TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用的制作方法

tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。


背景技术：

2.人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hpsc)，包括人胚干细胞(human embryonic stem cell，hesc)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hipsc)，是一类能在体外无限增殖，且具有分化为成体几乎所有功能细胞潜能的干细胞。基于这两个特性，hpsc在针对目前尚无有效疗法的疑难杂症的治疗上有着广阔的临床应用前景。目前，随着干细胞技术的快速发展，越来越多的hpsc来源功能细胞产品已在各国获批进入临床试验，包括神经细胞、心肌细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞、间充质类细胞等。另一方面，hpsc来源功能细胞的临床应用，相比于成体来源的细胞产品，面临着更大的安全性风险，尤其是成瘤性风险。hpsc来源的功能细胞的成瘤性风险主要来自以下3个方面：1)细胞产品中hpsc的残留，而hpsc在体内能形成畸胎瘤；2)hpsc的培养、诱导分化过程中积累的基因突变可能引起癌变或病变；3)hpsc诱导分化的功能细胞产品中可能存在具有很强增殖能力的前体细胞，或产品本身就是前体细胞，如神经干细胞，后者在移植入体内后，可能会大量扩增，形成肿瘤。因此，需要建立高灵敏度的方法检测hpsc来源功能细胞产品中的hpsc残留，以确保功能细胞产品中不含hpsc，增加移植的安全性。
3.目前，hpsc残留检测的方法有以下几种：1)免疫荧光染色法，即将待检细胞按一定密度接种于基质胶包被的细胞培养板中，用hpsc特异性免疫荧光抗体对残留的hpsc进行染色，但是该方法灵敏度极低，同时对细胞铺板密度和抗体的特异性要求较高，容易出现假阳性现象。2)流式检测法，即用hpsc特异性标志物(e.g.ssea4和tra-1-81)的流式抗体，对待检细胞进行检测，可以检测hpsc的残留。但是该方法灵敏性较低，即在hpsc存在较多的情况下才能够检测到，且该方法对细胞量和抗体使用量/活性敏感，标准化比较困难。3)培养法，即使用hpsc培养条件，培养待检细胞10～14天，未分化的hpsc经培养形成肉眼可见的克隆；挑出克隆后，可以通过检测多能性基因表达来确认。在培养前，待检细胞中残留的hpsc也可以通过磁珠筛选或流式富集。这种方法可以有效地检测到hpsc残留，但是该方法需要10～14天检测时间，同时会有功能细胞诱导残留hpsc分化产生假阴性的可能。4)rt-qpcr检测方法，相对于抗体染色(免疫荧光法、流式检测法)和培养法，它是一种时间短、灵敏度高、操作相对简单的方法，且有望实现定量分析。通过检测hpsc特异性基因的表达来实现hpsc残留检测的目的。在rt-qpcr检测前，待检细胞中残留的hpsc也可以通过磁珠筛选或流式富集，或用培养法扩增hpsc以提高检测灵敏度。作为检测诱导的功能细胞中hpsc残留检测的基因需要满足以下两个条件：
①
该基因特异性的在hpsc中大量表达；
②
该基因在诱导分化的细胞或成体人功能细胞中不表达或极微量表达。常用的hpsc特异性基因包括sox2、pou5f1、esrg、lin28a、nanog以及tdgf1等，这些基因并不一定都能普适性地适用于不同种类的由
hpsc诱导分化而来的功能细胞。例如，sox2是一个常见的hpsc特异性基因，但它在神经干细胞中也会有表达，因此sox2就并不适用于检测诱导的神经干细胞或神经前体细胞中hpsc的残留；此外，现有技术能够通过rt-qpcr检测lin28a用于检测hpsc诱导的视网膜色素上皮细胞(rpe)中残留的hpsc，该方法已应用于患者，但研究表明，lin28a在诱导的肝脏细胞、内皮细胞以及胰岛小体等细胞中都有表达，因此，lin28a并不适用于这些功能细胞中的hpsc残留检测。
4.目前，专利公开号cn110573607a的专利公开了一种用于检测多能干细胞(psc)分化的细胞培养物中残留的未分化psc的方法，该方法包括细胞的培养；对培养的细胞进行多能性鉴定，鉴定的方法主要是利用qrt-pcr的方法对lin28(lin28a)、oct4(pou5f1)、sox2、foxd3、nanog、podxl、rex1(zfp42)、ssea1(fut4)、dppa2和dppa3基因的检测，并利用参比细胞(msc)和所培养的细胞中多能性的标记物进行对比，来确定所培养的细胞中不存在残留的未分化psc或者所培养的细胞中残留的未分化psc的存在比例低于在msc中psc的已知比例。可见，该方法中涉及多种多能性基因，而有些基因在一些特殊的体细胞中有明显表达，例如lin28a在hipsc诱导的肝脏和内皮等细胞中能够检测到表达，因此不能用于此类诱导型功能细胞中hipsc残留的检测；sox2在神经细胞中会有表达，因此不适用于检测hpsc诱导的神经细胞中hpsc的残留。除此之外，专利1中的方法还涉及培养法，大大增加了检测时间。专利申请号202010813518.2的专利公开了一种使用esrg基因作为通用标记基因的ipsc残留检测方法，具体使用esrg基因作为通用标记基因的ipsc残留检测方法，所述的检测方法是通过qpcr定量检测样本中的esrg基因，并将其与标准品进行对比，从而得到样品中ipsc残留的数量；但是，专利2中并没有说明esrg基因在qpcr方法中的检测灵敏度，因此，我们虽然知道该方法相对于培养法更加迅速，但是并没有保证使用esrg基因作为通用标记基因检测ipsc残留方法的可信度。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用，tdgf1在分化细胞或原代细胞中表达极低，适于检测hpsc来源的多种功能细胞中的hpsc残留。
