一种桑叶抗氧化肽及其制备方法

1.本发明属于食品生物技术领域，涉及多肽类的加工技术，具体涉及一种桑叶抗氧化肽及其制备方法。


背景技术：

2.桑叶为桑科桑属植物桑(morus alba l.)的叶，是桑树的主要产物，占地上部分的60%左右。全球的桑树品种约有16种，我国约有11种。桑树的栽培在我国已有4000多年的历史，全国各地均有种植，其中西部地区尤为普遍。我国是世界上最大的桑树种植国，桑叶产量十分丰富。因此，桑叶在我国具有丰富的来源和极大的资源优势。
3.桑叶的药用价值在我国也是源远流长，早在《神农本草经》中就被称作“神仙草”，据《本草纲目》、《中草药手册》等中药学专著记载：桑叶性味甘、苦、寒，入肺、肝经，具有疏风散热、润肺止咳、清肝明目、补血益气、利尿止渴等功效。在临床上主要用于治疗风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花等。现代科学研究发现，桑叶中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质和维生素等营养成分；同时，桑叶中还富含了多种生物活性物质，如多酚、黄酮、桑叶多糖和生物碱类物质等。研究表明，桑叶具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗衰老的生物活性，以及辅助降血糖、降血脂、降血压、改善血管内皮功能和预防动脉粥样硬化等功效。
4.然而，在传统蚕桑业中，桑叶主要用作养蚕，后来也用作畜类、禽类和鱼类的饲料，但整体上用途单一，出现了桑叶严重过剩的现象。桑叶的自然废弃不仅浪费了桑叶这一宝贵资源，同时还造成了环境污染，因而开发桑叶新型的利用途径对改善桑叶资源的利用结构、提高其利用价值都具有重要得意义。
5.自1993年桑叶被国家卫生部列为
ꢀ“
药食同源”植物以来，桑叶面、桑叶茶、桑叶酒、桑叶酱等各类桑叶食品的开发和研究日益深入。桑叶因其富含多种生物活性物质且资源丰富，成为了安全性好、无毒副作用的天然功能食品的理想来源，以桑叶为主或以桑叶的有效组分为主的功能食品也愈发受到人们的重视与青睐。
6.现代科学研究认为，人体内经多种代谢途径产生的自由基具有高度氧化活性，与机体的衰老和各类慢性疾病密切相关。在机体自由基代谢平衡时会被机体清除，当代谢不平衡时，过量的自由基会攻击蛋白质、脂类、核酸等生物大分子，破坏细胞组织，造成机体的氧化损伤，进而诱发各种疾病。因此，为预防自由基氧化对人体造成的危害，各类抗氧化剂的研究迅速发展，被用于防止食品氧化和保健食品的开发中。起初，一些化学合成的抗氧化剂，例如丁基羟基茴香醚(bha)、2,6-二叔丁基对甲苯酚(bht)等被广泛应用。但随着研究的进一步深入，人们不断认识到了人工合成类抗氧化剂本身具有的毒副作用和潜在的安全性隐患，其使用也逐渐被限制或禁止，因此研究者逐步转向从天然产物中提取无毒、高效的天然抗氧化剂。
7.植物来源的抗氧化肽的研究为抗氧化剂提供了新的思路，抗氧化肽能有效地清除体内过剩的自由基，从而保护细胞的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，进而预防各种与氧化损伤有关的疾病的发生。大量研究表明，桑叶中富含多种抗氧化活性物质，具有良
好的清除自由基、改善机体自由基氧化损伤的作用。目前，对于桑叶抗氧化活性的研究主要集中在桑叶多酚、黄酮、生物碱等物质上，而对桑叶蛋白及其生物活性肽的研究较少。而桑叶抗氧化肽，不仅来源丰富、具有良好的抗氧化活性，且具有分子量较小、易吸收、安全性高的优点。
