一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用的制作方法

1.本发明创造属于试剂盒制备领域，尤其是涉及一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用。


背景技术：

2.当前，细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战，其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant enterobacterales， cre）引起的感染形势最为严峻。碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等，是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一。而随着该类药物在临床的广泛应用，肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势。chinet中国细菌耐药监测网历年监测结果显示，我国临床分离肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率从2005年的3%快速攀升至2019年的25%以上，上升幅度高达8倍。2018年全国细菌耐药监测网（carss）数据显示，全国1429所医院临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的平均耐药率为10.1%，部分省市甚至超过20% 。由于cre菌株通常还携带有对其他抗菌药物耐药的基因，对抗菌药物呈广泛耐药甚至全耐药的特征，使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境。
3.产生碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制。
4.碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β-2内酰胺酶，包括ambler分子分类的a、b、d 三类酶。
5.不同国家、不同地区、不同医院、不同人群以及不同细菌所产的碳青霉烯酶种类均有差异。我国临床分离的cre菌株产生的碳青霉烯酶以kpc和ndm型为主，少数菌株产生oxa-48、imp和vim型碳青霉烯酶。kpc-2型酶为kpc型碳青霉烯酶最主要的亚型，ndm-1和ndm-5是ndm型金属酶中最主要的亚型，而oxa-181和oxa-232型酶是oxa-48型碳青霉烯酶中最主要的亚型。chinet中国细菌耐药监测网对2018年收集自全国39所医院935株cre菌株的研究结果显示，产kpc、ndm和oxa-48型碳青霉烯酶菌株所占比例分别为51.6%（482/935）、35.7%（334/935）和7.3%（68/935），其中少数菌株产碳青霉烯酶复合酶。
6.由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同，准确、快速地对cre产生的碳青霉烯酶进行检测并分型，对于临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值。
7.目前实验室检测碳青霉烯酶的方法分为表型检测和基因型检测。表型检测方法包括carba np试验、改良碳青霉烯灭活试验（包括mcim和ecim）、碳青霉烯酶抑制剂增强试验和时间飞行质谱技术等，表型检测耗时较长且对实验人员有较高要求，大部分方法需过夜培养待测菌株，carba np试验、mcim和ecim试验还存在假阴性的风险；基因型检测方法主要是基因检测技术，而该技术对设备和人员培训的要求较高，检测时间一般。相比而言，胶体金技术检测方法的检测时间短（约20min左右），人员培训要求低，对设备无需求。
8.而对于胶体金平台，广谱抗体的筛选及配对是一大技术难题。因为如果用单一亚型的重组完整抗原去免疫动物，有可能获得仅针对该亚型表位的抗体，而用这些抗体去检
测时会出现部分亚型漏检的假阴性情况；另外使用单一亚型的重组完整抗原进行动物免疫也会产生大量的针对单一表位或邻近表位的抗体，这类抗体因存在空间位阻而无法配对，给配对抗体的筛选带来很大的困难。为了方便客户同时进行5种碳青霉烯酶（kpc、ndm、oxa-48、vim和imp）的检测，最好将这5种碳青霉烯酶检测放在同一检测卡上，需要根据不同种碳青霉烯酶抗体是否存在交叉或干扰的特点来进行的排列组合，从而来制备胶体金检测卡。另外，高效裂解液的开发也是影响检测试剂灵敏度的一个重要因素，裂解液的组分对层析试剂的影响需要进行验证，需要筛选不影响层析试剂同时裂解效果好的组分来配制并优化组成。


技术实现要素：

9.有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用。
10.为达到上述目的，本发明提供一种碳青霉烯酶保守抗原，所述保守抗原为具有氨基酸序列如seq id no：1～15中的任意一条或几条所示，或者具有经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。
11.本发明还提供一种碳青霉烯酶的广谱特异性抗体，所述广谱特异性抗体为由上述保守抗原制备得到的单克隆抗体或多克隆抗体。