6.本发明提供了tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。
7.优选的，所述tdgf1包括tdgf1基因和tdgf1蛋白；
8.所述tdgf1基因包括以下至少一种dna片段：
9.1)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；
10.2)与如seq id no:1所示序列互补的dna序列；
11.3)在tdgf1基因全长序列的基础上截取总长度6％以上的dna序列。
12.优选的，所述tdgf1基因包括tdgf1亚型1和tdgf1亚型2，所述tdgf1基因亚型1全长序列的cdna具有seq id no:8所示的核苷酸序列；所述tdgf1基因亚型2全长序列的cdna具有如seq id no:9序列。
13.本发明提供了一种用于检测人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留的试剂盒，包括检测tdgf1基因或tdgf1蛋白表达量的试剂。
14.优选的，检测tdgf1基因表达量的试剂为扩增tdgf1基因用引物对；
15.优选的，所述扩增tdgf1基因用引物对包括seq id no:2/seq id no:3所示的引物对、seq id no:22/seq id no:23所示的引物对或seq id no:24/seq id no:25所示的引物对。
16.检测tdgf1蛋白表达量的试剂能特异性结合tdgf1蛋白的抗体或适配体。
17.优选的，所述试剂盒还包括阳性质控品；
18.所述阳性质控品包括含tdgf1基因片段的重组质粒。
19.优选的，所述试剂盒还包括内参基因rpl13a的扩增引物对；
20.内参基因rpl13a的扩增引物对包括核苷酸序列如seq id no:6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7所示的反向引物。
21.本发明提供了一种检测tdgf1表达量的试剂或所述试剂盒在检测多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留中的应用。
22.本发明提供了一种人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测方法，包括以下步骤：
23.检测待测样品中tdgf1基因或tdgf1蛋白表达水平，tdgf1基因或tdgf1蛋白的表达量的高低表示待测样品中多能干细胞残留量的高低。
24.本发明提供了tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。虽然现有技术中报道了大量能够在多能干细胞中特异性表达的基因，但这些基因在由多能干细胞分化的功能细胞或原代细胞中也会表达，无法解决hpsc来源的功能细胞中hpsc残留的检测大规模生产中普适性问题。本发明提供的tdgf1在由hpsc分化的细胞或原代细胞中几乎不表达，可以针对包括hpsc分化获得的细胞产品(神经细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞、间充质干细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞等一系列细胞)进行检测，不需要更换标记基因；并且利用rt-qpcr检测技术具有检测精确、稳定的特点，并且tdgf1的检测灵敏度高达0.001％，同时相对于培养法(7-14天)大大缩短了检测时间(仅需2-3小时)，大大提高了检测效率，更适合于大规模的生产；其次提高了临床应用的安全性，如检测灵敏度低，有一定量的hpsc残留，会带来很大的临床应用安全隐患问题，给患者带来很多副作用。
25.同时，现有技术中报道的检测不同胚层分化的细胞采用不同种类的基因，因此这些基因用于多能干细胞残留检测的普适性不高，即仅适用于hpsc来源的单一胚层细胞(内胚层、中胚层、外胚层)的hpsc残留检测，因此不能作为一个通用型多能性基因用于hpsc来源的功能细胞中hpsc残留的检测。而本发明提供的tdgf1基因适用于分化的内胚层(肝脏细胞)、中胚层(间充质干细胞、自然杀伤细胞)、外胚层(神经细胞)中hpsc的残留检测，是一种具有普适性的通用型多能性基因用于hpsc残留的检测。并且采用体外培养检测方法验证了tdgf1基因在hpsc残留检测中的真实性和可信性。为后续检测hpsc残留提供了新思路。
26.本发明还提供了一种人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测方法，检测待测样品中tdgf1基因或tdgf1蛋白表达水平，tdgf1基因或tdgf1蛋白的表达量的高低表示待测样品中多能干细胞残留量的高低。本发明提供的方法具有高效、可信、通用性强、适用范围广的特点，可适用于众多由hpsc分化得到功能性细胞的质量监控，为临床提供可靠的细胞产品，并且大大缩短了hpsc残留检测的时间，加速了细胞产品的制备过程。