8.经检索发现，现有的有关桑叶肽的专利公开文献较少，其中大多是将包含桑叶在内的几种植物原料复配进行微波提取后，取上清液经浓缩后通过喷雾干燥制得含有桑叶肽的复合固体饮料，或是将一种或几种原料加入蛋白酶后行一次至二次酶解后得到含桑叶肽的全桑叶提取物，得到的产物中含有的桑叶活性肽含量较低、纯度不高，而且对桑叶肽的理化性质和相关生物活性未进行探究。通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献相比存在不同。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于针对现有市场产品的缺失和技术的不足，提供一种桑叶抗氧化肽及其制备方法。该桑叶抗氧化肽分子量小于500da，呈乳白色，具有分子量小、易吸收、安全性高的特点，且有清除自由基的功效；该方法工艺简单、生产成本低，制得的抗氧化肽纯度好且抗氧化活性强，充分实现了桑叶蛋白资源的利用。
10.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种桑叶抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽分子量范围为小于500da。
11.一种如权利要求1所述的桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，从桑叶中分离纯化得到天然抗氧化肽，所述制备方法包括如下步骤：s1，以干燥桑叶粉为原料，采用超声波辅助碱提酸沉法制备桑叶蛋白：称取适量桑叶粉，按一定料液比加入一定浓度的naoh溶液，经超声处理后恒温水浴提取一段时间，离心后收集上清液，得到桑叶蛋白提取液；s2，向s1步骤中所得桑叶蛋白提取液中加入1 mol/l hcl溶液，以调节ph值至桑叶蛋白等电点，静置一段时间后经离心后去上清液，用去离子水洗涤沉淀，再用一定浓度的naoh溶液调节蛋白ph至7.0，得到桑叶蛋白沉淀物；s3，将s2步骤中得到的桑叶蛋白沉淀放入-80℃冰箱预冻，再放入真空冷冻干燥机干燥；一段时间后取出粉碎后过筛即得桑叶蛋白冻干粉，-20℃保存备用；s4，将s3步骤中所得的桑叶蛋白冻干粉用去离子水配制成一定浓度的桑叶蛋白溶液，经水浴加热以除去桑叶蛋白中的蛋白酶抑制剂活性，调节溶液温度至蛋白酶的最适温度，预热10 min后用1 mol/l naoh溶液调节蛋白质溶液ph值至酶的最适ph，加入蛋白酶后在恒温震荡水浴锅中进行酶解，酶解过程中实时调节溶液ph值以保持在酶的最适ph；酶解结束后，将酶解液迅速于灭酶，调回ph至中性后离心取上清，即得桑叶蛋白酶解液；s5，将s4步骤中得到的桑叶蛋白酶解液利用4种不同截留分子量的超滤膜进行超滤，得到5个多肽组分，经真空冷冻干燥后选取抗氧化能力最佳的组分，即得桑叶抗氧化肽，并于-20 ℃保存备用。
12.上述技术方案中，所述桑叶产于四川省泸州市紫金蜜桑叶，采摘于春季3月。
13.上述技术方案中，所述桑叶蛋白等电点ph为3.0~4.0。蛋白质分子由于侧链的存在而带有净电荷，当某一ph值下其表面净电荷为零时，该ph值即为蛋白质的等电点。在等电点
时，溶液中的蛋白质颗粒之间无电荷排斥作用，其溶解度达到最小，而易絮凝而形成沉淀。碱提酸沉法就是利用蛋白在的等电点性质以达到蛋白质分离提取的目的。
14.上述技术方案中，所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任一种或多种。
15.上述技术方案中，所述桑叶抗氧化肽冻干粉呈乳白色，分子量小、溶解性好、安全性高，且其含水量应低于5%。
16.上述技术方案中，s1步骤中所述料液比为1:30 g/ml~1:45 g/ml，naoh浓度为4.0~5.5 g/l，超声处理时间为20 min~55 min，水浴温度为35 ℃~45 ℃，提取时间为50min~75min；所述离心转速为5 000 r/min~8000 r/min，离心时间为10 min~15 min。
17.上述技术方案中，s2步骤中所述桑叶蛋白等电点为ph 3.0~4.0，静置时间为20 min~35 min，所述桑叶蛋白沉淀物为墨绿色膏状。
18.上述技术方案中，s3步骤中所述预冻温度为-80 ℃，预冻时间为12 h，冷冻干燥时间为36 h~72 h。
19.上述技术方案中，s4步骤中所述桑叶蛋白溶液浓度为1%~3%，水浴加入温度为95 ℃，加热时间为10 min；所述实时调节ph值的方法为酶解过程的前30 min，每5 min调节一次ph，之后每30 min调节一次ph；所述灭酶条件为95 ℃水浴10 min。
