一株高产3-甲硫基丙醇的内氏假丝酵母及其应用

1.本发明属于微生物与发酵工程领域，涉及一株内氏假丝酵母，特别涉及一株高产3-甲硫基丙醇的内氏假丝酵母。


背景技术：

2.3-甲硫基丙醇具有强烈的甜香、汤或肉样香气，早在1973年美国食用香料与提取物制造者协会（flavour and extract manufactuere’s association，fema）将其确定为一般认为安全的香料物质，在食品中建议用量为0.1 mg/kg-50 mg/kg，1986年，我国相关食品国家标准也将其列为暂时允许使用的食品香料。尽管3-甲硫基丙醇是否是芝麻香型白酒中的特征风味物质存有争论，但其在部分品牌芝麻香型白酒的风格形成中发挥着重要作用，并且在豉香型白酒及果酒的呈味中也具有重要的贡献，表现出花椰菜和煮熟蔬菜的香气，对风味品质的贡献显著。
3.3-甲硫基丙醇是一种重要的食品香料，在肉味和鱼味及酱油香味等香精中广泛应用，可以通过化学合成方法和生物转化的方法制备。化学合成方法具有成本低、合成快，产物浓度高的优势，但存在的一些诸如原料毒性高、生产过程中的毒副产物难以去除及污染较大等问题引起关注，在一定程度上限制了其在工业化生产中的长期使用，必须拓展新的生产方法。微生物可以将甲硫氨酸转化为3-甲硫基丙醇。虽然，当前微生物转化合成3-甲硫基丙醇的速率不及化学方法，但由于其具有反应条件温和、产物构型单一、绿色环保、所用原料安全无污染等特点，成为近年来制备“绿色”和“天然”的3-甲硫基丙醇的重要发展方向。
4.随着技术和时间的发展，人们对天然产品的需求越来越大，对化学合成物质产生抵触心理，虽然化学合成3-甲硫基丙醇方法逐渐成熟，但是微生物代谢生产3-甲硫基丙醇具有广阔前景。


技术实现要素：

5.针对天然绿色3-甲硫基丙醇不能满足市场需求的问题，本发明提供一种从大曲中分离出来的高产3-甲硫基丙醇的天然菌株yhm-g，乙醇耐受性高、能够利用蛋氨酸生产3-甲硫基丙醇。
6.本发明的另一目的在于提供利用yhm-g生产3-甲硫基丙醇的方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
8.一株内氏假丝酵母（candida naeodendra）yhm-g，保藏编号为cgmcc no. 23668。
9.上述内氏假丝酵母yhm-g可用于生产3-甲硫基丙醇，如在酿酒、调味品、食品添加剂行业中进行应用。
10.一种利用内氏假丝酵母yhm-g生产3-甲硫基丙醇的方法，包括以下步骤：（1）将内氏假丝酵母yhm-g接种于种子培养基中活化，获得种子活化液；（2）将种子活化液接种于发酵培养基发酵，获得含3-甲硫基丙醇的培养液。
11.优选地，所述种子培养基中包含：葡萄糖20 g/l，蛋白胨20 g/l，酵母浸粉10 g/l。
12.优选地，所述活化步骤为：28 ℃、180 r/min下活化24 h。
13.优选地，所述发酵培养基中包含：葡萄糖10~70 g/l，酵母浸粉0.4~2.8 g/l，l-蛋氨酸2~14 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，ph 3~7，氯化亚铁0.02 g/l。
14.更优选地，所述发酵培养基中包含：葡萄糖30~60 g/l，酵母浸粉0.8~1.2 g/l，l-蛋氨酸4~6 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，氯化亚铁0.02 g/l，ph 4~6。
15.更优选地，所述发酵培养基中还包含表面活性剂；选自吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80和triton-100中的至少一种。所述表面活性剂在发酵培养基中的浓度为2~64g/l；优选为2~16g/l。
16.优选地，步骤（2）中接种量为0.1%~6.4%(v/v)；发酵条件为：0~270 r/min，20~36 ℃培养24~96 h。
17.更优选地，步骤（2）中接种量为0.2%~3.2%(v/v)；发酵条件为：135~210 r/min，28~30 ℃培养48~60 h。
18.一种利用内氏假丝酵母yhm-g生产3-甲硫基丙醇的方法，包括以下步骤：（1）将内氏假丝酵母yhm-g接种于种子培养基中28 ℃、180 r/min下活化24 h，获得种子活化液；（2）按照0.5%接种量将种子活化液接种于发酵培养基28 ℃、210 r/min下发酵48h，获得含3-甲硫基丙醇的培养液；所述种子培养基包含葡萄糖20 g/l，蛋白胨20 g/l，酵母浸粉10 g/l；所述发酵培养基中包含：葡萄糖50 g/l，酵母浸粉1.2 g/l，l-蛋氨酸6 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，吐温-80 2.5g/l，氯化亚铁0.02 g/l，ph 6。