附图说明
27.图1为候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在ipsc和esc中的表达水平柱形图；
28.图2为候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在人体原代细胞ucmsc中的表达水平柱形图；
29.图3为候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在多种分化细胞(hpsc分化的神经细胞、间充质干细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞)中的表达结果，其中左图为候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a的表达量柱形图；右图为候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a的qpcr检测的ct值；
30.图4为含有nanog、tdgf1标记基因的质粒dna标准品的结构图；
31.图5为标准溶液(含有tdgf1标记基因的质粒dna标准品)的检测灵敏限；
32.图6为标准溶液(含有nanog标记基因的质粒dna标准品)的检测灵敏限；
33.图7为培养法对细胞样本(imdap混不同比例ipsc)进行hpsc残留检测结果。
具体实施方式
34.本发明提供了tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。
35.在本发明中，所述tdgf1优选包括tdgf1基因或tdgf1蛋白。本发明对所述tdgf1基因的序列没有特殊限制，采用来源于tdgf1基因的序列即可。所述tdgf1基因优选来源于多能干细胞。在本发明实施例中，所述tdgf1基因优选包括以下至少一种dna片段：
36.1)核苷酸序列如seq id no:1(tgtgatggatgagcacctcgtggcttccaggactccagaactaccaccgtctgcacgtactaccacttttatgctagttggcatctgcctttctatacaaagctactattaatcgacattgacctatttccagaaatacaattttagatatcatgcaaatttcatgaccagtaaaggctgctgctacaatgtcct)所示的dna片段；
37.2)与如seq id no:1所示序列互补的dna序列；
38.3)在tdgf1基因全长序列的基础上截取总长度6％以上的dna序列。所述tdgf1基因全长序列优选包括亚型1和亚型2。所述tdgf1基因亚型1全长序列的cdna具有如seq id no:8所示的核苷酸序列。所述tdgf1基因亚型2全长序列的cdna具有如seq id no:9所示的核苷酸序列。tdgf1基因中任意截短片段均能够实现多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测目的。在tdgf1基因亚型1的全长序列或tdgf1基因亚型2的全长序列的基础上，优选截取任意区域总长度8％～100％的dna片段，更优选为10％～95％，进一步优选为20％～90％，更进一步优选为30％～80％，再进一步优选为40％～70％，最优进一步优选为50％～60％。所述tdgf1蛋白的序列与所述tdgf1基因编码的氨基酸序列相一致。
39.在本发明中，通过筛选人多能性的候选基因(sox2、pou5f1、lin28a、nanog、tdgf1、esrg)，排除一些可能在人体组织中有微量表达，或在一些极少数细胞中有表达的基因，比如sox2在神经干细胞中有表达，esrg和lin28a在人的生殖器官中有表达，因此，最终筛选的目标候选基因为pou5f1、nanog、tdgf1。随后检测候选基因在hipsc和原代细胞ucmsc中的表达水平，pou5f1、nanog和tdgf1只在hipsc中表达，不在ucmsc中表达。然后检测候选基因在hipsc诱导的功能细胞中的表达水平，结果表明，上述特异性多能性基因在这些分化而来的
功能细胞中不表达或极低量表达，再经过灵敏度检测，结果表明tdgf1的检测限更低，检测灵敏度更高，因此，选择tdgf1基因在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。鉴于nanog基因具有相似的特异性表达特性，所述tdgf1基因优选联合nanog基因在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。因为tdgf1蛋白是tdgf1基因的mrna表达后经过进一步翻译折叠修饰获得，又鉴于上述实验结果表明tdgf1基因的mrna特异性在hipsc中表达而在其诱导的分化细胞中不表达，因此tdgf1蛋白必然也不会在分化细胞中表达，因此检测tdgf1蛋白的表达量也能实现在多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测目的。