12.本发明还提供一种碳青霉烯酶检测试剂，所述检测试剂包括革兰氏阴性细菌裂解液以及上述保守抗原或上述广谱特异性抗体。
13.优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液的有效成分为：月桂酰肌胺酸钠、chaps、sds中的一种或几种的混合物。
14.优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液中月桂酰肌胺酸钠的质量0.1%~1%。
15.优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液中chaps 的质量百分比为0.01%~0.1%。
16.优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液中sds的质量百分比为0.1%~1%。
17.优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液包含质量百分比为0.2%的月桂酰基氨酸钠、0.02% 的chaps和0.1%的 sds。
18.本发明还提供一种碳青霉烯酶检测试剂盒，所述试剂盒包含上述碳青霉烯酶检测试剂。
19.优选的，所述碳青霉烯酶检测试剂盒为胶体金检测试剂盒，所述试剂盒中的抗体标记物为胶体金。
20.相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：（1）本发明使用的抗原为碳青霉烯酶保守抗原，在常见亚型中均存在的氨基酸片段，用其免疫动物获得的单克隆抗体或多克隆抗体对常见亚型均有识别，出现假阴性的概率极低。
21.（2）本发明使用的革兰氏阴性细菌裂解液，该裂解液对检测抗体和层析效果影响小，操作简单时间短，无需设备，且裂解效果可达到物理破碎方法的90%以上。
附图说明
22.图1为本发明实施例1制得的碳青霉烯酶的sds-page电泳图；
图2为本发明实施例2制得的碳青霉烯酶单克隆抗体sds-page电泳图；图3为本发明试验例2中试验组1-6以及对照组的镜检图图4为本发明试验例2中对照组与实验组的镜检图。
具体实施方式
23.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
24.下面结合实施例来详细说明本发明创造。
25.实施例1制备碳青霉烯酶抗原1、制备碳青霉烯酶kpc本发明通过ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation，美国国立生物技术信息中心)序列比对，获得碳青霉烯酶kpc（kpc-2~kpc-82）的保守序列，包括：kpc-n端保守区域19g~102v、kpc-c端保守区域180s~238g、kpc-n+c保守区域），其氨基酸序列如seqidno.1-3所示。通过原核基因表达得到高纯度蛋白，基因表达过程如下：（1）引物设计根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增目标基因，上下游分别含有ecori和xhoi酶切位点。引物序列如下：kpc-n端保守区域上游引物：5’ttgaattcggcttttctgcca3’(ecori)kpc-n端保守区域下游引物：5’tctcgaggaaccagcgcattt3’(xhoi)kpc-c端保守区域上游引物：5’ttgaattccatcgccgcgcgcc3’(ecori)kpc-c端保守区域下游引物：5’tctcgagtccgcaggttccg3’(xhoi)kpc-保守区域上游引物：5’ttgaattcggcttttctgcca3’(ecori)kpc-保守区域下游引物：5’ttgaattctccgcaggttccg3’(ecori)（2）基因扩增常规sds碱裂解法破碎待测革兰氏阴性菌细胞壁，采用市售dna提取试剂盒，按照说明操作，获得总dna，并以其为模板扩增目标基因。pcr反应体系：extaq10*buffer2.5μldntpmixture2.5μl上游引物1.0μl下游引物1.0μldna模板1.5μlextaqdna聚合酶0.5μlddh2o16μl总体积25.0μlpcr运行条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃再延伸5min。
26.（3）采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pet-28a（+）-pm，采用cacl2热激法将重组载体转化到大肠杆菌dh5a感受态中。利用含100μg/ml氨苄青
霉素的lb培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行pcr鉴定，确定目标基因存在。
27.（4）表达及纯化将提取的表达质粒pet-28a（+）-pmaa转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/ml氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1ml过夜培养物接种到200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，震荡培养至对数期（od600在0.5-0.6），加入iptg（1mmol/l）,16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，纯化产物经sds-page检测，片段大小合适，为目标蛋白，sds-page电泳图如图1所示（图中m1为marker，泳道1为碳青霉烯酶kpc表达蛋白）。
