一种强化皮肤屏障、抗衰老的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及化妆品技术领域，具体是涉及一种具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.人体约由60-100万亿个细胞组成，细胞的寿命是4-6个月，平均每天有1～2％的细胞死亡(约7000亿)，如果每天细胞死亡数大于新生数，人体就出现衰老现象。人在22岁后，细胞死亡数开始大于新生数，衰老就开始了，衰老的进程快慢与死亡细胞数的大小呈正比。衰老是生物功能的多样化和复杂变化的结果，是从dna损伤的累积到蛋白质的功能障碍以及细胞和组织内的通信改变。从皮肤结构上来说，皮肤的衰老表现为表皮更新速度变慢、屏障功能减弱；表皮细胞的活力降低，修复能力减弱；衰老真皮层中纤维细胞的数量减少，合成胶原蛋白和弹性胶原的能力下降；皮肤的黑色素减少，皮肤易晒伤，大量的脂褐质导致老年斑的生成等。
3.随着消费者抗衰老意识的不断增强，抗衰老人群越来越低龄化。尤其是在女性人群中，无论是否有衰老痕迹，大多数女性都在采取抗衰老干预手段。而且，人们越来越意识到抗衰老不应该只是重视衰老后的补救，更应该注重预防衰老。
4.红曲菌(monascus spp.)是我国具有传统特色的药食两用微生物资源。红曲是指将红曲菌接种于淀粉质原料发酵而成的产品，其成品的颜色多呈赤红色或紫红色。因红曲菌可发酵产生多种功能性代谢产物如莫纳可林k(monacolin k，mk)、红曲色素(monascus pigments，mps)、γ-氨基丁酸、麦角甾醇、红曲活性多糖、辅酶q10、氨基酸等，被广泛应用于食品着色和防腐、营养保健、酿造及医药等领域。其中γ-氨基丁酸为非组成蛋白质的氨基酸、抑制性神经传导物质，渗透性高，能放松紧绷肌肉神经组织，具有抗衰潜力，红曲活性多糖、辅酶q10是重要的抗氧化物质。
5.蒲公英(taraxacum mongolicum hand.－mazz.)，别称婆婆丁、黄花地丁，是菊科蒲公英属多年生草本植物。国家卫健委2019年将蒲公英列入最新版药食同源目录。蒲公英包含黄酮类、酚酸类、甾醇类、多糖类等多种功效成分，其中根中特有具益生菌活性的菊粉。很多临床研究表明，蒲公英具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节免疫力、调节肠道微生态等多种生物学活性。


技术实现要素：

6.本发明的目的是应对上述背景技术的需求，发挥红曲菌的传统优势，将红曲与蒲公英混合发酵，提供一种具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物及其制备方法和应用。本发明利用红曲霉的丰富酶系破除蒲公英植物细胞间的物理屏障，有利于活性成分溶出，提高提取效率，经混合发酵并提取后得到的提取物具有强化皮肤屏障、抵御衰老、抗氧化等功效，能改善熬夜、压力等造成的皮肤状态失衡、肌肤屏障受损、暗沉、粗糙、皱纹等肌肤问题，从整体上提升了皮肤的状态。
7.为达到本发明的目的，本发明具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物包含红曲基质、红曲酶菌和蒲公英。
8.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-15：1-15；其中，所述红曲基质指红曲发酵所用富含淀粉的基质原料(例如淀粉含量60-90％的基质原料)，红曲酶菌的接种量为红曲基质质量的1-10％。
9.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-12：1-15。
10.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-9：5-15。
11.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3：5-15或6-15：1。
12.优选地，在本发明的一些实施例中，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-6：5或6：1。
13.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲基质为大米。
14.再一方面，本发明还提供了一种前述具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
15.(1)种子液制备：红曲霉菌株在培养基上培养1-10d后用无菌水洗下孢子，将孢子悬液接种到液体培养基中，摇床培养1-10d，得到液体种子液；
16.(2)取红曲基质，进行粉碎，加入去离子水，糊化后冷却至室温；
17.(3)将蒲公英粉碎后，加入(2)中所得糊化后产物，混匀，灭菌；
18.(4)在步骤(3)的基础上接种红曲霉种子液，20-40℃下培养1-10d，搅拌通气；
19.(5)将步骤(4)所得进行离心，收集上清液；
20.(6)将步骤(5)所得到的滤渣超声提取后过滤，得滤液；
21.(7)合并滤液，用超滤膜进行过滤，收集二次滤液，即得。
22.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中粉碎粒径为6-200目。
23.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中水料比为5-20：1。
24.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中糊化温度为85-100℃。
25.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中粉碎粒径为60-80目。
26.优选地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中混匀方式为搅拌或超声混匀。