40.在本发明中，所述多能干细胞来源功能细胞产品优选包括多巴胺能神经前体细胞(imdap)、视网膜色素上皮细胞(irpe)、间充质干细胞(imsc)、自然杀伤细胞(ink)以及肝脏细胞(ihep)。
41.本发明提供了一种用于检测多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留的试剂盒，包括检测tdgf1基因或tdgf1蛋白表达量的试剂。
42.在本发明中，当试剂盒中包含检测tdgf1基因表达量的试剂时，所述tdgf1基因的片段没有特殊限制，凡是来源tdgf1基因的序列均可，所述tdgf1基因具体序列优选参见上述技术方案中tdgf1基因的描述，在此不作赘述。所述引物对优选以所述tdgf1基因的cdna为模板设计引物。在本发明实施例中，为了举例说明tdgf1基因表达水平情况，以核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物作为扩增tdgf1基因用引物对加以说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。seq id no:2和seq id no:3所示引物扩增得到的tdgf1基因片段如seq id no:1所示。优选用seq id no:22/seq id no:23所示的引物对扩增seq id no:22所示的tdgf1基因片段片段，优选用seq id no:24/seq id no:25所示的引物对扩增seq id no:21所示的tdgf1基因片段。检测方法优选为对qpcr扩增。所述试剂盒中还优选包括qpcr扩增用试剂。本发明对qpcr扩增用试剂的种类和来源不做具体限定，采用本领域所熟知的qpcr扩增用试剂即可。在本发明实施例中，qpcr扩增用试剂为 top green qpcr supermix。所述试剂盒优选还包括逆转录试剂。本发明对所述逆转录试剂的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的逆转录试剂即可。所述试剂盒优选还包括阳性质控品。所述阳性质控品优选包括含tdgf1基因片段的重组质粒。所述tdgf1基因片段的具体序列与试剂盒中引物对的扩增片段相一致。本发明对所述阳性质控品的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组质粒的构建方法即可。在本发明实施例中，所述阳性质控品委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
43.在本发明中，所述试剂盒优选还包括内参基因rpl13a的扩增引物对。在本发明实施例中，内参基因rpl13a的扩增引物对包括核苷酸序列如seq id no:6(gccatcgtggctaaacaggta)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7(gttggtgttcatccgcttgc)所示的反向引物。
44.在本发明中，检测tdgf1蛋白表达量的试剂优选为tdgf1蛋白抗体或适配体。
45.本发明提供了一种检测tdgf1基因和tdgf1蛋白表达量的试剂在检测多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留中的应用。
46.在本发明中，当检测tdgf1基因的表达量时，检测方法优选包括rt-qpcr技术。当检测tdgf1蛋白表达量时，检测方法优选包括免疫印迹技术。当采用rt-qpcr技术检测tdgf1表
达量时，其对应的检测试剂为tdgf1基因扩增用引物对。当采用免疫印迹技术检测tdgf1表达量时，其对应的检测试剂为tdgf1抗体。
47.本发明提供了一种多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测方法，包括以下步骤：
48.检测待测样品中tdgf1基因或tdgf1蛋白的表达水平，tdgf1基因或的tdgf1蛋白表达量的高低表示待测样品中多能干细胞残留量的高低。
49.在本发明中，检测tdgf1基因的方法优选利用qpcr扩增技术完成。检测tdgf1蛋白表达量的方法优选为免疫蛋白印迹技术完成。本发明对qpcr扩增技术和免疫印迹的方法不做特殊限定，采用本领域所熟知的qpcr扩增技术和免疫印迹的方法即可。
50.在本发明中，所述方法检测下限(灵敏度)可以达到0.001％，具有较高的检测灵敏度。更高的检测灵敏度，可以监测多能干细胞来源功能细胞产品的质量，提供更有效的、更适合于大规模生产临床用细胞产品质控监测方法，对多能干细胞来源功能细胞产品在临床应用和大规模生产上具有重大意义。
51.下面结合实施例对本发明提供的tdgf1基因在多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
52.试剂和原料来源的说明
53.rna抽提试剂盒购自tiangen生物公司；
54.rna逆转录试剂盒购自vazyme(诺唯赞)公司；
55.qpcr试剂盒购自transgene(北京全式金生物技术有限公司)。
56.诱导多能干细胞(ipsc)来源于本公司建立的ipsc细胞库(制备方法可参考安徽中盛溯源生物科技有限公司的专利cn201711462604.8；cn201810137319.7；cn201810252408.6；cn201810400878.2；cn202010313083.5)。
57.胚胎干细胞esc来自wicell干细胞库；
