一种番鸭应激快速检测方法及其防控方法与流程

1.本发明涉及畜禽养殖技术领域，尤其涉及一种番鸭应激快速检测方法及其防控方法。


背景技术：

2.动物应激反应是动物机体在受到环境变化、疾病感染等不利因素刺激产生的一种非特异性应答反应。适量的应激反应是机体对外界变化的适应性应答，有助于提高机体免疫力；但过量的应激反应对机体会造成严重伤害，不仅影响机体的健康，还会对畜禽肉品质产生严重影响，降低肉品质。当前，番鸭养殖中，南方高热高湿、饲料或饮水中重金属污染、长途运输、疾病都是造成番鸭应激反应的重要因素，也是影响番鸭品质的主要影响因子。如何快速检测番鸭是否处于过度应激反应，并通过有效技术手段防控番鸭应激反应，降低应激反应对番鸭健康的影响，并减少应激反应对番鸭肉品质的影响，具有重要意义。hsp70是热休克蛋白家族中主要评价机体应激反应的热休克蛋白，在机体正常的水平状态下其含量较低，一旦机体受到应激，其含量就会明显升高，是作为动物应激反应的重要标志物。
3.现有技术还没有一种有效快速准确检测番鸭应激的技术方法。基于此，提出本发明。


技术实现要素：

4.(1)要解决的技术问题
5.针对现有技术中的不足，本发明提供了一种番鸭应激快速检测方法及其防控方法。本发明旨在解决番鸭处于应激反应时，会危害番鸭健康，同时会降低番鸭肉品质，现有技术缺少有效、快速、准确检测番鸭应激反应的方法的问题，本发明实现了番鸭应激反应的快速、准确检测，利用荧光定量pcr检测hsp70表达量，实现了番鸭应激检测的快速、准确，最快可1h可获得检测结果，番鸭处于机体应激番鸭初期即可通过本发明准确获知，即hsp70表达量高于0.3ng/ml时就处于应激反应。
6.(2)技术方案
7.为了克服上述技术问题，本发明提供了一种番鸭应激快速检测方法，具体步骤为：获取番鸭血液，提取rna，然后反转录cdna，通过荧光定量pcr方法检测hsp70表达量，其中引物为：
8.f:5
’‑
tagtcacaaagccaaaaccc-3’，r:5
’‑
cccactgttgccatccc-3’。
9.更为优选的是，hsp70快速检测序列为：
10.tagtcacaaa
°
gccaaaaccc
°
aaagttgaac
°
tcccaaagga
°
ggagcagaaa
°
ccagctgaac
°
cgaatggacc
°
agtagaaggc
°
cagggggatg
°
gcaacagtgg
°
g，总长101bp。
11.更为优选的是，所述荧光定量pcr方法的扩增体系的总反应体积为20μl，其中2
×
perfectstarttm green qpcr supermix为10μl；hsp70-f为0.4μl；hsp70-r为0.4μl；passive reference dye为0.4μl；cdna为5μl；nuclease-free water为3.8μl；所述荧光定
量pcr方法的扩增条件为：94℃，预变性10min，目的基因以94℃、10s，58℃、30s，72℃、32s进行循环扩增32次；对溶解曲线进行分析，控制条件为94℃、15s；60℃、60s；94℃、15s；60℃、15s。
12.更为优选的是，所述hsp70表达量的绝对定量方法为：标准曲线为y＝-1.96x+18.2(r＝0.983)，其中y为ct值，hsp70表达量为1.35
×
10
8+x
拷贝，即1.5
×
10
x
pg/ml；最低检测1.35
×
102拷贝。
13.更为优选的是，所述番鸭血液为翅膀静脉血液。
14.更为优选的是，所述hsp70表达量的相对定量方法为：以gapdh为内参，对番鸭的组织器官使用2-δδct
法检测番鸭应激水平。
15.更为优选的是，所述器官为心脏、肝脏、脾脏和小肠其中一种或一种以上。
16.进一步地，本发明还提供了一种番鸭应激防控方法，该方法使用上述番鸭应激快速检测方法，具体步骤为：在番鸭长途运输、气候变化、环境温度高于30℃或低于10℃时，提前对番鸭进行应激防护措施，然后抽取番鸭血液并利用上述番鸭应激检测方法检测hsp70表达量，当表达水平大于0.3ng/ml时，表明番鸭处于应激期且应激防护效果不佳，应立即饲喂抗应激药物，以1.5～3.5％拌料饲喂，连续饲喂5d，且在后续养殖过程中遇到长时间运输、气候变化、环境温度高于30℃或低于10℃情况时应提前24h饲喂抗应激药物。
17.进一步地，本发明还提供了一种抗应激药物，所述抗应激药物包括富硒蚯蚓液、富硒饲料桑叶、饲料桑叶、橙皮、橙果、甜菊糖渣、凉茶渣、饲料桑叶、穿心莲。