28.2、制备碳青霉烯酶ndm本发明通过ncbi序列比对，获得碳青霉烯酶ndm（ndm1~15，ndm17~31）的保守序列，其氨基酸序列如seqidno.4-6所示。通过原核基因表达得到高纯度蛋白，基因表达过程如下：（1）引物设计根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增目标基因，上下游分别含有ecori和xhoi酶切位点。引物序列如下：ndm-n端保守区域上游引物：5'ttgaattcgagcaccgcattag3'(ecori)ndm-n端保守区域下游引物：5’ttgaattcgttggaagcgactg3’(ecori)ndm-c端保守区域上游引物：5'ttgaattcatggctgggtcgaa3'(ecori)ndm-c端保守区域下游引物：5’tctcgaggcgggccgtatgag3’(xhoi)ndm-保守区域上游引物：5’ttgaattcggtcgcgaagctga3’(ecori)ndm-保守区域下游引物：5’ttgaattcatgcgggccgtatg3’(ecori)（2）基因扩增常规sds碱裂解法破碎待测革兰氏阴性菌细胞壁，采用市售dna提取试剂盒，按照说明操作，获得总dna，并以其为模板扩增目标基因。pcr反应体系：extaq10*buffer2.5μldntpmixture2.5μl上游引物1.0μl下游引物1.0μldna模板1.5μlextaqdna聚合酶0.5μlddh2o16μl总体积25.0μlpcr运行条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，54℃退火30s，72℃延伸18s，共30个循环；72℃再延伸5min。
29.（3）采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pet-28a（+）-pm，采用cacl2热激法将从组载体转化到大肠杆菌dh5a感受态中。利用含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行pcr鉴定，确定目标基因存在。
30.（4）表达及纯化将提取的表达质粒pet-28a（+）-pmaa转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/ml氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1ml过夜培养物接种到200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，震荡培养至对数期（od600在0.5-0.6），加入iptg（1mmol/l）,16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，纯化产物经sds-page检测，片段大小合适，为目标蛋白，sds-page电泳图如图1所示（图中m1为marker，泳道2为碳青霉烯酶ndm表达蛋白）。
31.3、制备碳青霉烯酶oxa-48本发明通过ncbi序列比对，获得碳青霉烯酶oxa-48（oxa-48-162~163、oxa-48-181、oxa-48-204、oxa-48-232、oxa-48-247、oxa-48-244~245）的保守序列，其氨基酸序列如seqidno.7-9所示。通过原核基因表达得到高纯度蛋白，基因表达过程如下：（1）引物设计根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增目标基因，上下游分别含有ecori和xhoi酶切位点。引物序列如下：oxa-48-n端保守区域上游引物：5'ttgaattcccagcggtagcaaa3'(ecori)oxa-48-n端保守区域下游引物：5’tctcgagaaccacgcccaaat3’(xhoi)oxa-48-c端保守区域上游引物：5'ttgaattcattggctggtgggt3'(ecori)oxa-48-c端保守区域下游引物：5’tctcgagtttgtgatggcttg3’(xhoi)oxa-48-保守区域上游引物：5’ttgaattcagcggtagcaaaggaa3’(ecori)oxa-48-保守区域下游引物：5’ttgaattccgcaaaaaaccacaca3’(ecori)（2）基因扩增常规sds碱裂解法破碎待测革兰氏阴性菌细胞壁，采用市售dna提取试剂盒，按照说明操作，获得总dna，并以其为模板扩增目标基因。pcr反应体系：extaq10*buffer2.5μldntpmixture2.5μl上游引物1.0μl下游引物1.0μldna模板1.5μlextaqdna聚合酶0.5μlddh2o16μl总体积25.0μlpcr运行条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸5min。
32.（3）采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pet-28a（+）-pm，采用cacl2热激法将从组载体转化到大肠杆菌dh5a感受态中。利用含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行pcr鉴定，确定目标基因存在。