58.ucmsc来自来源于医院产科生产后废弃脐带，由安徽中盛溯源生物科技有限公司采用本领域常规技术手段分离培养。
59.hpsc诱导分化获得的神经细胞(cn201910169525.0，cn201910775201.1)、间充质干细胞(cn201910884482.4)、视网膜色素上皮细胞(cn201910320076.5)、自然杀伤细胞(cn202010153358.3)来自于本公司的诱导方法获得。实施例中涉及的引物在南京金斯瑞公司合成。质粒来自南京金斯瑞公司，其合成方法为本领域技术常规技术。
60.tdgf1基因的结构：通过ncbi查找tdgf1的cdna序列，其中tdgf1的cdna序列有2种亚型，亚型1序列长度1921bp(seq id no:8)，亚型2序列长度1741bp(seq id no:9)。从中任意选取一段大于150bp的序列，作为标准品构建的目的基因序列，根据目的基因序列设计引物，目的序列长度大于或等于引物所扩增的长度，本实施例中选取的tdgf1目的基因序列长度为195bp，其核苷酸序列为seq id no:1(tgtgatggatgagcacctcgtggcttccaggactccagaactaccaccgtctgcacgtactaccacttttatgctagttggcatctgcctttctatacaaagctactattaatcgacattgacctatttccagaaatacaattttagatatcatgcaaatttcatgaccagtaaaggctgctgctacaatgtcct)。标准品采用含有tdgf1目的基因序列片段的质粒dna，采用该质粒作为标准品优点是pcr产物获取简单，对引物要求较低，不需要通过总mrna提取、逆转录、pcr扩增以及pcr扩增
产物纯化等一系列复杂过程，并且能够准确定量目的基因，批次稳定，适合临床及研究开发中大规模生产制备hpsc来源的功能性细胞中hpsc的残留检测。本发明所述方法适用于hpsc来源的功能性细胞中hpsc的残留检测，其包含本文中所述的神经细胞、间充质干细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞，但是并不限于本发明所述的hpsc来源的功能性细胞，同样适用于其他hpsc来源的功能性细胞。
61.如涉及人胚胎干细胞(esc)，其是未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取干细胞，以及是经过商业化获批的胚胎干细胞或干细胞。esc来源于医院产科生产后废弃脐带，由安徽中盛溯源生物科技有限公司采用本领域常规技术手段分离培养扩增获得。
62.实施例1
63.检测候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在ipsc(来源于安徽中盛溯源生物科技有限公司)和esc(来源于wicell干细胞库)中的表达水平。
64.首先利用tiangen rna抽提试剂盒(rnaprep pure cell/bacteria kit，#dp430)对ipsc和esc细胞样本进行总mrna的提取；按照2μg rna的量，通过vazyme rna逆转录试剂盒(hiscript ii q rt supermix for qprc，#r223-01)将mrna逆转录为cdna，最后按照transgege qpcr试剂盒( top green qpcr supermix，#aq131)，通过rt-qpcr检测方法检测ipsc和esc中pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a基因的表达，反应体系见表1，反应程序见表2。
65.表1 反应体系
[0066][0067]
表2 反应程序
[0068][0069]
分别以候选多能性基因pou5f1(seq id no:16)、nanog(seq id no:17)、tdgf1(seq id no:8)、sox2(seq id no:18)、lin28a(seq id no:19)的dna序列为模板设计引物。pou5f1的上游引物为cagtgcccgaaacccacac(seq id no:10)，下游引物为ggagacccagcagcctcaaa(seq id no:11)；nanog的上游引物为acaggtgaagacctggttcc(seq id no:4)，下游引物为ggttgctccacattggaagg(seq id no:5)；tdgf1的上游引物为tgtgatggatgagcacctcg(seq id no:2)，下游引物为aggacattgtagcagcagcc(seq id no:3)；sox2的上游引物为aaccagcgcatggacagtt(seq id no:12)，下游引物为cgagctggtcatggagttgta(seq id no:13)；lin28a的上游引物为tccgaaccaaccctttgcc(seq id no:14)，下游引物为caaactgctggttggacacg(seq id no:15)。内参基因是rpl13a，上游引物为gccatcgtggctaaacaggta(seq id no:6)，下游引物为gttggtgttcatccgcttgc(seq id no:7)。
[0070]
扩增结果采用相对定量方法2
‑△△
ct