20.上述技术方案中，s5步骤中所述不同截留分子量的超滤膜为30kd、5kd、1kd、500d，得到分子量分别为
①
＞30kd、
②
5kd～30kd、
③
1kd～5kd、
④
500d～1kd和
⑤
＜500d的5个多肽组分；所述抗氧化能力的表征为自由基清除活性的测定。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明通过试验优化了桑叶蛋白的提取工艺，提高了桑叶蛋白的提取率和纯度。
22.2、与现有桑叶肽专利相比，本发明所述桑叶抗氧化肽是利用提取后的桑叶蛋白作为酶解底物，较全桑叶粉进行酶解得到的抗氧化肽含量和纯度都更高。
23.3、本发明以自由基清除能力为指标，通过试验优化制备桑叶抗氧化肽的工艺，以获得抗氧化活性较高的桑叶肽。
24.4、本发明的方法工艺简单、生产成本低、易于工业化生产，充分实现了桑叶蛋白资源的利用。
具体实施方式
25.以下通过实例对本发明所述桑叶抗氧化肽及其制备方法作进一步说明。
26.实施例1本实施例中，所述桑叶抗氧化肽分子量范围为小于500da。
27.其制备方法如下：s1，以干燥桑叶粉为原料，采用超声波辅助碱提酸沉法制备桑叶蛋白：称取适量桑叶粉，按料液比为1:35g/ml加入4.5 g/l naoh溶液，经超声处理30min后35℃水浴提取50 min，以8000 r/min转速离心10min后收集上清液，得到桑叶蛋白提取液；s2，向s1步骤中所得桑叶蛋白提取液中加入1 mol/l hcl溶液，以调节ph值至桑叶蛋白等电点ph 3.5，静置30 min后经离心后去上清液，用去离子水洗涤沉淀，再用一定浓度
min，以8000 r/min转速离心10min后收集上清液，得到桑叶蛋白提取液；s2，向s1步骤中所得桑叶蛋白提取液中加入1 mol/l hcl溶液，以调节ph值至桑叶蛋白等电点ph 3.2，静置30 min后经离心后去上清液，用去离子水洗涤沉淀，再用一定浓度的naoh溶液调节蛋白ph至7.0，得到桑叶蛋白沉淀物；s3，将s2步骤中得到的桑叶蛋白沉淀放入-80℃冰箱预冻12 h，再放入真空冷冻干燥机干燥；54h后取出粉碎后过筛即得桑叶蛋白冻干粉，-20℃保存备用；s4，将s3步骤中所得的桑叶蛋白冻干粉用去离子水配制成1% 桑叶蛋白溶液，经95℃水浴加热10 min以除去桑叶蛋白中的蛋白酶抑制剂活性，调节溶液温度至37℃，预热10 min后用1 mol/l naoh溶液调节蛋白质溶液ph值至2.0，加入胃蛋白酶后在恒温震荡水浴锅中酶解3.0 h；酶解过程的前30 min，每5 min调节一次酶解液的ph值，之后每30 min调节一次ph值以保持在2.0；酶解结束后，将酶解液迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min，调回ph值至中性后离心取上清，即得桑叶蛋白酶解液；s5，将s4步骤中得到的桑叶蛋白酶解液利用截留分子量分别为30kd、5kd、1kd、500d的超滤膜进行超滤，得到分子量分别为
①
＞30kd、
②
5kd～30kd、
③
1kd～5kd、
④
500d～1kd和
⑤
＜500d的5个多肽组分，经真空冷冻干燥后选取抗氧化能力最佳的组分，即得桑叶抗氧化肽，并于-20 ℃保存备用。
31.实施例4本实施例中，所述桑叶抗氧化肽分子量范围为小于500da。