33.（4）表达及纯化将提取的表达质粒pet-28a（+）-pmaa转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞后，在
选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/ml氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1ml过夜培养物接种到200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，震荡培养至对数期（od600在0.5-0.6），加入iptg（1mmol/l）,16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，纯化产物经sds-page检测，片段大小合适，为目标蛋白，sds-page电泳图如图1所示（图中m1为marker，泳道3为碳青霉烯酶oxa-48表达蛋白）。
34.4、制备碳青霉烯酶imp本发明通过ncbi序列比对，获得碳青霉烯酶imp（imp-1~35、imp-37~46、imp-48~49、imp-51~56、imp-58~85、imp-88~89）的保守序列，其氨基酸序列如seqidno.10-12所示。通过原核基因表达得到高纯度蛋白，基因表达过程如下：（1）引物设计根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增目标基因，上下游分别含有ecori和xhoi酶切位点。引物序列如下：imp-n端保守区域上游引物：5'ttgaattcagttagaaaagggaag3'(ecori)imp-n端保守区域下游引物：5’tctcgagatgaaaatgagaggaa3’(xhoi)imp-c端保守区域上游引物：5'ttgaattcccgggacacactccag3'(ecori)imp-c端保守区域下游引物：5’tctcgagaccagttttgccttac3’(xhoi)imp-保守区域上游引物：5’ttgaattcggtcgatgtttgatgt3’(ecori)imp-保守区域下游引物：5’ttgaattcggttttgatggttttt3’(ecori)（2）基因扩增常规sds碱裂解法破碎待测革兰氏阴性菌细胞壁，采用市售dna提取试剂盒，按照说明操作，获得总dna，并以其为模板扩增目标基因。pcr反应体系：extaq10*buffer2.5μldntpmixture2.5μl上游引物1.0μl下游引物1.0μldna模板1.5μlextaqdna聚合酶0.5μlddh2o16μl总体积25.0μlpcr运行条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸25s，共30个循环；72℃再延伸5min。
35.（3）采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pet-28a（+）-pm，采用cacl2热激法将从组载体转化到大肠杆菌dh5a感受态中。利用含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行pcr鉴定，确定目标基因存在。
36.（4）表达及纯化将提取的表达质粒pet-28a（+）-pmaa转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/ml氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1ml过夜培养物接种到200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，震荡培养至对数期
（od600在0.5-0.6），加入iptg（1mmol/l）,16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，纯化产物经sds-page检测，片段大小合适，为目标蛋白，sds-page电泳图如图1所示（图中m1为marker，泳道4为碳青霉烯酶imp表达蛋白）。
37.5、制备碳青霉烯酶vim本发明通过ncbi序列比对，获得碳青霉烯酶vim（vim-1~20，vim-23~73）的保守序列，其氨基酸序列如seqidno.13-15所示。通过原核基因表达得到高纯度蛋白，基因表达过程如下：（1）引物设计根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增目标基因，上下游分别含有ecori和xhoi酶切位点。引物序列如下：vim-n端保守区域上游引物：5'ttgaattcgccgatggtgtttggt3'(ecori)vim-n端保守区域下游引物：5’tctcgaggagaatgcgtgggaat3’(xhoi)vim-c端保守区域上游引物：5'ttgaattcaggactctcatcgagc3'(ecori)vim-c端保守区域下游引物：5’tctcgaggacgggacgtatacaa3’(xhoi)vim-保守区域上游引物：5’ttgaattcagccgagtggtgagta3’(ecori)vim-保守区域下游引物：5’ttgaattcgagcgatttttgtgtg3’(ecori)（2）基因扩增常规sds碱裂解法破碎待测革兰氏阴性菌细胞壁，采用市售dna提取试剂盒，按照说明操作，获得总dna，并以其为模板扩增目标基因。pcr反应体系：extaq10*buffer2.5μldntpmixture2.5μl上游引物1.0μl下游引物1.0μldna模板1.5μlextaqdna聚合酶0.5μlddh2o16μl总体积25.0μlpcr运行条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸22s，共30个循环；72℃再延伸5min。