27.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(4)中红曲酶菌接种量为红曲基质的1-10％。
28.优选地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(4)中搅拌速率为1-200r/min。
29.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(6)中超声功率为0.5-0.7kw，超声时间为25-35min。
30.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(6)中过滤方式为0.1-1.0μm孔径微滤膜过滤。
31.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤(7)中超滤膜孔径为0.01-0.05μm。
32.再一方面，本发明还提供了一种前述具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的应用，所述应用为将组合物用于化妆品中。
33.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述化妆品包括但不限于水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜、粉底液等。
34.在总浓度相同时，本发明所提供的组合物的dpph清除率高于单一组分的dpph清除率，说明本发明中红曲和蒲公英这两种单一原料经过组合后可获得更好的dpph清除效果。此外红曲菌能产生淀粉酶、葡萄糖苷酶、纤维素酶等丰富的酶系，能有效破除蒲公英细胞壁和果胶类物质形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，从而提高提取效率。本发明以红曲菌为发酵菌，可以更好地分解和利用中草药，既能提供红曲菌生长所需的营养，也能使蒲公英的活性成分更好地释放、产生新的成分，使得发酵产物兼具红曲及蒲公英的功效，比两者分别提取更能得到优势互补的效果，具有协同增效的作用。
附图说明
35.图1是使用实验例2、7的组合物前后彗星拖尾图；
36.图2为使用实验例2、7的组合物后flg基因的表达分析；
37.图3为使用实验例2、7的组合物后casp14基因的表达分析；
38.图4为使用实验例2、7的组合物后经表皮水分流失tewl值减少率(％)；
39.图5为使用实验例2、7的组合物前后眼角细纹对比图。
具体实施方式
40.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
41.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
42.当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
43.单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
44.本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
45.此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
46.实施例1-8和对比例1-2
47.按表1所示取原料制备具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物，制备方法如下：
48.(1)种子液制备：红曲霉菌株在斜面培养基上培养7d后无菌水洗下孢子，将孢子悬液接种到液体培养基中，摇床培养3d，得到液体种子液；
49.(2)按照比例称取大米，进行粉碎，加入去离子水，糊化后冷却至室温；
50.(3)将蒲公英粉碎后，加入(2)中，混匀，灭菌；
51.(4)接种10％红曲霉种子液，30℃下培养3d，搅拌通气；
52.(5)将步骤(4)所得进行离心，收集上清液；
53.(6)将步骤(5)所得到的滤渣超声提取后用0.1-1.0μm孔径微滤膜过滤，得滤液；
54.(7)合并滤液，用超滤膜(超滤膜孔径为0.01-0.05μm)进行过滤，收集二次滤液，即得；
55.表1实施例1-8及对比例1-2中各组合物的组成比例(红曲基质：蒲公英的组成比例以质量计)。
[0056] 原料组成(红曲基质:蒲公英)实施例13:1实施例23:5实施例33:10实施例43:15实施例59:1实施例615:1实施例76:1实施例86:5对比例11:0对比例20:1
[0057]
本发明实施例和对比例中所述红曲霉菌株已在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为cgmcc no.0272。
[0058]
根据表1并采用上述方法制备各实施例及对比例的组合物，并对所得组合物进行功效测试。
[0059]
细胞毒性测评试验
[0060]
mtt assay是通过对活细胞数进行测定，在检测细胞毒性或细胞增殖时广泛使用的实验方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使水溶性的黄色盐mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝色的甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。生成的结晶甲臜一般加入dmso(二甲亚砜)，溶解后测定吸光度。具体的实验方法是在96多孔板中按照1x104个/孔的密度接种含有质量分数为10％牛血清的dmem培养基和角质形成细胞(hacat)各100μl，培养24小时后换成无血清培养基。在无血
清培养基中分别加入不同浓度的组合物进行处理后培养24小时。之后去除培养基，用20μl的mtt溶液进行处理，在37℃下使其反应2小时。在去除mtt溶液的细胞中加入200μl异丙醇，轻轻地震荡30min，完全溶解结晶甲臜，在570nm处测定吸光度，根据如下公式计算细胞存活率。