19.一种含有上述内氏假丝酵母yhm-g的组合物。
20.根据用途的不同，所述组合物还可以含有其他微生物，内氏假丝酵母yhm-g的底物、保护剂，填料或吸附剂等成分。
21.本发明具有以下优点：本发明提供的内氏假丝酵母(candida naeodendra)yhm-g来源于白酒大曲，相对于已知的菌株，具有3-甲硫基丙醇产量高的特点。经检测，该菌株3-甲硫基丙醇产量可达3.16 g/l。该菌株乙醇耐受性高，其中能在11%的乙醇浓度下生长，属于高耐受乙醇菌株。此外，其ph耐受范围很广（ph 2~12内都能生长），有利于该菌株应用在各种领域中生产3-甲硫基丙醇。进一步地，本发明通过对内氏假丝酵母(candida naeodendra)yhm-g发酵特性的研究，优化了培养基成分及培养条件，提高了该菌3-甲硫基丙醇的产量。
22.生物保藏信息内氏假丝酵母(candida naeodendra)yhm-g，于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.23668。
附图说明
23.图1是酵母yhm-g菌株在wl鉴别培养基上的菌落形态(a)和10
×
100倍细胞形态(b)；图2是酵母yhm-g菌株系统进化发育树；图3是酵母yhm-g菌株对温度(a)、ph(b)、nacl(c)、乙醇(d)和烟碱(e)的耐受性；图4是3-甲硫基丙醇标准品制作的标准曲线；图5是葡萄糖浓度(a)、酵母浸粉浓度(b)、l-蛋氨酸浓度(c)对内氏假丝酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇的影响图6是初始ph(a)、温度(b)、转速(c)、装液量(d)、接种量(e)对内氏假丝酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇的影响；图7是表面活性剂种类(a)、吐温-80浓度(b)、l-蛋氨酸添加时间(c)、培养时间(d)对内氏假丝酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇的影响；图8是各因素两两交互作用对3-甲硫基丙醇浓度影响的3d曲面图，其中，（a）葡萄糖浓度和蛋氨酸添加时间对3-甲硫基丙醇浓度影响的曲面图；（b）酵母浸粉浓度和蛋氨酸添加时间对3-甲硫基丙醇浓度影响的曲面图；（c）葡萄糖浓度和酵母浸粉浓度对3-甲硫基丙醇浓度影响的曲面图。
具体实施方式
24.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
25.实施例1 yhm-g菌株的分离和鉴定按照以下配方配制培养基，分装后121 ℃灭菌20 min，备用：ypd培养基(g/l)：酵母浸粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂粉20；3-甲硫基丙醇转化培养基配方（g/l）：葡萄糖30，酵母浸粉0.8，l-蛋氨酸4，磷酸二氢钾8，磷酸氢二钾6，氯化钠2，硫酸锌0.03，氯化镁0.01，ph调至5，灭菌后加入0.02 g/l氯化亚铁（过0.22 μm滤膜除菌）；wl培养基(g/l)：葡萄糖50，酵母浸粉5，蛋白胨5，磷酸二氢钾0.55，氯化钾0.425，氯化钙0.125，氯化铁0.0025，硫酸镁0.125，硫酸锰0.0025，溴甲酚绿0.022，琼脂20，ph 6.5。
26.1. 目的菌株分离取1 g粉碎混匀的大曲粉，用无菌水稀释10倍。在无菌环境中，将其菌液梯度分别稀释至10-5
、10-6
及10-7
。取0.1 ml各梯度稀释液涂布于ypd平板上，30 ℃培养2 d。挑取白色突起、不透明的具有酵母菌形态的单菌落，在ypd平板上划线，得到纯种酵母菌，甘油管保存备用。将从大曲中筛选到酵母菌接种于ypd培养基中在28 ℃，180 r/min活化24 h。按照0.2%的接种量将活化好的酵母菌种子液接种于已灭菌的3-甲硫基丙醇转化培养基中，在温度为30 ℃，转速为200 r/min的摇床中培养48 h，培养完成后用高效液相色谱仪测定酵母菌合成3-甲硫基丙醇的产量。以酿酒酵母菌株产量为参照，选择比其3-甲硫基丙醇产量高的菌株。从大曲中获得一株编号yhm-g的菌株具有较好的转化能力，能积累较高浓度的3-甲硫基丙醇，该菌株分别斜面和甘油管保存。