38.（3）采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pet-28a（+）-pm，采用cacl2热激法将从组载体转化到大肠杆菌dh5a感受态中。利用含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行pcr鉴定，确定目标基因存在。
39.（4）表达及纯化将提取的表达质粒pet-28a（+）-pmaa转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/ml氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1ml过夜培养物接种到200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，震荡培养至对数期（od600在0.5-0.6），加入iptg（1mmol/l）,16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，纯化产物经sds-page检测，片段大小合适，为目标蛋白，sds-page电泳图如图1所示（图中m1为
marker，泳道5为碳青霉烯酶vim表达蛋白）。
40.实施例2 制备碳青霉烯酶单克隆抗体1、制备碳青霉烯酶kpc单克隆抗体本实施例应用碳青霉烯酶kpc的保守区产物免疫小鼠，免疫剂量为50 ug/只，2周免疫一次，共免疫5次，首次免疫使用完全佐剂比例为1:1，后续免疫使用不完全佐剂比例为1:1，获得可配对单克隆抗体，具体操作过程为：使用抗原免疫小鼠，对选定小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，采用elisa法，空白酶标板包被抗原100 ng/well，加入100 ul杂交瘤细胞上清到酶标板中，37℃孵育1 h，1x洗液洗涤1次拍干后加入100 ul羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育30 min，1x洗液洗涤3次拍干后加入100 ul tmb显色底物，37℃孵育25min，每孔加入50 ul终止液，450nm处读取od值，筛选od》0.5能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，对克隆产生的抗体进行抗体配对验证，得到所需的捕获抗体和检测抗体，sds-page电泳图如图2所示（图中m为 marker，泳道1为碳青霉烯酶kpc单克隆抗体）。
41.2、制备碳青霉烯酶ndm单克隆抗体本实施例应用碳青霉烯酶ndm的保守区产物免疫小鼠，免疫剂量为50 ug/只，2周免疫一次，共免疫5次，首次免疫使用完全佐剂比例为1:1，后续免疫使用不完全佐剂比例为1:1，获得可配对单克隆抗体，具体操作过程为：使用抗原免疫小鼠，对选定小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，采用elisa法，空白酶标板包被抗原100 ng/well，加入100 ul杂交瘤细胞上清到酶标板中，37℃孵育1 h，1x洗液洗涤1次拍干后加入100 ul羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育30 min，1x洗液洗涤3次拍干后加入100 ul tmb显色底物，37℃孵育25min，每孔加入50 ul终止液，450nm处读取od值，筛选od》0.5能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，对克隆产生的抗体进行抗体配对验证，得到所需的捕获抗体和检测抗体，sds-page电泳图如图2所示（图中m为 marker，泳道2为碳青霉烯酶ndm单克隆抗体）。
42.3、制备碳青霉烯酶oxa-48单克隆抗体本实施例应用碳青霉烯酶oxa-48的保守区产物免疫小鼠，免疫剂量为50 ug/只，2周免疫一次，共免疫5次，首次免疫使用完全佐剂比例为1:1，后续免疫使用不完全佐剂比例为1:1，获得可配对单克隆抗体，具体操作过程为：使用抗原免疫小鼠，对选定小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，采用elisa法，空白酶标板包被抗原100 ng/well，加入100 ul杂交瘤细胞上清到酶标板中，37℃孵育1 h，1x洗液洗涤1次拍干后加入100 ul羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育30 min，1x洗液洗涤3次拍干后加入100 ul tmb显色底物，37℃孵育25min，每孔加入50 ul终止液，450nm处读取od值，筛选od》0.5能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，对克隆产生的抗体进行抗体配对验证，得到所需的捕获抗体和检测抗体，sds-page电泳图如图2所示（图中m为 marker，泳道3为碳青霉烯酶oxa-48单克隆抗体 ）。
