排卵卵泡直径见图2。
41.表1.米非司酮不同剂量对青年水牛发情和卵泡发育的影响
[0042][0043][0044]
注:同一列不同小写字母a，b表示差异显著(p《0.05)。
[0045]
2、不同剂量的米非司酮对青年水牛发情，排卵，受胎率的影响
[0046]
对各组的青年水牛发情，排卵，受胎率的检测结果见表2，结果显示，米非司酮低剂量(0.3mg/kg)发情率(84.2％)、排卵率(89.5％)、受孕率(47.4％)高于其他组，但是没有显著性差异(p》0.05)，与其它实验组相比卵泡囊肿率(0％)为最低(p《0.05)。通过比较低(0.3mg/kg)、中(0.4mg/kg)、高(0.5mg/kg)剂量米非司酮对pmpgmh同期发情方案的卵泡发育规律变化，将pmsg注射至排卵间隔时间为横坐标，卵泡直径为纵坐标绘制的曲线图见图3，发现0.3mg/kg剂量排卵卵泡直径最大，卵泡发育比较规律，稳定，发育速度比较快。综合分析发情率、排卵率、受孕率和卵泡发育规律，pmpgmh同期发情定时输精方案，米非司酮0.3mg/kg剂量是最佳。
[0047]
表2.米非司酮不同剂量对水牛发情率、排卵率、受胎率和卵泡囊肿率的影响
[0048][0049]
注:括号内数值处理后的百分比。同一列不同小写字母a，b表示差异显著(p《0.05)
[0050]
实施例2不同的输精时间对pmpgmh同期发情方案发情率、排卵率和受胎率的影响
[0051]
为了筛选最佳人工授精时间，选择了79头无生殖道疾病的健康青年母牛，设计单次定时输精时间分别为米非司酮注射后16，20，24，28，32小时。操作流程按实施例1中步骤进行，不同在于，步骤s3中米非司酮按0.3mg/kg剂量进行，s4中人工授精分别为米非司酮注射后16，20，24，28，32小时，结果见表3。
[0052]
表3.不同的输精时间对pmpgmh同期发情方案的发情、排卵、受胎率和卵泡囊肿率
的影响
[0053][0054]
注:括号内数值处理后的百分比。同一列不同小写字母a，b表示差异显著(p《0.05)。
[0055]
上述结果显示，采用pmpgmh同期发情方案处理，米非司酮注射后24小时人工授精，发情率(88.89％)、排卵率(83.33％)和受胎率(50.00％)均高于(p《0.05)其他各组，米非司酮注射后32小时人工授精有显著差异(p《0.05)，与其它实验组相比卵泡囊肿率(0％)为最低(p《0.05)。将米非司酮注射后不同输精时间(小时)为横坐标，各排卵的最大卵泡直径为纵坐标绘制的图见图4，从图中看各组排卵最大卵泡直径没有差异显著。考虑到经济和管理，建议水牛人工授精的最佳时间是注射米非司酮后24小时后、对水牛进行人工授精。
[0056]
实施例3
[0057]
一种专用于青年水牛同期发情-定时输精方案，选择健康，没有生殖道疾病的水牛母牛155头，可按流程如图1所述进行，具体方案如下：
[0058]
第0天15：00肌肉注射马血清促性腺激素pmsg，注射剂量为1000iu/头。b超检查从第1天(pgf2
ɑ
注射前一天)至排卵，或至第7天(即注射gnrh后72h)，记录卵泡发育及发情、排卵状况。
[0059]
第2天15：00pm肌肉注射氯前列醇钠pgf2
ɑ
，注射剂量为0.5mg/头。
[0060]
第4天15：00pm肌肉注射促性腺素释放激素gnrh(400μg/头)，同时肌肉注射米非司酮按0.3mg/kg进行。
[0061]
第5天15：00pm进行人工输精。
[0062]
第6天15：00pm根据排卵情况，再次进行人工输精
[0063]
第10天15：00pm(即人工授精后第5天)，对接受配种的牛只肌肉注射人绒毛膜促性腺激素hcg(2000iu/头)。
[0064]
第45天，即人工授精后40天用b-超进行妊娠诊断。
[0065]
需要注意的是：
[0066]
1.试验前做直肠检查，有生殖道疾病的牛(两侧子宫角大小不对称、子宫角较大、有炎症)不能用于试验。
[0067]
2.每次人工授精之前，用酒精消毒输精抢，高锰酸钾消毒液(0.1mol/l)消毒外阴部分，人工授精人员确保手指甲剪短；切实掌握好输精技术，使用一次性输精枪套。
[0068]
3.精液解冻时动作迅速，解冻温度为37.5摄氏度，显微镜检查精子活力，解冻后精子活力高于0.3。
[0069]
4.严禁使用过期的激素；注射使用一次性注射器。
[0070]
5.注意观察牛的发情、排卵情况，做好记录。
[0071]
6.严格按方案执行。
[0072]
上述的同期发情定时输精方案操作，因为考虑胚胎早期死亡的问题，首次妊娠诊断是通过观察牛只是否返情确定，为进一步提高诊断准确率，妊娠诊断是在人工输精后第40天，利用b超再次确定牛只妊娠情况并记录。
[0073]
上述利用本发明方案处理青年水牛155头，青年水牛发情率、排卵率，受胎率，卵泡囊肿率分别为89.5％、84.2％和52.6％，0％。而利用传统的gpg同期发情方案处理青年水牛18头，青年母牛发情率，排卵率、受胎率和卵泡囊肿率分别为66.7％，61.1％、27.8％和16.7％。可见，本发明方法可显著提高青年水牛排卵率和受胎率及发情率，降低卵泡囊肿率。而且，本发明的操作比较方便，不需要进行发情鉴定，是一种程序化的同期发情定时输精方案，便于推广应用。
[0074]
由上实施例可见，本发明对于青年杂交水牛采用新的pmpgmh同步发情-定时输精技术，米非司酮0.3mg/kg剂量组，促进杂交水牛的发情和排卵，提高其繁殖性能，能在预定时间内使大量母牛进入发情期，准确控制水牛发情和排卵时间，促进了定时输精方法的在人工授精上的应用，不需要发情检测，简化了水牛繁殖季节和非繁殖季节人工授精程序的管理，提高了配种受胎率。筛选适合青年牛最佳的同期发情定时输精方法，可以早配种，早胚胎，早产犊，杂交水牛在整个生育期，可以多繁殖，提高繁殖率。