[0061][0062]
空白组不加入组合物进行试验。表2所示即为实施例1-8和对比例1-2所得的组合物的细胞毒性结果。
[0063]
表2细胞毒性试验结果
[0064]
[0065][0066]
抗氧化测评试验
[0067]
dpph又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的无水乙醇溶液呈紫色，加入自由基清除剂时，自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，因此可评价清除自由基的能力。
[0068]
取所得组合物适当稀释，用移液器取40μl，再加入160μl的dpph乙醇溶液(200μg/ml)。混匀后于室温避光条件下反应30min，再于517nm处测吸光度a，每组设置3组平行实验计算平均值，计算方法如下：
[0069]
清除率％＝[1-(a
1-a2)]/a0×
100
[0070]
式中：a0为未加入各组合物的dpph溶液的吸光度；
[0071]
a1为加入各组合物后的dpph溶液反应后的吸光度；
[0072]
a2为dpph溶液与各组合物混合后反应前的吸光度。
[0073]
表3所示即为实施例1-8与对比例1-2中各组合物的抗氧化测评试验结果。
[0074]
表3各组合物的抗氧化测评试验结果
[0075]
[0076][0077]
由表3可知：
[0078]
1)实施例1-8所得组合物的dpph清除率均高于对比例1-2，说明红曲基质和蒲公英这两种单一原料组合可获得更好的dpph清除效果；
[0079]
2)dpph清除率与红曲基质和蒲公英这两种单一原料均具有一定量效关系，质量份数增加到一定范围后，上升趋势减缓。对比实施例1-4发现，蒲公英质量份数为10、15的dpph清除率差别不大，而在红曲基质：蒲公英的质量比为3:5时，dpph清除率最高；实施例5-6对比发现红曲基质质量份数为9、15的dpph清除率差别不大，而当红曲基质质量份数为6时dpph清除率最高，且红曲基质：蒲公英的质量比为6:5与6:1的区别不大。因此，结合dpph清除能力考虑，优选实施例2(3:5)和实施例7(6:1)。
[0080]
组合物对dna损伤修复测试
[0081]
为了评估组合物对光诱导的dna损伤修复效果，通过彗星实验(comet assay)测量了dna碎片。
[0082]
首先，用不含血清的培养基将hacat细胞培养24h后，用pbs冲洗。此后将少量覆盖pbs的hacat细胞暴露在uvb(12.5mj/cm2)辐射后(对照组)，立即分别加入实施例2、7的组合物，空白组为无uvb辐射、不加样。反应8h后，收集空白组、对照组和实施例2、7的各细胞，放置在cometslidetm载玻片上。将负载细胞的载玻片在4℃的lysis buffer中反应1h。然后，将各载玻片在重力状态的50v电压中进行电泳后，用蒸馏水和70％乙醇冲洗。最后，用sybr green染色10min后，采用显微镜进行观察。结果显示受到uvb辐射后的hacat细胞dna出现拖尾现象，经实施例2、7处理后，拖尾现象有显著的抑制作用，显示了抑制dna损伤的修复能力，如图1。
[0083]
角质细胞基因表达试验
[0084]
丝聚蛋白filaggrin(flg)是角质细胞终末分化的重要条件，对表皮的分化形成有重要作用，caspase14(casp14，天冬胺酶蛋白水解酶)催化flg分解成天然保湿因子，在角质形成细胞终末分化以及皮肤屏障形成中扮演重要角色，二者结合成为皮肤表面屏障构成的重要条件，作为评价皮肤屏障功能以及表皮分化状态的指标。
[0085]
采用实时荧光定量pcr法检测组合物对靶标基因表达量的调节，阴性对照(细胞不
加药，nt)，阳性对照(透明质酸0.01％，ha)，实施例2(0.1、0.3％)，实施例7(0.1、0.3％)。hacat细胞以3*105/孔接种至6孔板上，培养24h，细胞贴壁生长。将待测样品配制成1x，每孔2ml加入细胞板，于37℃5％co2恒温培养箱继续孵育24h之后，收集细胞，应用purelink mini rna抽提试剂盒对细胞总rna进行提取，核酸浓度定量，每管200-800ng rna作为模板，taqman一步法反应(逆转录+real time-pcr)进行实时定量荧光pcr检测各个基因的相对表达量(20μl体系)。
[0086]
计算公式：fold change＝2-δδct
；
[0087]-δδct＝[(ct靶标基因
–
ct内参基因)treated sample-(ct靶标基因
–
ct内参基因)untreated sample]。此试验中，靶标基因2个，分别为flg、casp14，内参基因1个，为gapdh。
[0088]
结果分别如图2-3所示。
[0089]
其中：
[0090]
1)flg基因表达上，实施例2、7有显著提升，且作用比透明质酸更强；
[0091]
2)天冬胺酶蛋白水解酶的表达上，实施例2、7显著提高casp14基因的表达，且作用比透明质酸强。
[0092]
安全性斑贴测试
[0093]
滴加20μl的待测液于斑试器中，对照孔为空白对照(纯水)；将加有受试物的斑试器贴到受试人员前臂屈侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24小时；分别于去除受试物斑试器后30min、24小时、48小时后按表4观察皮肤刺激性和致敏性，并记录观察结果。
[0094]
表4皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
[0095][0096]
实验结果：对实施例2、7所得组合物进行人体皮肤斑贴测试，结果见表5。
[0097]
表5人体皮肤斑贴试验结果
[0098]
[0099][0100]
人体皮肤斑贴试验结果显示，30人中无皮肤不良反应。
[0101]
皮肤屏障修复测试