27.2. yhm-g菌株鉴定（1）菌落形态：将已活化的酵母菌接种于wl鉴别培养基中，30 ℃下培养48 h，进行菌落形态观察。结果如图1a所示，菌落形态较大呈白色，圆形凸起，边缘规则，菌落表面干燥粗糙且不易挑取且菌落生长处培养基颜色由绿变黄。细胞形态：将步骤（1）中酵母菌细胞固定并滴加美兰染液，于电子显微镜下进行细胞形态观察。显微镜下观察其细胞形态如图1b所示，呈棒状，一端出芽无芽孢，无菌丝体。
28.（2）将酵母菌分别进行糖发酵、碳同化、氮同化和硫化氢、吲哚、甲基红、伏-普实验、柠檬酸盐实验、淀粉水解、尿素试验、明胶水解等生理生化鉴定：糖发酵实验测试的糖类包括：d-半乳糖、d-阿拉伯糖、d-木糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、d-果糖、l-鼠李糖；碳同化实验的碳源包括：丙三醇、乙醇、甘露醇、d-山梨糖、菊糖、d-核糖、d-棉子糖、d-海藻糖；氮同化实验的氮源包括：尿素、亚硝酸钠、硫酸铵、硝酸钾、l-苯丙氨酸、l-赖氨酸。生理生化实验结果如表1，yhm-g菌株可以利用大部分糖类，可以利用乙醇，丙三醇以及菊糖作为唯一的碳源进行生长，可以利用尿素，硝酸铵，l-赖氨酸，l-苯丙氨酸以及亚硝酸钠和硝酸钾作为唯一氮源进行生长，可以产生吲哚，色氨酸酶，能产生淀粉酶分解淀粉，能将柠檬酸钠做碳源进行生长。
29.酵母菌yhm-g的形态与生理生化特征与内氏假丝酵母(candida naeodendra)高度相似，初步认为酵母菌yhm-g为内氏假丝酵母(candida naeodendra)。
30.表1 yhm-g菌株生理生化鉴定结果注：“+”表示阳性反应；
“‑”
表示阴性反应。
31.（3）分子生物学鉴定：收集酵母菌菌体，提取dna为模板，以26s rdna通用引物：nl1 (5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3')和nl4 (5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3')进行pcr扩增，扩增产物电泳检验并测序。采用序列图谱软件bioedit，参照正向序列图谱，进行校对。用校
对后的26s rdna d1/d2区序列，在genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(blast search)，比较供试菌株与已知酵母菌相应序列的相似程度。根据同源性搜索结果，使用mega6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树（图2）。通过blast序列比对以及系统发育树的构建可知，酵母菌yhm-g与内氏假丝酵母(candida naeodendra) kc798430.1亲缘关系最近。
32.结合形态学观察和生理生化特征以及分子生物学将酵母菌yhm-g鉴定为内氏假丝酵母(candida naeodendra)。该菌株于于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏编号为cgmcc no.23668。
33.实施例2 yhm-g菌株的生长特性1. 菌株温度耐受性以ypd培养基为基础培养基，将已活化的菌液接种于ypd培养基中，分别在温度为20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃，转速为180 r/min条件下培养48 h后通过浊度法测定其od
560
。浊度法：将发酵液置于比色皿中，利用分光光度计在波长560 nm处检测发酵液的光密度，所测od值可用来反映菌浓度。结果如图3a所示，本发明所涉及菌株在温度高于40 ℃时无法生长，其最适生长温度为25 ℃。
34.2. 菌株ph耐受性将已活化酵母菌按0.2%的接种量接种于初始ph分别为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14的ypd基础培养基中，在温度为28 ℃，转速为180 r/min的摇床中培养48 h后利用浊度法测定其od
560
。结果如图3b所示，本发明所涉及菌株生长ph范围比较广，可以在ph 2-12之间生长，其最适生长ph为6。
35.3. 菌株nacl耐受性将已活化的酵母菌株按照0.2%的接种量接种于nacl浓度(w/v)分别为0%，3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%的ypd培养基中，在温度为28 ℃，转速为180 r/min的摇床中培养48 h后利用浊度法测定其od
560
。结果如图3c所示，该菌能在nacl浓度为21%以下生长，其耐盐性较强。