18.进一步地，本发明还提供了抗应激药物的制备方法，具体包括以下步骤：
19.步骤一：把橙皮、橙果、甜菊糖渣、凉茶渣粉碎成5mm～7mm大小；
20.步骤二：将橙皮、橙果、甜菊糖渣、凉茶渣按照质量分数3：4：5：2混合均匀，得到混合物一；
21.步骤三：向所述混合物一中按1:1加入饲料桑叶和穿心莲，得到混合物二，其中饲料桑叶和穿心莲剪成2
×
3cm大小，质量分数为7:3；
22.步骤四：向所述混合物二中加入酵母菌和乳酸菌，并进行密闭厌氧发酵15d，得到抗应激添加剂a；
23.步骤五：将富硒蚯蚓液加入到富硒饲料桑叶中发酵5d～7d,质量分数为2:8,密封保存，得到抗应激添加剂b,富硒蚯蚓液和富硒饲料桑叶均为自制；
24.步骤六：将所述抗应激添加剂a和所述抗应激添加剂b按质量分数1:1混合均匀，得到抗应激药物。
25.(3)有益效果
26.一、实现了番鸭应激反应的快速、准确检测。应激反应在番鸭养殖中往往不好确诊，按照传统方法只有番鸭处于很明显的发病、或生产性能明显下降等出现临床症状时才能够被知晓，还没有一种快速且准确的检测方法。本发明利用荧光定量pcr检测hsp70表达量，实现了番鸭应激检测的快速、准确，最快可1h可获得检测结果，番鸭处于应激早期即可通过本发明准确获知，即hsp70表达量高于0.3ng/ml时就处于应激反应，实现番鸭应激反应的早发现、早防控。
27.二、实现了番鸭养殖抗应激试验的应激反应快速、准确检测。通过检测心脏、肝脏、脾脏、小肠等器官，用-2-δδct
法，以gapdh为内参，采用相对定量方法用于试验研究中评价不
同番鸭应激水平。
28.三、提出了番鸭高效抗应激防控方法。通过检测番鸭血液hsp70表达量来及时检测番鸭是否处于应激，并用本发明的抗应激药物实现番鸭应激防控，能够明显提高番鸭生长性能、降低发病死亡率，改善肉质，特别是预防番鸭因应激导致的肉质水平下降。
附图说明
29.图1为本发明具体实施方式中实施例1的hsp70 mrna检测荧光曲线；
30.图2为本发明具体实施方式中实施例1的hsp70 mrna检测扩增曲线；
31.图3为本发明具体实施方式中实施例1的hsp70 mrna检测标准曲线；
32.图4为本发明具体实施方式中实施例1的hsp70 mrna检测荧光熔解曲线，检测结果表明引物对番鸭cdna只有唯一的产物吸收峰；
33.图5为本发明具体实施方式中实施例1的hsp70 mrna检测灵敏度检测扩增曲线，检测结果显示，将标准阳性作10倍倍比稀释，至无荧光信号出现，以此计算出荧光定量pcr仪所能检出的最低模板拷贝数为135拷贝/μl。
具体实施方式
34.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明具体实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，以进一步阐述本发明，显然，所描述的具体实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的样式。
35.以下结合部分实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
36.实施例1
37.步骤一：设计一对检测番鸭番鸭应激hsp70 mrna的引物，引物f:5
’‑
tagtcacaaagccaaaaccc-3’，r:5
’‑
cccactgttgccatccc-3’。
38.步骤二：采用pcr技术扩增番鸭快速检测序列为：
39.tagtcacaaa
°
gccaaaaccc
°
aaagttgaac
°
tcccaaagga
°
ggagcagaaa
°
ccagctgaac
°
cgaatggacc
°
agtagaaggc
°
cagggggatg
°
gcaacagtgg
°
g，总长101bp。
40.步骤三：优化hsp70 mrna荧光定量pcr方法，其中扩增体系为：总反应体积20μl，其中2
×
perfectstarttm green qpcr supermix为10μl、hsp 70-f(l0μm)为0.4μl、hsp 70-r(l0μm)为0.4μl、passive reference dye(50
×
)(optional)为0.4μl、cdna为5μl、nuclease-free water为3.8μl。