法进行分析，具体如下：将一次实验的所有基因ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因平均ct值减去自身内参基因平均ct值，得到的数就是
△
ct；换成如式i所示的公式。
[0071]
△
ct＝ct(目的基因)-ct(内参基因)
ꢀꢀꢀꢀ
公式i。
[0072]
然后，将每一组样本每一个目的基因的
△
ct都算好，整理进excel，用本次实验中待研究样本的
△
ct减去对照组样本的
△
ct，并同时对所有结果取相反数(就是加一个负运算，正数就变成负数，负数就变成正数)，该步运算得到的结果就是
‑△△
ct。
[0073]
最后，对
‑△△
ct进行2的幂运算，即2
‑△△
ct
就得出fold change(相对表达量)。
[0074]
结果如图1所示。通过rt-qpcr检测结果可以看出，多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在ipsc和esc中都有大量表达。
[0075]
实施例2
[0076]
检测候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在人体原代细胞ucmsc中的表达水平。
[0077]
同实施例1，首先利用tiangenrna抽提试剂盒对人体原代细胞ucmsc样本进行总mrna的提取；按照2ug rna的量，通过vazyme rna逆转录试剂盒将mrna逆转录为cdna，最后按照transgene qpcr试剂盒，通过rt-qpcr检测方法检测人体原代细胞ucmsc中pou5f1、nanog、tdgf、sox2、lin28a基因的表达(用ipsc作为阳性对照，h2o作为空白对照)，反应体系见同实施例1。所用的pou5f1、nanog、tdgf、sox2、lin28a引物同实施例1。
[0078]
结果如图2所示。通过rt-qpcr检测结果可以看出，这些多能性基因在人体原代细胞ucmsc几乎不表达。
[0079]
实施例3
[0080]
检测候选多能性基因pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a在多种分化细胞(hpsc分化的神经细胞、间充质干细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞)中的表达水平。
[0081]
方法同实施例1，首先利用tiangen rna抽提试剂盒对多种分化细胞(hpsc分化的神经细胞、间充质干细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞)样本进行总mrna的提取；按照2μg rna的量，通过vazyme rna逆转录试剂盒将mrna逆转录为cdna，最后按照transgene qpcr试剂盒，通过rt-qpcr检测方法检测分化细胞中pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a基因的表达，反应体系见表1。所用的pou5f1、nanog、tdgf1、sox2、lin28a引物同实施例1。
[0082]
结果如图3所示。通过rt-qpcr检测结果可以看出，pou5f1和sox2在神经细胞中有表达，lin28a在视网膜色素上皮细胞中有表达(内参基因-rpl13a)；nanog、tdgf1在分化细胞中几乎不表达。
[0083]
实施例4
[0084]
nanog和tdgf1基因最低检测限对比
[0085]
检测多能性基因nanog和tdgf1在不同稀释比例的标准溶液(含有nanog、tdgf1标记基因的质粒dna标准品)中的表达水平。
[0086]
含有nanog、tdgf1标记基因的质粒dna标准品的结构图如图4所示。采用本领域常规应用技术手段构建质粒。
[0087]
标准溶液的制备：采用8个梯度绘制标准曲线，每个梯度进行3次平行试验。根据通用公式计算最高梯度的标准品的拷贝数进行计算：(6.02
×
10
23
拷贝数/摩尔)
×
(浓度g/ml)/(mw g/mol)＝拷贝数/ml；平均分子量(mw g/mol)为双链dna的平均分子量，并且mw＝(碱基数)
×
(660道尔顿/碱基)；并通过分光光度计测量最高梯度标准品的拷贝数，本实施例中，最高梯度标准品的拷贝数为107拷贝数/μl。
[0088]
倍比梯度稀释制备标准品：采用倍比梯度稀释方法对标准品进行稀释；本实施例中，具体的倍比稀释方法为连续10倍稀释，依次倍比稀释，制备出的标准品分别为107拷贝数/μl、106拷贝数/μl、105拷贝数/μl、104拷贝数/μl、103拷贝数/μl、102拷贝数/μl、101拷贝数/μl和0，每个梯度的标准品溶液体积为200μl。
[0089]
利用tiangen rna抽提试剂盒对4
×
106imdap进行总mrna的提取；按照2μg rna的量，通过vazyme rna逆转录试剂盒将mrna逆转录为cdna；将标准品溶液和imdap的cdna按1:1混合，见表3。
[0090]
表3 ddh2o稀释阳性质粒的准备
[0091][0092]
最后按照transgene qpcr试剂盒，通过rt-qpcr检测方法检测分化细胞中nanog、
tdgf1基因的表达，反应体系见表1。
[0093]