36.4. 菌株乙醇耐受性将已活化的酵母菌株按照0.2%的接种量接种于乙醇浓度(v/v)分别为0%，3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%的已灭菌的ypd培养基中，置于温度为28 ℃，转速为180 r/min的摇床中培养48 h后利用浊度法测定其od
560
。结果如图3d所示，该菌能在乙醇浓度12%以下生长，属于高耐受乙醇菌株。
37.5. 菌株烟碱耐受性将已活化的酵母菌株按照5%的接种量接种于烟碱初始浓度分别为0.3 g/l，0.4 g/l，0.6 g/l，0.7 g/l，1.0 g/l，1.2 g/l的烟碱培养基中，在温度为28 ℃，转速为180 r/min的摇床中培养48 h后利用浊度法测定其od
560
。烟碱液体培养基成分为：磷酸氢二钾13.3 g/l，磷酸二氢钾4 g/l，硫酸镁0.2 g/l，0.5 ml微量元素溶液（硫酸锰0.008 g，氯化钙0.05 g，氯化铜0.05 g，硫酸亚铁0.004 g，硫酸锌0.1 g，钼酸钠0.1 g，用0.1 mol/l盐酸定容至1 l），121 ℃灭菌20 min灭菌。烟碱与灭菌富集培养基1:1混匀（烟碱培养基初始浓度为0.05 g/l）。结果如图3e所示，该菌株烟碱耐受浓度达到1.2 g/l。
38.实施例3 yhm-g菌株发酵条件的单因素筛选
1. 3-甲硫基丙醇的检测方法用高效液相色谱仪（agilent 1260 infinity）测定yhm-g发酵液中3-甲硫基丙醇的含量。色谱条件：c-18反相柱(zorbax eclipse plus c-18，4.6
×
250 mm，5 μm)；流动相为甲醇:水=30:70(v/v)；流速0.7 ml/min；检测波长215 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl；3-甲硫基丙醇的保留时间为9.3 min；以0.0-6.0g/l的3-甲硫基丙醇标准溶液在上述条件下测定并以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线，如图4所示，回归方程为y= 3123.5x+245.62 (r2=0.9929)。将待测样品的峰面积带入回归方程中，峰面积为y值，求出3-甲硫基丙醇浓度x（g/l）。
39.2. yhm-g基础发酵条件（1）将酵母菌yhm-g接种于ypd培养基（酵母浸粉10 g/l，蛋白胨20 g/l，葡萄糖20g/l）于28 ℃，180 r/min条件下活化24 h，获得种子液；（2）按照0.2%的接种量将种子液接种于发酵培养基（葡萄糖30 g/l，酵母浸粉0.8 g/l，l-蛋氨酸4 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，ph调至5，灭菌后加入0.02 g/l氯化亚铁（过0.22 μm滤膜除菌））中，30 ℃ 200 r/min培养48 h，获得发酵液；（3）取2 ml发酵液于2 ml离心管，10000 r/min离心10 min，取上清液1.5 ml，经0.22 μm水系滤膜过滤得到待测样品。
40.3. 葡萄糖浓度的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基中葡萄糖浓度分别为1.0% (10 g/l)、2.0% (20 g/l)、3.0% (30 g/l)、4.0% (40 g/l)、5.0% (50 g/l)、6.0% (60 g/l)和7.0% (70 g/l)。结果如图5a所示：当葡萄糖浓度为6.0% (60 g/l)时，酵母yhm-g利用葡萄糖合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.82 g/l。3-甲硫基丙醇产量在葡萄糖浓度为3.0% (30 g/l)到6.0% (60 g/l)之间无显著差异。
41.4. 酵母浸粉浓度的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基中酵母浸粉浓度分别为0% (0 g/l)、0.04% (0.4 g/l)、0.08% (0.8 g/l)、0.16% (1.6 g/l)、0.2% (2.0 g/l)、0.24% (2.4 g/l)和0.28% (2.8 g/l)。结果如图5b所示：当酵母浸粉浓度为0.2% (2.0 g/l)时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为2.02 g/l。3-甲硫基丙醇产量在酵母浸粉浓度为0.2% (2.0 g/l)到0.28% (2.8 g/l)之间无显著差异。