41.扩增条件：94℃预变性10min，目的基因以94℃、10s，58℃、30s，72℃、32s循环扩增32次，之后对溶解曲线分析：94℃15sec、60℃1min、94℃15sec、60℃15sec。
42.步骤四：建立hsp70表达量绝对定量方法，标准曲线为y＝-1.96x+18.2(r＝0.983)，其中y为ct值，hsp70表达量为1.35
×
10
8+x
拷贝，即1.5
×
10
x
pg/ml。
43.步骤五：建立番鸭应激评价方法，翅膀静脉采血，按照常规方法析出血清，提取rna，反转录cdna，检测hsp70表达量，表达量高于0.3ng/ml，则番鸭处于应激。
44.步骤六：建立检测番鸭心脏、肝脏、脾脏、小肠等器官的hsp70表达量的相对定量pcr检测方法，用2-δδct
法，以gapdh为内参，用于试验研究评价不同番鸭应激水平。
45.步骤七：分别检测长途运输、疾病、热应激、冷应激以及正常环境下番鸭血液hsp70
基因表达水平，其中长途运输超过24h，热应激温度高于30℃，冷应激低于10℃。
46.下表为番鸭部分组织器官hsp70以及内参基因gapdh mrna检测结果：
[0047][0048]
下表为不同应激条件下番鸭血清hsp70相对定量检测结果，采用-2-δδct
法，以gapdh作为内参基因对hsp70表达量进行相对定量分析：
[0049][0050][0051]
可以看出，番鸭在长途运输、疾病、冷热应激下机体hsp70表达量均明显上升。
[0052]
实施例2
[0053]
本实施例与实施例1的区别在于：检测之前提前24h，饲喂抗应激药物，1.5-3.5％拌料饲喂，连续饲喂5d，然后检测番鸭第7天hsp70表达量，并分别观察番鸭4周内发病率、死亡率以及肉质情况。
[0054]
其中抗应激药物配制方法及组成如下：包括富硒蚯蚓液、富硒饲料桑叶、饲料桑叶、橙皮、橙果、甜菊糖渣、凉茶渣、穿心莲。把橙皮、橙果、甜菊糖渣、凉茶渣粉碎成5mm～7mm大小后，按照质量分数3：4：5：2进行混合，然后按照5:5加入到饲料桑叶和穿心莲中，饲料桑叶和穿心莲剪成2
×
3cm大小，质量分数为7:3，加入酵母菌和乳酸菌进行密闭厌氧发酵15d,形成抗应激添加剂a；富硒蚯蚓液加入到富硒饲料桑叶中发酵5d～7d,密封保存，质量分数为2:8，形成抗应激添加剂b；分别进行保存。使用时把a和b按照1:1进行混合，现配现用。
[0055]
实施例3
[0056]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激药物仅由抗应激添加剂a组成。
[0057]
实施例4
[0058]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激药物仅由抗应激添加剂b组成。
[0059]
实施例5
[0060]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激添加剂b仅为发酵饲料桑叶。
[0061]
实施例6
[0062]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激添加剂b组成为非富硒发酵蚯蚓液和非富硒发酵饲料桑叶。
[0063]
实施例7
[0064]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激添加剂a组成不加入凉茶渣和饲料桑叶。
[0065]
实施例8
[0066]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激添加剂a组成不加入甜菊糖渣和穿心莲。
[0067]
实施例9
[0068]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激添加剂a和抗应激添加剂b均不采取发酵处理。
[0069]
对比例1
[0070]
本实施例与实施例2的区别在于：番鸭没有提前24h饲喂抗应激药物。
[0071]
对比例2
[0072]
本实施例与实施例2的区别在于：抗应激药物为电解多维和黄芪多糖。
[0073]
下表为实施例2-9和对比例1-2的发病率、死亡率、料肉比、hsp70表达量测定结果：
[0074][0075][0076]
可以看出，实施例2-9的发病率、死亡率、料肉比、hsp70表达量均明显低于对比例1-2，且实施例2要好于实施例3-9。因此，本技术能够明显缓解番鸭应激，降低发病死亡率，提高饲料转化率。
