水杨酸和或对羟基苯甲酸在制备预防和或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用

1.本发明属于植物病害防治技术领域。更具体地，涉及水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用。


背景技术：

2.细菌性软腐病是由细菌性软腐病菌侵染植物所致，其中，最典型、危害最严重的细菌性软腐病菌为迪基氏菌(dickeya)和果胶软腐杆菌(pectobacterium)，这两种菌在世界范围已造成作物和花卉严重的病害，引起的水稻细菌性软腐病、香蕉细菌性软腐病、芋头细菌性软腐病等已成为近几年农业生产的重大威胁。目前对细菌性软腐病的防治主要采用铜制剂和抗生素类杀菌剂，但化学农药的大量使用严重污染了环境，还使病原菌产生了抗逆性。
3.目前在植物病原菌的致病过程中，已发现有七种分泌系统，其中，三型分泌系统(t3ss)对革兰氏阴性菌的致病性尤为重要，主要体现在病原-寄主互作过程中，t3ss通过形成一个注射器状ⅲ型分泌装置，将毒力因子直接注射到寄主细胞内，导致寄主植物的抗病性和非寄主植物的过敏反应(hypersensitive reaction，hr)，因此，t3ss成为了抗菌靶标的优质选择之一。
4.水杨酸(salicylic acid，sa)是一种植物酚类化合物，广泛参与植物种子萌发、衰老相关等基因的表达，尤为重要的是，水杨酸可诱导多种pr基因的表达，如对青花菜灰霉病抗性的诱导，水杨酸的这种诱导能力可帮助诸多植物抵抗病毒、细菌及真菌等病害的侵袭。且与水杨酸为同分异构体的对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid，phba)，对一些真菌、细菌等也有抵抗作用。但目前尚未有水杨酸或对羟基苯甲酸对细菌性软腐病作用的相关研究，因此，关于水杨酸或对羟基苯甲酸对细菌性软腐病菌t3ss表达的影响尚且不得而知。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，旨在提供水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用，为细菌性软腐病的防治提供一种新型、高效的制剂来源。
6.本发明的第一目的是提供水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用。
7.本发明的第二目的是提供水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备细菌性软腐病菌t3ss抑制剂中的应用。
8.本发明的第三目的是提供一种预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂。
9.本发明的第四目的是提供一种细菌性软腐病菌t3ss抑制剂。
10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
11.本发明首次发现水杨酸和/或对羟基苯甲酸可通过有效抑制细菌性软腐病菌t3ss
中hrpa启动子的活性，且可抑制细菌性软腐病菌t3ss对植物过敏反应的诱导能力，进而抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达，从而有效预防和/或治疗细菌性软腐病，可制备为灵敏、稳定的细菌性软腐病菌t3ss抑制剂，也可制备为预防和/或治疗细菌性软腐病的靶向制剂，因此，水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用，以及水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备细菌性软腐病菌t3ss抑制剂中的应用均应在本发明请求保护的范围内。