43.4、制备碳青霉烯酶imp单克隆抗体本实施例应用碳青霉烯酶imp的保守区产物免疫小鼠，免疫剂量为50 ug/只，2周免疫一次，共免疫5次，首次免疫使用完全佐剂比例为1:1，后续免疫使用不完全佐剂比例为1:1，获得可配对单克隆抗体，具体操作过程为：使用抗原免疫小鼠，对选定小鼠的淋巴细胞
与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，采用elisa法，空白酶标板包被抗原100ng/well，加入100ul杂交瘤细胞上清到酶标板中，37℃孵育1h，1x洗液洗涤1次拍干后加入100ul羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育30min，1x洗液洗涤3次拍干后加入100ultmb显色底物，37℃孵育25min，每孔加入50ul终止液，450nm处读取od值，筛选od》0.5能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，对克隆产生的抗体进行抗体配对验证，得到所需的捕获抗体和检测抗体，sds-page电泳图如图2所示（图中m为marker，泳道4为碳青霉烯酶imp单克隆抗体）。
44.5、制备碳青霉烯酶vim单克隆抗体本实施例应用碳青霉烯酶vim的保守区产物免疫小鼠，免疫剂量为50ug/只，2周免疫一次，共免疫5次，首次免疫使用完全佐剂比例为1:1，后续免疫使用不完全佐剂比例为1:1，获得可配对单克隆抗体，具体操作过程为：使用抗原免疫小鼠，对选定小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，采用elisa法，空白酶标板包被抗原100ng/well，加入100ul杂交瘤细胞上清到酶标板中，37℃孵育1h，1x洗液洗涤1次拍干后加入100ul羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育30min，1x洗液洗涤3次拍干后加入100ultmb显色底物，37℃孵育25min，每孔加入50ul终止液，450nm处读取od值，筛选od》0.5能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，对克隆产生的抗体进行抗体配对验证，得到所需的捕获抗体和检测抗体，sds-page电泳图如图2所示（图中m为marker，泳道5为碳青霉烯酶vim单克隆抗体）。
45.实施例3建立碳青霉烯酶kpc检测试剂该碳青霉烯酶检测试剂包括胶体金检测卡和革兰氏阴性细菌裂解液；其中，胶体金检测卡的制备过程为：包被t1线oxa-48包被抗体，根据包被t1线oxa-48抗体蛋白浓度进行配制（蛋白浓度配制成1.0mg/ml），以6mg/mloxa-48抗体为例，量取5.00ml包被液，向其中加入1.00mloxa-48抗体后充分混匀，并做好标记和相应的记录。采用同样的方法建立碳青霉烯酶ndm、kpc、imp和vim的包被抗体。用移液器分别吸取oxa-48和kpc二种抗体的胶体金复合物至同一离心管，每种2ml共计4ml。再用移液器吸取3ml复溶液分别冲洗每种抗体胶体金复合物的原容器，冲洗2遍，冲洗后的6ml复溶液与4ml抗体胶体金复合物混匀，共计10ml。用移液器分别吸取imp、ndm和vim3种抗体的胶体金复合物至同一离心管，每种2ml共计6ml。再用移液器吸取2ml复溶液分别冲洗每种抗体胶体金复合物的原容器，冲洗2遍，冲洗后的4ml复溶液与6ml抗体胶体金复合物混匀，共计10ml。包被c线羊抗鼠igg抗体配制，根据包被c线羊抗鼠igg抗体蛋白浓度进行配制（蛋白浓度配制成1mg/ml），以10mg/ml为例，量取4.50ml包被液，向其中加入0.50ml羊抗鼠igg抗体后充分混匀，得到包被后的硝酸纤维素膜，浸泡在封闭液中，37oc抽风烘干2h。量取100ml胶体金，加入烧杯中，置于磁力搅拌器上。在搅拌的条件下加入200μl0.2mk2co3溶液混匀。之后在搅拌的条件下加入oxa-48抗体至终浓度为12μg/ml混匀后置于20~25℃标记2h；向胶体金中加入封闭液2.0ml，搅拌混匀后室温静置封闭40min。取出胶体金溶液放入离心管中，10000g，4℃离心15min，将沉淀收集起来，后续一起复溶后使用。接着让上清液在置10000g，4℃条件下继续离心15分钟至上清液澄清。尽可能吸干净上清后，留下沉淀。向沉淀中加入2.00ml复溶液，使之充分溶解，得到胶体金标记抗体。将胶体金标记抗体喷在结合垫上，37oc抽风烘干5h，得到喷金后的结合垫。将聚氯乙烯底板、样品垫、喷金后的结
合垫、处理好的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到胶体金免疫层析快速检测试纸卡。
46.革兰氏阴性细菌裂解液具体检测过程为：取少量菌体（1~10μl）加入200μl革兰氏阴性细菌裂解液（0.2%月桂酰肌胺酸钠+0.01%chaps），混匀，静置5~10min。取80μl裂解产物滴加在胶体金检测卡的样品孔内，等待15min，观察t线和c线是否出线。