结果如图5和图6所示。通过rt-qpcr检测结果绘制标准曲线可以看出，tdgf1相对于nanog，检测灵敏度更好，可检测到的最低拷贝数为2.374copies/ul(nanog可检测到的最低拷贝数为32.092copies/μl)。
[0094]
实施例5
[0095]
利用rt-qpcr方法用tdgf1对由hpsc来源的三胚层功能细胞(内胚层：肝脏细胞-ihep，中胚层：间充质干细胞-imsc、自然杀伤细胞-ink，外胚层：多巴胺能神经前体细胞-imdap)进行hpsc残留检测。
[0096]
高、中、低三个标准溶液样本制备：将标准品溶液(拷贝数分别为103，105，107)和相应检测的细胞样本的cdna按1:1混合，见表4。
[0097]
表4 标准样本和细胞样本的准备
[0098][0099]
分别混有0.001％，0.01％，0.1％hpsc的细胞样本制备：将4
×
106待检细胞分别与40、400、4000hpsc混合成细胞悬液，抽提rna并逆转成cdna，与h2o按1:1混合，见表5。
[0100]
表5 标准样本和细胞样本的准备
[0101][0102][0103]
注：待测细胞为ihep、ink、imsc、imdap。
[0104]
通过rt-qpcr检测方法检测分化细胞中tdgf1基因的表达，反应体系见表1；所用的tdgf1引物同实施例1，每个样本重复检测3次。
[0105]
结果见表6～表9。
[0106]
表6 用tdgf1基因对hpsc来源ihep(内胚层)hpsc残留检测结果
[0107]
[0108][0109]
备注：ct值大于30，tdgf1基因基本认为不表达
[0110]
表7 用tdgf1基因对hpsc来源imsc(中胚层)hpsc残留检测结果
[0111]
[0112][0113]
备注：ct值大于30，tdgf1基因基本认为不表达
[0114]
表8 用tdgf1基因对hpsc来源ink(中胚层)hpsc残留检测的结果
[0115]
[0116][0117]
备注：ct值大于30，tdgf1基因基本认为不表达
[0118]
表9 用tdgf1基因对hpsc来源imdap(外胚层)hpsc残留检测结果
[0119]
[0120][0121][0122]
备注：ct值大于30，tdgf1基因基本认为不表达。
[0123]
从检测结果可以看出，tdgf1基因适用于多种由hpsc来中源的三胚层功能细胞中hpsc残留的检测：ihep、imsc、ink和imdap中残留hpsc的含量＜0.001％(相比于混有0.001％hpsc的细胞样本)；且tdgf1基因检测hpsc残留的灵敏度可达到0.001％。
[0124]
实施例6
[0125]
培养法平行验证利用rt-qpcr方法检测tdgf1基因在hpsc残留检测中的真实性和可信性。
[0126]
使用培养法对细胞样本(100％imdap，100％gfp-ipsc，以及imdap分别混0.0001％，0.001％，0.01％gfp-ipsc)进行培养，观察gfp-ipsc生长及形成可见克隆情况。
[0127]
细胞培养皿的准备：用vitronectin或matrigel或laminin等铺板基质包被细胞培养皿(皿底直径10cm)。
[0128]
细胞样本的准备：将100％imdap，100％gfp-ipsc，以及imdap分别混合0.0001％，0.001％，0.01％gfp-ipsc于多能干细胞培养基中，见表5。
[0129]
细胞接种：将包被有vitronectin的细胞培养皿放于37℃培养箱中预温至少10-30分钟，弃除vitronectin，并加入表4中的细胞混合液，每天观察并更换多能干细胞培养基，15ml/皿。约7-10天可见表4#2～4中有明显ipsc克隆生长，如图7所示(第10天)。
[0130]
通过检测结果可以看出，培养法对细胞样本(imdap混不同比例ipsc)进行残留检测的灵敏度可达到0.001％(即参有0.001％gfp-ipsc组能够长出可见克隆)，与实施例5中利用rt-qpcr快速检测tdgf1基因来确定imdap中ipsc残留的结果一致；同时，由ipsc分化而来的imdap没有长出ipsc样克隆，说明imdap的安全性。综上，体外培养法验证了tdgf基因在hpsc残留检测中的真实性和可信性。
[0131]
实施例7
[0132]
利用rt-qpcr方法用各亚型随机截取tdgf1片段对由hpsc来源的功能细胞中胚层(间充质干细胞-imsc)进行hpsc残留检测。分别选取与各亚型tdgf1全基因序列相似度为6％以上的tdgf1片段检测hpsc来源的功能细胞中hpsc残留。
[0133]
其中片段1，tdgf1片段(相似度6％以上)基因序列截选自亚型1基因序列，片段1序列如下：agtttcccctggacgccttgctcctgcttctgctacgaccttctggggaaaacgaatttctcattttcttcttaaattgccattttcgctttaggagatgaatgttttcctttggctgtt(seq id no:20)，其为tdgf1基因序列的部分片段，该片段与tdgf1全基因序列相似度达到6％以上。
[0134]
其中片段2，tdgf1片段(相似度6％以上)基因序列节选自亚型2，片段2序列如下：
[0135]
cctgccctccctccttctacggacggaactgtgagcacgatgtgcgcaaagagaactgtgggtctgtgccccatgacacctggctgcccaagaagtgttccctgtgtaaatgctggcacg(seq id no:21)。