12.本发明通过构建t3ss报告系统，分别用多功能酶标仪和流式细胞仪测定细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性，结果表明水杨酸处理组和对羟基苯甲酸处理组均显著抑制了细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性；通过测定水杨酸和对羟基苯甲酸作用下，细菌性软腐病菌t3ss对植物过敏反应的诱导能力的变化，发现了水杨酸和对羟基苯甲酸均可显著抑制细菌性软腐病菌t3ss对植物过敏反应的诱导能力；本发明还通过分别将水杨酸和对羟基苯甲酸注射接种到萝卜块茎、马铃薯块茎、芋头块茎、粉蕉苗茎基、水稻苗茎基上，观察萝卜、马铃薯、芋头、香蕉和水稻的生长状况，发现水杨酸处理组和对羟基苯甲酸处理组的作物细菌性软腐病均得到有效治疗。
13.此外，本发明还测定了水杨酸和对羟基苯甲酸处理后细菌性软腐病菌的生长情况，发现水杨酸和对羟基苯甲酸对细菌性软腐病菌的正常生长均没有影响，表明其对细菌性软腐病菌的作用并不依靠杀死细菌，而是通过抑制菌的致病性实现的，因此，将水杨酸和/或对羟基苯甲酸作用于细菌性软腐病菌，不易产生耐药性。
14.其中，水杨酸的cas登录号为69-72-7，化学式为c7h6o3，分子量为138.12。化学结构式如下所示：
[0015][0016]
对羟基苯甲酸的cas登录号为99-96-7，化学式为c7h6o3，分子量为138.12，化学结构式如下所示：
[0017][0018]
优选地，所述预防和/或治疗细菌性软腐病为抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达。
[0019]
进一步优选地，所述抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达为抑制细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性。
[0020]
进一步优选地，所述抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达为抑制细菌性软腐病菌t3ss对植物过敏反应的诱导能力。
[0021]
进一步优选地，所述细菌性软腐病菌为dickeya和/或pectobacterium。
[0022]
更优选地，所述dickeya为达旦提迪基氏菌(d.dadantii)、玉米迪基氏菌(d.zeae)、方中达迪基氏菌(d.fangzhongdai)、水稻迪基氏菌(d.oryzae)中的一种或几种。
[0023]
优选地，所述细菌性软腐病为水稻、香蕉、萝卜、马铃薯或芋头上的细菌性软腐病。
[0024]
此外，本发明还提供了一种预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂和一种细菌性软腐病菌t3ss抑制剂，均以水杨酸和/或对羟基苯甲酸为活性成分，还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型，如注射剂、涂抹剂或水剂等，制剂中水杨酸的浓度优选为0.05～0.20mm，最优选为0.15；而羟基苯甲酸的浓度优选为0.1～0.5mm，最优选为0.4mm。
[0025]
本发明具有以下有益效果：
[0026]
本发明首次发现水杨酸和/或对羟基苯甲酸可通过有效抑制细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性，且可抑制细菌性软腐病菌t3ss对植物过敏反应的诱导能力，进而抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达，从而有效预防和/或治疗细菌性软腐病，可制备为灵敏、稳定的细菌性软腐病菌t3ss抑制剂，也可制备为预防和/或治疗细菌性软腐病的靶向制剂，为水稻、香蕉、萝卜、马铃薯或芋头等作物的细菌性软腐病防治提供了新型、高效的制剂来源。
[0027]
本发明试验结果还表明了水杨酸和/或对羟基苯甲酸对细菌性软腐病菌的正常生长没有影响，表明其对细菌性软腐病菌的作用并不依靠杀死细菌，而是通过抑制菌的致病性实现的，因此，将水杨酸和/或对羟基苯甲酸作用于细菌性软腐病菌，不易产生耐药性。
附图说明
[0028]
图1是ms2(pphrpa-gfp)在白光下的荧光显微镜图。
[0029]
图2是ms2(pphrpa-gfp)在绿光下的荧光显微镜图。
[0030]