[0102]
筛选健康志愿者30名，年龄在22-35岁。使用含1％(质量计)实施例2、实施例7和对比例1-2所得组合物的乳液和空白乳液，每天2次，连续使用28天，使用仪器测试各项指标，结果分别如图4-5所示。
[0103]
tewl值变化率＝(产品使用4周后tewl值-使用前tewl值)
÷
使用前tewl值
×
100％。
[0104]
其中：
[0105]
1)图4为使用不同组合物后经表皮水分流失tewl值减少率(％)图。由图4可知，实施例和对比例的组合物均能改善皮肤经皮水分流失率，改善效果的顺序依次为实施例2＞实施例7＞对比例1＞对比例2，说明实施例2、7对皮肤屏障修复有正向作用。
[0106]
2)图5为使用不同组合物后眼角细纹的对比图。由图5可知，实施例2和实施例7对眼部细纹有明显的改善作用。
[0107]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物，其特征在于，所述具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物包含红曲基质、红曲酶菌和蒲公英。2.根据权利要求1所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物，其特征在于，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-15：1-15；其中，所述红曲基质是红曲发酵所用富含淀粉的基质原料，红曲酶菌的接种量为红曲基质质量的1-10％。3.根据权利要求1所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物，其特征在于，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-12：1-15。4.根据权利要求1所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物，其特征在于，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-9：5-15。5.根据权利要求1所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物，其特征在于，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3：5-15或6-15：1；优选地，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-6：5或6：1；优选地，所述红曲基质为大米。6.权利要求1-5任一项所述具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)种子液制备：红曲霉菌株在培养基上培养1-10d后用无菌水洗下孢子，将孢子悬液接种到液体培养基中，摇床培养1-10d，得到液体种子液；(2)取红曲基质，进行粉碎，加入去离子水，糊化后冷却至室温；(3)将蒲公英粉碎后，加入(2)中所得糊化后产物，混匀，灭菌；(4)在步骤(3)的基础上接种红曲霉种子液，20-40℃下培养1-10d，搅拌通气；(5)将步骤(4)所得进行离心，收集上清液；(6)将步骤(5)所得到的滤渣超声提取后过滤，得滤液；(7)合并滤液，用超滤膜进行过滤，收集二次滤液，即得。7.根据权利要求6所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中粉碎粒径为6-200目；优选地，所述步骤(2)中水料比为5-20：1；优选地，所述步骤(2)中糊化温度为85-100℃。8.根据权利要求6所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中粉碎粒径为60-80目；优选地，所述步骤(3)中混匀方式为搅拌或超声混匀；优选地，所述步骤(4)中红曲酶菌接种量为红曲基质的1-10％；优选地，所述步骤(4)中搅拌速率为1-200r/min；优选地，所述步骤(6)中超声功率为0.5-0.7kw，超声时间为25-35min；优选地，所述步骤(6)中过滤方式为0.1-1.0μm孔径微滤膜过滤；优选地，所述步骤(7)中超滤膜孔径为0.01-0.05μm。9.权利要求1-5任一项所述具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的应用，其特征在于，所述应用为将组合物用于化妆品中。10.根据权利要求9所述的具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物的应用，其特征在于，所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜或粉底液。

技术总结
本发明属于化妆品技术领域，公开了一种具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物及其制备方法和应用。本发明具有强化皮肤屏障、抗衰老功效的组合物包含红曲基质、红曲酶菌和蒲公英，所述红曲基质和蒲公英的质量比为3-15：1-15；其中，所述红曲基质指红曲发酵所用富含淀粉的基质原料，红曲酶菌的接种量为红曲基质质量的1-10％。本发明能够利用红曲霉的丰富酶系破除蒲公英植物细胞间的物理屏障，有利于活性成分溶出，提高提取效率，红曲与蒲公英能够协同增效，强化皮肤屏障，提高抗氧化及抗衰老活性，能够从抗氧化、DNA修复、增强屏障功能、促进皮肤更新等角度达到预防和延缓衰老的作用。皮肤更新等角度达到预防和延缓衰老的作用。皮肤更新等角度达到预防和延缓衰老的作用。


技术研发人员：周春亚 周秋娜 陈欢 金荣熙 申彦晟 金延埈
受保护的技术使用者：如薇化妆品有限公司
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2022/3/8