[0077]
以上描述了本发明的主要技术特征和基本原理及相关优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性具体实施方式的细节，而且在不背离本发明的构思或
基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将上述具体实施方式看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0078]
此外，应当理解，虽然本说明书按照各实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种番鸭应激快速检测方法，其特征在于，具体步骤为：获取番鸭血液，提取rna，然后反转录cdna，通过荧光定量pcr方法检测hsp70表达量，其中引物为：f:5
’‑
tagtcacaaagccaaaaccc-3’，r:5
’‑
cccactgttgccatccc-3’。2.根据权利要求1所述的一种番鸭应激快速检测方法，其特征在于，hsp70快速检测序列为：tagtcacaaa
o
gccaaaaccc
o
aaagttgaac
o
tcccaaagga
o
ggagcagaaa
o
ccagctgaac
o
cgaatggacc
o
agtagaaggc
o
cagggggatg
o
gcaacagtgg
o
g，总长101bp。3.根据权利要求1所述的一种番鸭应激快速检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr方法的扩增体系的总反应体积为20μl，其中2
×
perfectstarttm green qpcr supermix为10μl；hsp70-f为0.4μl；hsp70-r为0.4μl；passive reference dye为0.4μl；cdna为5μl；nuclease-free water为3.8μl；所述荧光定量pcr方法的扩增条件为：94℃,预变性10min；目的基因以94℃、10s，58℃、30s，72℃、32s进行循环扩增32次；对溶解曲线进行分析，控制条件为94℃、15s；60℃、60s；94℃、15s；60℃、15s。4.根据权利要求1所述的一种番鸭应激快速检测方法，其特征在于，所述hsp70表达量的绝对定量方法为：标准曲线为y＝-1.96x+18.2(r＝0.983)，其中y为ct值，hsp70表达量为1.35
×
10
8+x
拷贝，即1.5
×
10
x
pg/ml。5.根据权利要求1所述的一种番鸭应激快速检测方法，所述番鸭血液为翅膀静脉血液。6.根据权利要求1所述的一种番鸭应激快速检测方法，其特征在于，所述hsp70表达量的相对定量方法为：以gapdh为内参，对番鸭的组织器官使用2-δδct
法检测番鸭应激水平。7.根据权利要求6所述的一种番鸭应激快速检测方法，所述器官为心脏、肝脏、脾脏和小肠其中一种或一种以上。8.一种番鸭应激防控方法，其特征在于，该方法使用权利要求1-5所述的一种番鸭应激快速检测方法，抽取番鸭血液，检测其hsp70表达量，当hsp70表达量，hsp70表达量大于0.3ng/ml时，将抗应激药物和拌料混合饲喂番鸭，连续饲喂5d。9.根据权利要求8所述的一种番鸭应激防控方法，其特征在于，抗应激药物和饲料质量分数比为1.5～3.5：96.5～98.5。

技术总结
本发明涉及畜禽养殖技术领域，尤其涉及一种番鸭应激快速检测方法及其防控方法。本发明旨在解决番鸭处于应激反应时，会危害番鸭健康，同时会降低番鸭肉品质，现有技术缺少有效、快速、准确检测番鸭应激反应的方法的问题。本发明的番鸭应激快速检测方法的具体步骤为：获取番鸭血液，提取RNA，然后反转录cDNA，通过荧光定量PCR方法检测Hsp70表达量。本发明实现了番鸭应激反应的快速、准确检测，利用荧光定量PCR检测Hsp70表达量，实现了番鸭应激检测的快速、准确，最快可1h可获得检测结果，番鸭处于机体应激番鸭初期即可通过本发明准确获知，即Hsp70表达量高于0.3ng/ml时就处于应激反应。Hsp70表达量高于0.3ng/ml时就处于应激反应。Hsp70表达量高于0.3ng/ml时就处于应激反应。


技术研发人员：雷小文 李建军 钟云平 刘珍妮 张强 孔智伟 谢华亮
受保护的技术使用者：赣州市畜牧水产研究所
技术研发日：2021.12.23
技术公布日：2022/3/8