图3a是水杨酸作用下各组的荧光强度统计结果，图3b是对羟基苯甲酸作用下各组的荧光强度统计结果。
[0031]
图4是流式细胞仪下的荧光强度试验结果。
[0032]
图5是细菌性软腐病菌od
600
值的统计结果。
[0033]
图6是烟叶上hr反应的情况图。
[0034]
图7a是马铃薯块茎的接种发病状况，图7b是萝卜块茎的接种发病状况，图7c是粉蕉苗的接种发病状况，图7d是芋头块茎的接种发病状况，图7e是水稻苗的接种发病状况。
具体实施方式
[0035]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0036]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0037]
实施例1化合物对hrpa启动子活性的抑制作用
[0038]
一、t3ss报告系统的构建
[0039]
ms2：香蕉细菌性软腐菌d.zeae ms2。
[0040]
ms2(pprobe-nt)：d.zeae ms2菌株携带无hrpa启动子含绿色荧光蛋白编码基因的载体质粒。
[0041]
ms2(pphrpa-gfp)：将d.zeae ms2 t3ss编码三型菌毛基因hrpa的启动子插入到ms2(pprobe-nt)前端，从而构建得到t3ss报告系统ms2(pphrpa-gfp)。
[0042]
将ms2(pphrpa-gfp)在荧光显微镜下进行扫描，得到图1的白光下荧光显微镜图和
图2的绿光下荧光显微镜图。可见，ms2(pphrpa-gfp)在荧光显微镜下能明显显影，说明d.zeae ms2 t3ss编码三型菌毛基因hrpa的启动子已成功插入到ms2(pprobe-nt)的前端，t3ss报告系统构建完成。
[0043]
二、多功能酶标仪下测定对hrpa启动子活性的抑制作用
[0044]
(1)以dmso为溶剂，配置不同浓度的化合物母液(水杨酸母液：0mm、0.05mm、0.10mm、0.15mm、0.20mm；对羟基苯甲酸母液：0mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.5mm)；
[0045]
(2)将ms2、ms2(pphrpa-gfp)和ms2(pprobe-nt)分别在lb+kan平板上划线活化，挑取单菌落接种于lb+kan液体培养基，放入摇床(28℃、200rpm)摇至od
600
＝2.0，得到对应菌液；
[0046]
(3)将菌液和ls5液体培养基分别按1：10比例混合均匀，再分别加入步骤(1)中的化合物母液，充分混匀，得到混合液；
[0047]
(4)将步骤(3)的混合液分装到无菌的96孔板上，每孔100μl，每个处理做3个重复(操作要求迅速，以防止菌液增长影响实验结果)；
[0048]
(5)把96孔板放在摇床(28℃、200rpm)培养14小时后，采用多功能酶标仪检测其荧光强度，记录试验结果。
[0049]
试验结果如图3所示，其中，图3a是水杨酸作用下各组的荧光强度统计结果，图3b是对羟基苯甲酸作用下各组的荧光强度统计结果。
[0050]
从图3可知，随着化合物浓度提高，ms2(pphrpa-gfp)的荧光强度越来越低，说明对hrpa启动子活性的抑制能力越来越强。其中，水杨酸和对羟基苯甲酸对hrpa启动子活性的最大抑制率分别达到67％和42％，说明水杨酸和对羟基苯甲酸可显著抑制细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性。
[0051]
根据“低浓度、高抑制率”的原则，以下实验均选用0.15mm水杨酸和0.4mm对羟基苯甲酸。
[0052]
三、流式细胞仪下测定对hrpa启动子活性的抑制作用
[0053]
(1)将ms2(pphrpa-gfp)在lb+kan平板上划线活化，挑取单菌落接种于lb+kan液体培养基，放入摇床(28℃、200rpm)摇至od
600
＝2.0，得到菌液；
[0054]
(2)将菌液按1：100比例转接至新鲜的ls5培养液中，分成四组，其中一组加入水杨酸至终浓度为0.15mm(水杨酸处理组，ms2(pphrpa-gfp)+sa)，另一组加入对羟基苯甲酸至终浓度为0.4mm(对羟基苯甲酸处理组，ms2(pphrpa-gfp)+phba)，充分混匀，以dmso作为溶剂对照组(等体积，ms2(pphrpa-gfp)+dmso)，以不加药物的组别为空白对照组(ms2(pphrpa-gfp))；四组均放入摇床(28℃、200rpm)培养14h；