42.5. l-蛋氨酸浓度的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基中蛋氨酸浓度分别为0 g/l、2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l、12 g/l和14 g/l。结果如图5c所示：当l-蛋氨酸浓度为4 g/l时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为2.03 g/l。
43.6. 初始ph的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基的初始ph分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。结果如图6a所示：当初始ph为4.5时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.69 g/l。3-甲硫基丙醇产量在初始ph为4.0到5.5之间无显著差异。
44.7. 温度的优选
采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，步骤（2）发酵温度分别为20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃。结果如图6b所示：当温度为32 ℃时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.87 g/l。
45.8. 转速的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，步骤（2）发酵的转速分别为0 r/min、45 r/min、90 r/min、135 r/min、180 r/min、225 r/min和270 r/min。结果如图6c所示：当转速为135 r/min时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为2.49 g/l。
46.9. 装液量的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，步骤（2）发酵时的装液量分别为25 ml、50 ml、75 ml、100 ml和125 ml/250ml。结果如图6d所示：当装液量为75 ml时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.92 g/l。
47.10. 接种量的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，步骤（2）的接种量分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%和6.4%。结果如图6e所示：当接种量为0.4%时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.89 g/l。3-甲硫基丙醇产量在接种量为0.2%到3.2%之间无显著差异。
48.11. 表面活性剂的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基中分别加入0.2%的不同的表面活性剂（空白、丙三醇、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、triton-100和triton-114）。结果如图7a所示：吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、triton-100对3-甲硫基丙醇产量都有促进作用且无显著差异，当表面活性剂为吐温-80时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为2.31 g/l。
49.12. 吐温-80浓度的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基中加入浓度分别为0 g/l、2 g/l、4 g/l、8 g/l、16 g/l、32 g/l和64 g/l的吐温-80。结果如图7b所示：当吐温-80浓度为16 g/l时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为2.08 g/l。不同浓度的吐温-80对3-甲硫基丙醇产量都有促进作用且无显著差异。