47.采用同样的方法建立碳青霉烯酶ndm、oxa-48、imp和vim的检测试剂。
48.试验例11、最低检测限及hook效应检测用成品试剂卡检测添加梯度浓度的kpc、ndm、oxa-48、vim和imp样品，并重复三次，来测试最低检测限及hook效应，检测结果见表1，结果显示：kpc、ndm、oxa-48、vim和imp添加浓度在100 ng/ml时均未出现hook效应，最低检测限约在0.1~1 ng/ml范围内。
49.表1 成品试剂卡最低检测限及hook效应检测结果
二、重复性检测用成品试剂卡分别检测kpc、ndm、oxa-48、vim和imp的阴性样品（hrp藕联物稳定剂/稀释剂i）、弱阳性样品（用同一份hrp藕联物稳定剂/稀释剂i分别溶解kpc抗原、ndm抗原、oxa-48抗原、imp抗原、vim抗原至终浓度为5 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、20 ng/ml，旋涡混匀，制成低值阳性样品）、中阳性样品（用同一份hrp藕联物稳定剂/稀释剂i分别溶解kpc抗原、ndm抗原、oxa-48抗原、imp抗原、vim抗原至终浓度为将100 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、400 ng/ml，旋涡混匀，制成中值阳性样品），来测试重复性。检测结果见表2-1至表2-5，结果显示：重复10次均未出现异常结果。
50.表2-1 kpc成品试剂卡重复性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品重复1-+++重复2-+++重复3-+++重复4-+++重复5-+++重复6-+++重复7-+++重复8-+++重复9-+++重复10-+++表2-2 oxa-48成品试剂卡重复性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品重复1-+++重复2-+++重复3-+++重复4-+++重复5-+++重复6-+++重复7-+++重复8-+++重复9-+++重复10-+++表2-3 ndm成品试剂卡重复性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品重复1-+++重复2-+++重复3-+++重复4-+++重复5-+++
重复6-+++重复7-+++重复8-+++重复9-+++重复10-+++表2-4 vim成品试剂卡重复性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品重复1-+++重复2-+++重复3-+++重复4-+++重复5-+++重复6-+++重复7-+++重复8-+++重复9-+++重复10-+++表2-5 imp成品试剂卡重复性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品重复1-+++重复2-+++重复3-+++重复4-+++重复5-+++重复6-+++重复7-+++重复8-+++重复9-+++重复10-+++三、实时稳定性检测用成品试剂卡分别于生产后0、1、2、3、4、6、8、10、12、14个月检测kpc、ndm、oxa-48、vim和imp的阴性样品、低值阳性样品、中值阳性样品，来评估实时稳定性。检测结果见表3-1至表3-5，结果显示：12个月内检测结果一致。
51.表3-1 kpc成品试剂卡实时稳定性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品生产后第0月-+++生产后第1月-+++生产后第2月-+++生产后第3月-+++
生产后第4月-+++生产后第6月-+++生产后第8月-+++生产后第10月-+++生产后第12月-+++生产后第14月-+++表3-2 oxa-48成品试剂卡实时稳定性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品生产后第0月-+++生产后第1月-+++生产后第2月-+++生产后第3月-+++生产后第4月-+++生产后第6月-+++生产后第8月-+++生产后第10月-+++生产后第12月-+++生产后第14月-+++表3-3 ndm成品试剂卡实时稳定性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品生产后第0月-+++生产后第1月-+++生产后第2月-+++生产后第3月-+++生产后第4月-+++生产后第6月-+++生产后第8月-+++生产后第10月-+++生产后第12月-+++生产后第14月
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＋/-++表3-4 vim成品试剂卡实时稳定性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品生产后第0月-+++生产后第1月-+++生产后第2月-+++生产后第3月-+++生产后第4月-+++生产后第6月-+++生产后第8月-+++
生产后第10月-+++生产后第12月-+++生产后第14月
