一种比活提高的泛酸合成酶突变体及其应用

et al. (2018). "a highly active pantothenate synthetase from corynebacterium glutamicum enables the production of d-pantothenic acid with high productivity." appl microbiol biotechnol 102(14): 6039-6046.。
9.本发明的第二目的是提供一种编码上述比活提高的泛酸合成酶突变体的基因。
10.在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no .4。
11.本发明的第三目的是提供含上述基因的质粒或载体。
12.本发明的第四目的是提供携带上述基因的细胞。
13.在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括基因工程菌。
14.在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
15.在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pet-28a(+)为表达载体，以escherichia coli bl21(de3)为表达宿主。
16.本发明的第五目的是提供一种提高泛酸合成酶比活的方法，是将来源于谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的泛酸合成酶第31位的丝氨酸突变为赖氨酸，所述来源于谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的泛酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码所示泛酸合成酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
17.本发明的第六目的是提供泛酸合成酶突变体及表达所述泛酸合成酶突变体的细胞在合成泛酸中的应用。
18.本发明的有益效果：本发明是通过将泛酸合成酶中的底物结合位点附近不带电的氨基酸残基突变为带正电荷的氨基酸残基，得到比活提高的泛酸合成酶突变体，与谷氨酸棒杆菌来源的野生型泛酸合成酶相比，本发明所得的泛酸合成酶突变体s31k酶活提高了70%。
具体实施方式
19.本发明的实施例仅作为本

技术实现要素：
的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
20.本发明涉及的检测方法如下：（一）产物d-泛酸含量的测定方法：将反应样品12000rpm离心1min后，上清液稀释一定倍数，使用 0.22μm水系滤膜过膜，用于高效液相色谱（hplc）检测检测。
21.高效液相色谱操作条件如下：a 流动相成分：95%超纯水、4.9%乙腈、0.1%磷酸，使用 0.20 μm 有机微孔滤膜过膜并超声除气泡；b 色谱柱型号：acquity uplc beh c18 column (100 mm
×
2.1 mm，1.7 μm， waters，uk）；c 参数设置：进样量：10 μl，柱温：30℃，流速：0.9 ml/min，检测波长： 200 nm。
22.d 保留时间：17min（二）泛酸合成酶活力的测定方法：混合物包括：50 mmol/l磷酸钠缓冲液(ph 7.0)，25 mmol/l d-泛解酸钠盐，25mmol/l β-丙氨酸，4.5 mmol/l atp，10 mmol/l mgcl，15 mmol/l kcl，总体积1ml。加入
100 ul泛酸合成酶开始反应，30℃培养30 min，随后添加l mol/l hcl和1 mol/l naoh停止反应。
23.d-泛解酸钠的制备:为降低生产成本，使用l mol/l d-泛酰内酯与l mol/l naoh在室温条件下完全反应3 h生成1 mol/l d-泛解酸钠。
24.酶活定义：一个单位的酶活为在30℃条件下每分钟催化形成1 μmol d-泛酸的酶量。
25.（三）培养基：lb培养基：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。
26.实施例1：泛酸合成酶突变体的制备将来源于谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的泛酸合成酶的氨基酸序列用swissmodel 建模，再将建模结果用hotspotwizard预测，选择了12个点做丙氨酸筛选。其中只有31号位点为正突变。将31号位点做定点饱和突变，以表达载体pet-28a(+)/panc为模板，设计互补引物链(见表1)，s31k(氨基酸序列如seq id no.2所示，编码其的基因的核苷酸序列如seq id no.4所示)的酶活提高最多。
27.表1 泛酸合成酶突变位点的引物1下划线碱基对应于相应突变氨基酸。
28.实施例2：含有表达本发明泛酸合成酶突变体基因的基因工程菌的构建在37℃下，用dpni处理pcr产物30min，随后将处理好的pcr产物通过化学转化法转入表达宿主e.coli bl21(de3)感受态中，将转化的e.coli bl21(de3)涂布到含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基中，在37℃恒温箱中过夜培养12h，从中挑选出单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃下、200r/min培养过夜并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒鉴定测序，最终得到基因工程菌e.coli bl21(de3) (pet-28a(+)/panc)。
29.实施例3：本发明泛酸合成酶突变体的表达宿主菌活化培养：将e.coli bl21(de3)(pet-28a(+)/panc)在lb固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性单菌落接种于含有10ml lb液体培养基的试管中，180rpm 37℃下培养8-10h。
30.泛酸合成酶突变体的表达：将活化好的菌种培养液1ml接种于含有50ml lb液体培
养基的250ml三角瓶中，180rpm 37℃下培养，使od600达到0.6-0.8。加入终浓度为0.5mm iptg，在180rpm 28℃条件下诱导培养16h。
31.各培养基在使用前添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素。
32.实施例4：本发明泛酸合成酶突变体的酶活检测配制50 mmol/l磷酸钠缓冲液(ph 7.0)溶液，并按照上述所示方法配制反应液，加入一定量的泛酸合成酶野生型和突变体s31k分别在30℃下进行反应测定泛酸合成酶突变体的活力。
33.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。


技术特征：
1.一种比活提高的泛酸合成酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。2.如权利要求1所述的一种比活提高的泛酸合成酶突变体，其特征在于，所述泛酸合成酶突变体是以氨基酸序列如seq id no.1所示的泛酸合成酶为亲本酶，将第31位的丝氨酸突变为赖氨酸。3.编码权利要求1所述的泛酸合成酶突变体的基因。4.含权利要求3所述基因的载体。5.表达权利要求1所述泛酸合成酶突变体的细胞。6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞以大肠杆菌为宿主。7.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为基因工程菌，所述基因工程菌以pet 28a(+)为表达载体，以escherichia coli bl21(de3)为表达宿主。8.一种提高泛酸合成酶比活的方法，其特征在于，将氨基酸序列如seq id no.1所示的泛酸合成酶的第31位的丝氨酸突变为赖氨酸。9.权利要求1-2任一项所述泛酸合成酶突变体在合成泛酸中的应用。10.权利要求5-7任一所述细胞在合成泛酸中的应用。

技术总结
本发明属于酶工程技术领域，公开了一种催化能力提高的泛酸合成酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与谷氨酸棒杆菌来源的野生型泛酸合成酶相比，本发明所得的泛酸合成酶突变体S31K酶活提高了70%。所得的泛酸合成酶突变体S31K酶活提高了70%。


技术研发人员：金利群 梁金溪 柳志强 欧阳水平 张博 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2021.12.09
技术公布日：2022/3/8