50.13. l-蛋氨酸添加时间的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，发酵培养基中l-蛋氨酸添加时间分别为0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h。结果如图7c所示：当l-蛋氨酸添加时间为24 h时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.47 g/l。
51.14. 培养时间的优选采用基础发酵条件培养酵母yhm-g，不同之处在于，步骤（2）的培养时间分别为0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h。结果如图7c所示：当培养时间为60 h时，酵母yhm-g合成3-甲硫基丙醇含量最高，为1.72 g/l。3-甲硫基丙醇产量在培养时间为48 h到96 h之间无显著差异。
52.实施例4 yhm-g菌株发酵条件的响应面分析1. plackett-burman试验利用mintab 17 (minitab, inc. state college, pa, usa)对实施例3中除表面
活性剂种类以外的11个因素进行plackett-burman试验设计，每个因素3个平行，如表2所示，响应值为3-甲硫基丙醇的浓度。
53.表2 plackett
–
burman试验设计各因素与水平实验结果见表3。3-甲硫基丙醇的变化范围为0.00~2.00 g/l，回归方程为3-甲硫基丙醇浓度=2.1126+0.002173转速(rpm)-0.04118温度(℃)+0.018272葡萄糖浓度(g/l)+0.18997初始ph-0.005191装液量(ml)+0.3529接种量(%)-0.029632蛋氨酸添加时间(h)-0.008589培养时间(h)-0.4476酵母浸粉浓度(g/l)+0.05511蛋氨酸浓度(g/l)+0.05673吐温-80浓度(g/l)。
54.表3 plackett
–
burman试验设计与结果表4 plackett-burman试验显著性分析结果
模型充分性采用方差分析(anova)检验。方差分析表明，该模型具有显著性。模型p值显著(0.001)，一般p值小于0.05为宜。由表4可知，11个因素对3-甲硫基丙醇浓度均有显著影响，因此，对这11个因素进行进一步研究。
55.2. 最陡爬坡试验依据plackett-burman试验结果，结合表4中的回归系数对爬坡试验的步长和方向进行最陡爬坡试验设计，其中转速、葡萄糖浓度、初始ph、接种量、蛋氨酸浓度、吐温-80浓度对3-甲硫基丙醇产量呈现正效应，温度、装液量、蛋氨酸添加时间、培养时间、酵母浸粉浓度呈现负效应。
56.表5 最陡爬坡试验设计及结果最陡爬坡试验设计及结果如表5所示，其中第五组3-甲硫基丙醇产量最高为2.03 g/l。因此将第五组试验条件用作后续响应面试验的中心点。
57.3. 响应面试验通过最陡爬坡试验找到3-甲硫基丙醇产量最高区域后，采用响应面分析方法中的box-behnken试验设计，根据pb试验和最陡爬坡试验结果，对3个最关键因素（蛋氨酸添加时间(a)、葡萄糖浓度(b)酵母浸粉浓度(c)）进行进一步探究，以增强3-甲硫基丙醇产量。每个因素取三个水平，分为编码为-1、0、1，以3-甲硫基丙醇浓度为响应值y，表6为试验设计及结果。从表6可以看出第13组试验3-甲硫基丙醇产量最高，为2.74 g/l。
58.表6 box-behnken试验设计及结果
h，蛋氨酸浓度6 g/l，吐温-80浓度2.5 g/l。
61.为了验证模型预测的准确性，在上述最优发酵条件下重复3次试验，3-甲硫基丙醇的平均产量为3.16 g/l，实际值与预测值2.96 g/l接近，证明模型可靠。
62.应用例1 酵母yhm-g在酿酒中的应用（1）将酵母yhm-g接种于ypd培养基（酵母浸粉10 g/l，蛋白胨20 g/l，葡萄糖20g/l）于28℃，180 r/min条件下活化24 h，获得种子液；（2）取800 g带壳红高粱，采用粉碎机将高粱颗粒破碎为4-5瓣后，加入1.6 l 80℃热水，充分混匀并浸泡24 h，添加200 g稻壳，再次混匀后，均匀平铺在上层垫有纱布的篦子上（不宜过厚），置于沸水蒸锅内，盖盖蒸粮1.5 h。立即将粮食取出，混匀，平铺摊凉。待粮食温度为30℃左右，加入100 g大曲粉（20-40目），实验组中接入10%（以总重量计，w/w）的上述准备的酵母细胞菌悬液，对照组以酿酒酵母代替。混匀后分装在2 l陶瓷坛中，于常温进行固态发酵；（3）准确称取1 g混匀的酒醅，置于15 ml气质小瓶中，加入5 ml饱和食盐水和1