技术特征：
1.孕马血清促性腺激素结合米非司酮在促进青年水牛卵泡发育和/或促进青年水牛发情中的应用。2.孕马血清促性腺激素结合米非司酮在促进青年水牛同期发情-定时输精中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，孕马血清促性腺激素的用量为1000iu/头，所述米非司酮的用量为0.3mg/kg体重，在注射米非司酮后的24h时，实施人工授精。4.米非司酮在制备用于促进青年水牛发情的试剂中的应用。5.一种用于青年水牛同期发情-定时输精的处理方法，其包括对青年水牛注射促性腺素释放激素(gnrh)的同时，注射米非司酮。6.如权利要求5所述的处理方法，其特征在于，其包括如下步骤：第0天注射孕马血清促性腺激素，第2天肌肉注射氯前列醇钠，第4天肌肉注射促性腺素释放激素，同时注射米非司酮，第5天进行第一次人工输精，第6天上午检查排卵情况，若仍为排卵，则在当天下午进行第二次人工授精；人工输精后第5天，肌肉注射人绒毛膜促性腺激素。7.如权利要求6所述的处理方法，其特征在于，所述孕马血清促性腺激素的注射剂量为1000iu/头；所述氯前列醇钠的注射剂量为0.5mg/头。8.如权利要求6所述的处理方法，其特征在于，所述肌肉注射促性腺素释放激素的剂量为400μg/头，所述米非司酮的注射剂量为0.3mg/kg体重。9.如权利要求6所述的处理方法，其特征在于，在米非司酮注射后的24～28h时进行第一次人工输精，所述人绒毛膜促性腺激素hcg的注射剂量为2000 iu/头。10.如权利要求6所述的处理方法，其特征在于，未注射孕马血清促性腺激素pmsg前，第一次用b超确定牛只妊娠情况，对未妊娠的牛只第0天肌肉注射孕马血清促性腺激素pmsg；人工输精后第40～45天，第二次利用b超确定牛只妊娠情况。

技术总结
本发明提供了一种用于青年水牛同期发情-定时输精的处理方法，其包括对青年水牛注射促性腺素释放激素(GnRH)的同时，注射米非司酮。本发明的处理方法有效提高了青年水牛的同期发情率，并有效提高了早期胚胎存活率，最终提高了总受胎率，并能有效降低卵泡囊肿率，从而提高青年水牛繁殖率和使用年限；且不需要检测发情，定时输精，操作简单、方便。方便。


技术研发人员：杨利国 阿地力
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2021.12.09
技术公布日：2022/3/8