[0136]
该tdgf1基因序列片段与tdgf1全基因序列相似度达到6％以上。
[0137]
上述2个tdgf1基因序列片段对应引物如下表10。
[0138]
表10 2个tdgf1基因序列片段对应引物序列
[0139][0140]
含有tdgf1基因序列片段的质粒dna标准品的制备参考实施例4，采用本领域常规应用技术手段构建质粒，其结构图如图4所示，只是具体基因序列片段长度不同。
[0141]
高、中、低三个标准溶液样本制备：将标准品溶液(拷贝数分别为103，105，107)和相应检测的细胞样本的cdna按1:1混合，见表4制备方法。
[0142]
分别混有0.001％，0.01％，0.1％hpsc的细胞样本制备：将4
×
106待检细胞分别与40,400,4000hpsc混合成细胞悬液，抽提rna并逆转成cdna，与h2o按1:1混合，见表4。
[0143]
通过rt-qpcr检测方法检测分化细胞中tdgf1基因片段的表达，反应体系见表1；所用的tdgf1片段引物见表10。每个样本重复检测3次。结果见表11。从检测结果可以看出，上述任一截取的各亚型tdgf1基因片段同样适用于由hpsc来源的功能细胞中hpsc残留的检测：imsc中残留hipsc的含量＜0.001％(相比于混有0.001％hipsc的细胞样本)；且tdgf1基因片段检测hipsc残留的灵敏度也可达到0.001％。
[0144]
表11 rt-qpcr检测结果
[0145]
[0146][0147]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述tdgf1包括tdgf1基因或/和tdgf1蛋白；所述tdgf1基因包括以下至少一种dna片段：1)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；2)与如seq id no:1所示序列互补的dna序列；3)在tdgf1基因全长序列的基础上截取总长度6％以上的dna序列。3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于：所述tdgf1基因包括tdgf1亚型1和tdgf1亚型2，所述tdgf1基因亚型1全长序列的cdna具有seq id no:8所示的核苷酸序列；所述tdgf1基因亚型2全长序列的cdna具有如seq id no:9序列。4.一种用于检测人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留的试剂盒，其特征在于，包括检测tdgf1基因或tdgf1蛋白表达量的试剂。5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，检测tdgf1基因表达量的试剂为扩增tdgf1基因用引物对；优选的，所述扩增tdgf1基因用引物对包括seq id no:2/seq id no:3所示的引物对、seq id no:22/seq id no:23所示的引物对或seq id no:24/seq id no:25所示的引物对。6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，检测tdgf1蛋白表达量的试剂能特异性结合tdgf1蛋白的抗体或适配体。7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品；所述阳性质控品包括含tdgf1基因片段的重组质粒。8.根据权利要求4～7任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因rpl13a的扩增引物对；内参基因rpl13a的扩增引物对包括核苷酸序列如seq id no:6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7所示的反向引物。9.一种检测tdgf1表达量的试剂或权利要求4～8任意一项所述试剂盒在检测人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留中的应用。10.一种人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测方法，其特征在于，包括以下步骤：检测待测样品中tdgf1基因或tdgf1蛋白表达水平，tdgf1基因或tdgf1蛋白的表达量的高低表示待测样品中多能干细胞残留量的高低。

技术总结
本发明提供了TDGF1在人多能干细胞(hPSC)来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用，属于生物技术领域。本发明提供的TDGF1在由人多能干细胞分化的细胞或原代细胞中几乎不表达，可以针对由人多能干细胞分化获得内胚层、中胚层和外胚层的分化细胞产品进行检测，不需要更换标记基因；并且具有检测精确、稳定的特点，并且TDGF1的检测灵敏度高达0.001％，同时相对于培养法大大缩短了检测时间，大大提高了检测效率。高了检测效率。高了检测效率。


技术研发人员：焦璐琰 俞君英 张颖
受保护的技术使用者：安徽中盛溯源生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2022/3/8