[0055]
(3)离心收集菌体，ls5培养液洗菌体一次，0.01mol/l pbs(ph＝7.4)缓冲液重悬菌体，调节od
600
为0.2，用cytoflex流式细胞仪检测gfp平均荧光强度，记录试验结果。
[0056]
试验结果如图4所示，水杨酸处理组和对羟基苯甲酸处理组的荧光强度抑制率分别高达81％和63％，显著高于空白对照组和溶剂对照组，说明水杨酸和对羟基苯甲酸可显著抑制细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性。
[0057]
实施例2化合物不影响细菌性软腐病菌的正常生长
[0058]
一、实验方法
[0059]
将香蕉细菌性软腐菌d.zeae ms2接种至lb液体培养基中28℃、200rpm培养12h后，
按1：10的比例转移至ls5液体培养基中，分成四组，其中一组加入水杨酸至终浓度为0.15mm(水杨酸处理组，ms2+sa)，另一组加入对羟基苯甲酸至终浓度为0.4mm(对羟基苯甲酸处理组，ms2+phba)，另外两组为未加药物处理组(单独菌液的组别：ms2；以dmso为溶剂的菌液组别：ms2+dmso)。再将各组分装于生长曲线板中，每孔200μl，每个处理做4个重复。最后放入全自动生长曲线分析仪中培养，每隔2h测定并记录每组样品的od
600
值，直至细菌生长至平台期。
[0060]
二、实验结果
[0061]
实验结果如图5所示，可见，在8h的培养时间内，水杨酸处理组的od
600
值与未加药物处理组无显著差异，8h后水杨酸处理组有着非常微弱的影响；对羟基苯甲酸处理组的od
600
值与未加药物处理组无显著差异。说明水杨酸不会影响细菌前期的正常生长，而在后期会有非常微弱的影响；对羟基苯甲酸在细菌生长在平台期的整个过程中，均不会影响细菌的正常生长。
[0062]
实施例3化合物对细菌性软腐病菌t3ss表达的抑制作用
[0063]
一、实验方法
[0064]
将香蕉细菌性软腐菌d.zeae ms2在lb固体平板上划线活化，挑取单菌落置于lb液体培养基生长至od
600
为2.0，按1：100转接至新鲜的ls5液体培养基中，生长至od
600
为0.6，离心收集菌体，重悬于ls5液体培养基中，调节od
600
为0.3，分为五组，第一组加入水杨酸至终浓度为0.15mm(水杨酸处理组，ms2+sa)，另一组加入对羟基苯甲酸至终浓度为0.4mm(对羟基苯甲酸处理组，ms2+phba)，另设ms2菌液和ms2+dmso(等体积)作为正对照，ls5液体培养基作为负对照。五组分别在28℃下恒温孵育3h后，各取100μl细菌悬浮液接种于四叶期的广式烟k236叶片，每组设置3个重复。24h后观察广式烟k236叶片上hr反应并统计。
[0065]
二、实验结果
[0066]
实验结果如图6所示，0.15mm水杨酸对ms2在烟叶上的hr完全抑制，0.4mm对羟基苯甲酸对hr产生明显抑制，说明水杨酸和对羟基苯甲酸均可有效抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达。
[0067]
实施例4化合物对细菌性软腐病的防治作用
[0068]
一、实验方法
[0069]
(1)在lb固体平板上活化菌株d.zeae ms2，分别挑单菌落于lb液体培养基28℃、200rpm培养12h，菌液以1：100比例加入至10ml新鲜ls5液体培养基中，放在摇床摇至od
600
＝1.0，离心收集菌体，ls5液体培养基重悬菌体，分为四组，第一组加入水杨酸至终浓度为0.15mm(0.15mm水杨酸处理组，ms2+sa)，另一组加入对羟基苯甲酸至终浓度为0.4mm(0.4mm对羟基苯甲酸处理组，ms2+phba)，另设ms2+dmso(等体积)作为正对照，ls5液体培养基作为负对照。四组分别在28℃下恒温孵育3h后，各取2μl接种到萝卜和马铃薯块茎上，每组做3个重复。24h后拍照记录马铃薯(图7a)和萝卜(图7b)的发病情况。
[0070]