32.其制备方法如下：s1，以干燥桑叶粉为原料，采用超声波辅助碱提酸沉法制备桑叶蛋白：称取适量桑叶粉，按料液比为1:45g/ml加入5.0 g/l naoh溶液，经超声处理30min后40℃水浴提取70 min，以6000 r/min转速离心15min后收集上清液，得到桑叶蛋白提取液；s2，向s1步骤中所得桑叶蛋白提取液中加入1 mol/l hcl溶液，以调节ph值至桑叶蛋白等电点ph 3.8，静置25 min后经离心后去上清液，用去离子水洗涤沉淀，再用一定浓度的naoh溶液调节蛋白ph至7.0，得到桑叶蛋白沉淀物；s3，将s2步骤中得到的桑叶蛋白沉淀放入-80℃冰箱预冻12 h，再放入真空冷冻干燥机干燥；48h后取出粉碎后过筛即得桑叶蛋白冻干粉，-20℃保存备用；s4，将s3步骤中所得的桑叶蛋白冻干粉用去离子水配制成1% 桑叶蛋白溶液，经95℃水浴加热10 min以除去桑叶蛋白中的蛋白酶抑制剂活性，调节溶液温度至50℃，预热10 min后用1 mol/l naoh溶液调节蛋白质溶液ph值至10.0，加入碱性蛋白酶后在恒温震荡水浴锅中酶解4.5 h；酶解过程的前30 min，每5 min调节一次酶解液的ph值，之后每30 min调节一次ph值以保持在10.0；酶解结束后，将酶解液迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min，调回ph值至中性后离心取上清，即得桑叶蛋白酶解液；s5，将s4步骤中得到的桑叶蛋白酶解液利用截留分子量分别为30kd、5kd、1kd、500d的超滤膜进行超滤，得到分子量分别为
①
＞30kd、
②
5kd～30kd、
③
1kd～5kd、
④
500d～1kd和
⑤
＜500d的5个多肽组分，经真空冷冻干燥后选取抗氧化能力最佳的组分，即得桑叶抗氧化肽，并于-20 ℃保存备用。
33.实施例5本实施例中，所述桑叶抗氧化肽分子量范围为小于500da。
34.其制备方法如下：s1，以干燥桑叶粉为原料，采用超声波辅助碱提酸沉法制备桑叶蛋白：称取适量桑叶粉，按料液比为1:40g/ml加入4.5 g/l naoh溶液，经超声处理45min后55℃水浴提取35 min，以8000 r/min转速离心15min后收集上清液，得到桑叶蛋白提取液；s2，向s1步骤中所得桑叶蛋白提取液中加入1 mol/l hcl溶液，以调节ph值至桑叶蛋白等电点ph 3.3，静置35 min后经离心后去上清液，用去离子水洗涤沉淀，再用一定浓度的naoh溶液调节蛋白ph至7.0，得到桑叶蛋白沉淀物；s3，将s2步骤中得到的桑叶蛋白沉淀放入-80℃冰箱预冻12 h，再放入真空冷冻干燥机干燥；72h后取出粉碎后过筛即得桑叶蛋白冻干粉，-20℃保存备用；s4，将s3步骤中所得的桑叶蛋白冻干粉用去离子水配制成1% 桑叶蛋白溶液，经95℃水浴加热10 min以除去桑叶蛋白中的蛋白酶抑制剂活性，调节溶液温度至55℃，预热10 min后用1 mol/l naoh溶液调节蛋白质溶液ph值至7.0，加入木瓜蛋白酶后在恒温震荡水浴锅中酶解3.5 h；酶解过程的前30 min，每5 min调节一次酶解液的ph值，之后每30 min调节一次ph值以保持在7.0；酶解结束后，将酶解液迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min，调回ph值至中性后离心取上清，即得桑叶蛋白酶解液；s5，将s4步骤中得到的桑叶蛋白酶解液利用截留分子量分别为30kd、5kd、1kd、500d的超滤膜进行超滤，得到分子量分别为
①
＞30kd、
②
5kd～30kd、
③
1kd～5kd、
④
500d～1kd和
⑤
＜500d的5个多肽组分，经真空冷冻干燥后选取抗氧化能力最佳的组分，即得桑叶抗氧化肽，并于-20 ℃保存备用。
35.以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种桑叶抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽分子量范围为小于500da。2.