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＋/-++表3-5 imp成品试剂卡实时稳定性检测结果样品阴性样品弱阳性样品中阳性样品生产后第0月-+++生产后第1月-+++生产后第2月-+++生产后第3月-+++生产后第4月-+++生产后第6月-+++生产后第8月-+++生产后第10月-+++生产后第12月-+++生产后第14月-+++试验例2按照下表配置裂解液，以测试单组分和混合组分的裂解液对于革兰氏阴性菌（以产kpc型碳青霉烯酶的大肠杆菌为例）的裂解效果。
52.表4 裂解液的组分和浓度分组试验方法包括如下步骤：1、洗菌：1ml菌液8000 g离心5min后使用1ml 纯水洗涤2次，最后1ml纯水复溶；2、分菌：编号1-7个ep管，每管加入100ul 上述菌液，离心，去上清；3、裂解：每管分别加入对应的200ul按照表4的配置的裂解液，混匀，静置处理1h；4、染色：取上述裂解液产物90ul，加入10ul台盼蓝染液,混匀，显微镜观察。结果见图3。
53.由图3可以看出，试验组1单格40x视野内观察比对照组菌数量显著减少，多视野观察均匀；试验组2单格40x视野内观察与对照组菌数量显著减少，多视野观察均匀；试验组3单格40x视野内观察与对照组菌数量显著减少，多视野观察均匀；试验组4单格40x视野内观察与对照组菌数量显著减少，多视野观察均匀；试验组5单格40x视野内观察与对照组菌数量显著减少，多视野观察均匀；试验组6单格40x视野内观察比对照组菌数量显著减少，多视野观察均匀；对照组单格40x视野内菌数量较多，多视野观察均匀。说明各组对革兰氏阴性
菌株均有裂解效果。
54.将0.1%sds、0.02%chaps和0.2%月桂酰基氨酸钠作为实验组和纯水作为对照组，按照上述方法分别裂解革兰氏阳性细菌（以双歧杆菌为例）。由图4可以看出，实验组与对照组相比，菌数量未发生显著变化，说明该裂解液对革兰氏阳性细菌效果不显著。
55.用胶体金试剂卡检测单组份和混合组分裂解后的检测效果，检测结果见下表，结果显示0.1%sds、0.02%chaps和0.2%月桂酰基氨酸钠混合使用对待测物的检测效果最好，说明0.1%sds、0.02%chaps和0.2%月桂酰基氨酸钠混合使用不仅可以有效裂解革兰氏阴性菌株释放出待测物质（kpc型碳青霉烯酶），而且不影响胶体金试剂卡检测（1%tritonx-100和10mmnaoh虽然可以裂解革兰氏阴性菌，但对胶体金检测体系产生影响）。
56.表5检测结果综上所述，上述试验组1-6以及对照组对于革兰氏阴性菌（以产kpc型碳青霉烯酶的大肠杆菌为例）的结论见表5。
57.表6试验结论以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

技术特征：
1.一种碳青霉烯酶保守抗原，其特征在于：所述保守抗原包含具有如seq id no：1～15中的任意一条或几条所示的氨基酸序列。2.一种碳青霉烯酶的广谱特异性抗体，其特征在于：所述广谱特异性抗体为由权利要求1所述的保守抗原制备得到的单克隆抗体或多克隆抗体。3.一种碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括革兰氏阴性细菌裂解液以及权利要求1所述的保守抗原或权利要求2所述的广谱特异性抗体。4.根据权利要求3所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液的有效成分为：月桂酰肌胺酸钠、chaps、sds中的一种或几种的混合物。5.根据权利要求4所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液中月桂酰肌胺酸钠的质量百分比为0.1%~1%。6.根据权利要求4所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液中chaps 的质量百分比为0.01%~0.1%。7.根据权利要求4所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液中sds的质量百分比为0.1%~1%。8.根据权利要求4所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液包含质量百分比为0.2%的月桂酰基氨酸钠、0.02%的 chaps和0.1%的 sds。9.一种碳青霉烯酶检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求3-8任一所述的碳青霉烯酶检测试剂。10.根据权利要求9所述的碳青霉烯酶检测试剂盒，其特征在于：所述碳青霉烯酶检测试剂盒为胶体金检测试剂盒，所述试剂盒中的抗体标记物为胶体金。

技术总结
本发明创造提供了一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用，所述保守抗原包含具有如SEQ ID NO：1～15中的任意一条或几条所示的氨基酸序列。本发明使用的抗原为碳青霉烯酶保守抗原，在常见亚型中均存在的氨基酸片段，用其免疫动物获得的单克隆抗体或多克隆抗体对常见亚型均有识别，出现假阴性的概率极低。出现假阴性的概率极低。出现假阴性的概率极低。


技术研发人员：张舟 严俊 果馨儒 杨光 付成华 盛长忠 粟艳 周泽奇
受保护的技术使用者：丹娜（天津）生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.02.10
技术公布日：2022/3/8