(2)取200μl(1)的四组菌液分别注射到长势相似的粉蕉苗的茎基上，每组做3个重复，每天观察粉蕉苗的生长状况，做好记录。7d后拍照记录发病情况(图7c)。
[0071]
(3)同(1)的实验方法，将d.zeae ms2替换为d.fangzhongdai cl3，得到四组菌液：0.15mm水杨酸处理组(cl3+sa)、0.4mm对羟基苯甲酸处理组(cl3+phba)、cl3+dmso(等体积)组、ls5液体培养基组，分别在28℃下恒温孵育3h后，各取2μl接种到芋头块茎上，每组做3个
重复。24h后拍照记录芋头的发病情况(图7d)。
[0072]
(4)按照(1)的实验方法，将d.zeae ms2替换为d.oryzae ec1，得到四组菌液：0.15mm水杨酸处理组(ec1+sa)、0.4mm对羟基苯甲酸处理组(ec1+phba)、ec1+dmso(等体积)组、ls5液体培养基组，分别在28℃下恒温孵育3h后，每组取300μl菌液分别注射到长势相似的水稻苗的茎基上，每组做3个重复，每天观察水稻苗的生长状况，做好记录。3d后拍照记录发病情况(图7e)。
[0073]
二、实验结果
[0074]
实验结果如图7所示，其中，图7a是马铃薯块茎的接种发病状况，图7b是萝卜块茎的接种发病状况，图7c是粉蕉苗的接种发病状况，图7d是芋头块茎的接种发病状况，图7e是水稻苗的接种发病状况。
[0075]
从图7a、7b、7d可以看出，水杨酸处理组和对羟基苯甲酸处理组的马铃薯块茎、萝卜块茎、芋头块茎的接种发病面积显著小于未加药物处理组；从图7c和7e可以看出，水杨酸处理组和对羟基苯甲酸处理组的粉蕉苗、水稻苗的生长状况显著优于未加药物处理组。说明水杨酸和对羟基苯甲酸可有效预防和/或治疗马铃薯、萝卜、芋头、香蕉和水稻上的细菌性软腐病。
[0076]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗细菌性软腐病为抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达为抑制细菌性软腐病菌t3ss中hrpa启动子的活性。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述抑制细菌性软腐病菌t3ss的表达为抑制细菌性软腐病菌t3ss对植物过敏反应的诱导能力。5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述细菌性软腐病菌为dickeya和/或pectobacterium。6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述细菌性软腐病为水稻、香蕉、萝卜、马铃薯或芋头上的细菌性软腐病。7.水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备细菌性软腐病菌t3ss抑制剂中的应用。8.一种预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂，其特征在于，以水杨酸和/或对羟基苯甲酸为活性成分。9.一种细菌性软腐病菌t3ss抑制剂，其特征在于，以水杨酸和/或对羟基苯甲酸为活性成分。10.根据权利要求9所述细菌性软腐病菌t3ss抑制剂，其特征在于，所述水杨酸的浓度为0.05～0.20mm；所述羟基苯甲酸的浓度为0.1～0.5mm。

技术总结
本发明提供了水杨酸和/或对羟基苯甲酸在制备预防和/或治疗细菌性软腐病的制剂中的应用。本发明首次发现水杨酸和/或对羟基苯甲酸可通过有效抑制细菌性软腐病菌T3SS中hrpA启动子的活性，且可抑制细菌性软腐病菌T3SS对植物过敏反应的诱导能力，进而抑制细菌性软腐病菌T3SS的表达，从而有效预防和/或治疗细菌性软腐病，可制备为灵敏、稳定的细菌性软腐病菌T3SS抑制剂，也可制备为预防和/或治疗细菌性软腐病的靶向制剂。软腐病的靶向制剂。软腐病的靶向制剂。


技术研发人员：周佳暖 胡安群 胡明 张炼辉
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2021.12.17
技术公布日：2022/3/8