一种如权利要求1所述的桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，从桑叶中分离纯化得到天然抗氧化肽，所述制备方法包括如下步骤：s1，以干燥桑叶粉为原料，采用超声波辅助碱提酸沉法制备桑叶蛋白：称取适量桑叶粉，按一定料液比加入一定浓度的naoh溶液，经超声处理后恒温水浴提取，离心收集上清液，得到桑叶蛋白提取液；s2，向s1步骤中所得桑叶蛋白提取液中逐渐加入适量的1 mol/l hcl溶液，以调节提取液的ph值至桑叶蛋白等电点，静置一段时间后经离心后去除上清液，并用去离子水洗涤沉淀，再加入一定浓度的naoh溶液调节蛋白ph值至7.0，得到桑叶蛋白沉淀物；s3，将s2步骤中得到的桑叶蛋白沉淀放入-80℃冰箱预冻，再放入真空冷冻干燥机干燥；一段时间后取出粉碎后过筛即得桑叶蛋白冻干粉，-20℃保存备用；s4，将s3步骤中所得的桑叶蛋白冻干粉用去离子水配制成一定浓度的桑叶蛋白溶液，经水浴加热以除去桑叶蛋白中的蛋白酶抑制剂活性，调节溶液温度至蛋白酶的最适温度，预热10 min后用1 mol/l naoh溶液调节蛋白质溶液ph值至酶的最适ph值，加入蛋白酶后在恒温震荡水浴锅中进行酶解，酶解过程中实时调节溶液ph值以保持在酶的最适ph值；酶解结束后，将酶解液迅速灭酶，调回ph值至中性后离心取上清，即得桑叶蛋白酶解液；s5，将s4步骤中得到的桑叶蛋白酶解液利用4种不同截留分子量的超滤膜进行超滤，得到5个多肽组分，经真空冷冻干燥后选取抗氧化能力最佳的组分，即得桑叶抗氧化肽，并于-20 ℃保存备用。3.根据权利要求1所述的一种桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，s1步骤中所述料液比为1:30 g/ml~1:45 g/ml，naoh溶液的浓度为4.5~5.5 g/l，超声处理时间为20 min~45 min，水浴温度为35 ℃~55 ℃，提取时间为50min~75min；所述离心转速为5 000 r/min~8000 r/min，离心时间为10 min~15 min。4.根据权利要求1所述的一种桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，s2步骤中所述桑叶蛋白等电点为ph 3.0~4.0，静置时间为20 min~35 min，所述桑叶蛋白沉淀物为墨绿色膏状。5.根据权利要求1所述的一种桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，s3步骤中所述预冻温度为-80 ℃，预冻时间为12 h，冷冻干燥时间为36 h~72 h。6.根据权利要求1所述的一种桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，s4步骤中所述桑叶蛋白溶液浓度为1%~3%，水浴加入温度为95 ℃，加热时间为10 min；所述实时调节ph值的方法为酶解过程的前30 min，每5 min调节一次ph，之后每30 min调节一次ph；所述灭酶条件为95 ℃水浴10 min。7.根据权利要求1所述的一种桑叶抗氧化肽的制备方法，其特征在于，s5步骤中所述不同截留分子量的超滤膜为30kd、5kd、1kd、500d，得到分子量分别为
①
＞30kd、
②
5kd～30kd、
③
1kd～5kd、
④
500d～1kd和
⑤
＜500d的5个多肽组分；所述抗氧化能力的表征为自由基清除活性的测定。8.根据权利要求1所述桑叶抗氧化肽，其特征在于，所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种。9.根据权利要求1所述桑叶抗氧化肽，其特征在于，所述桑叶抗氧化肽冻干粉呈乳白
色，分子量小、溶解性好、安全性高，且其含水量应低于5%。

技术总结
本发明提供了一种桑叶抗氧化肽及其制备方法。本发明所述的桑叶抗氧化肽是以桑叶粉为原料采用超声辅助碱提酸沉法提取桑叶蛋白，经离心、干燥后得到桑叶蛋白冻干粉；桑叶蛋白经酶解得到桑叶蛋白酶解肽，再通过分离纯化制得桑叶抗氧化肽。利用本发明制备的桑叶抗氧化肽分子量小于500Da，呈乳白色，具有分子量小、易吸收、安全性高的特点，且有清除自由基的功效，为桑叶资源的利用提供了新用途，对天然抗氧化剂的开发与应用具有重要意义。剂的开发与应用具有重要意义。


技术研发人员：迟原龙 黄雪娇 任尧
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2022/3/8