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l 0.5 g/l的2-辛醇，于60℃平衡30 min后，于60℃吸附30 min，进行气质检测挥发性风味物质；（4）结果表明，接种10%的yhm-g的实验组，风味物质含量相比对照组丰富，并且在实验组中检测到3-甲硫基丙醇，而对照组未检测到3-甲硫基丙醇，这表明该菌株在提高白酒中3-甲硫基丙醇含量具有一定的应用潜力。

技术特征：
1.一株内氏假丝酵母（candida naeodendra）yhm-g，保藏编号为cgmcc no. 23668。2.一种权利要求1所述的内氏假丝酵母yhm-g在生产3-甲硫基丙醇中的应用，其特征在于，所述应用为酿酒、调味品制备、食品添加剂制备。3.一种利用权利要求1所述的内氏假丝酵母yhm-g生产3-甲硫基丙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将内氏假丝酵母yhm-g接种于种子培养基中活化，获得种子活化液；（2）将种子活化液接种于发酵培养基发酵，获得含3-甲硫基丙醇的培养液。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养基中包含：葡萄糖20 g/l，蛋白胨20 g/l，酵母浸粉10 g/l；所述活化步骤为：28 ℃、180 r/min下活化24 h；所述发酵培养基中包含：葡萄糖10~70 g/l，酵母浸粉0.4~2.8 g/l，l-蛋氨酸2~14 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，ph 3~7，氯化亚铁0.02 g/l；步骤（2）中，接种量为0.1%~6.4%(v/v)；发酵条件为：0~270 r/min，20~36 ℃培养24~96 h。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包含：葡萄糖30~60 g/l，酵母浸粉0.8~1.2 g/l，l-蛋氨酸4~6 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，氯化亚铁0.02 g/l，ph 4~6；步骤（2）中，接种量为0.2%~3.2%(v/v)；发酵条件为：135~210 r/min，28~30 ℃培养48~60 h。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中还包含表面活性剂；选自吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80和triton-100中的至少一种；所述表面活性剂在发酵培养基中的浓度为2~64g/l；优选为2~16g/l。7.一种利用权利要求1所述的内氏假丝酵母yhm-g生产3-甲硫基丙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将内氏假丝酵母yhm-g接种于种子培养基中28 ℃、180 r/min下活化24 h，获得种子活化液；（2）按照0.5%接种量将种子活化液接种于发酵培养基28 ℃、210 r/min下发酵48h，获得含3-甲硫基丙醇的培养液；所述种子培养基包含葡萄糖20 g/l，蛋白胨20 g/l，酵母浸粉10 g/l；所述发酵培养基中包含：葡萄糖50 g/l，酵母浸粉1.2 g/l，l-蛋氨酸6 g/l，磷酸二氢钾8 g/l，磷酸氢二钾6 g/l，氯化钠2 g/l，硫酸锌0.03 g/l，氯化镁0.01 g/l，吐温-80 2.5g/l，氯化亚铁0.02 g/l，ph 6。8.一种含有权利要求1所述内氏假丝酵母yhm-g的组合物。9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，还含有微生物，内氏假丝酵母yhm-g的底物、保护剂，填料或吸附剂中的一种或几种。

技术总结
本发明属于微生物与发酵工程领域，提供了一株高产3-甲硫基丙醇的内氏假丝酵母，保藏编号为CGMCC NO.23668。该内氏假丝酵母可用于生产3-甲硫基丙醇，产量可达3.16 g/L，且乙醇耐受性高，可在酿酒、调味品、食品添加剂行业中进行应用。行应用。行应用。


技术研发人员：范光森 马景浩 孙宝国 张玉姣 成柳洁 杨然 滕超 詹夏晖
受保护的技术使用者：北京工商大学
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2022/3/8