I群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用与流程

i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程疫苗技术领域，特别涉及一种i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用。


背景技术：

2.禽腺病毒（fowl adenovirus，fadv）属于禽腺病毒科禽腺病毒属，禽腺病毒分3个群，i群、ⅱ群和ⅲ群。i群禽腺病毒共12个血清型，临床上主要引起包涵体肝炎、心包积液和肌胃糜烂等。ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒（hemorrhagic enteritis virus，hev）、大理石脾病毒（marble spleen disease virus，msdv）和鸡大脾病毒（avian adenovirus group ii splenomegaly，aasv）。ⅲ群禽腺病毒主要是禽减蛋综合征病毒（egg drop syn-drom virus，edsv）。fadv-4型主要引起心包积水肝炎综合征，给国内养鸡业带来严重的经济损失。
3.禽腺病毒是一种无囊膜的直径粒子为70-90nm的球形颗粒，二十面体对称结构。fadv的主要结构蛋白有：五邻体（penton）、六邻体（hexon）和纤维突起（fiber）。其中二十面体的12个顶角颗粒为五邻体，240个非顶角颗粒为六邻体以及位于五邻体上的纤维突起，fadv-4具有2条纤维蛋白。
4.亚单位疫苗作为一种新型基因工程疫苗，在疾病防控中具有简便、低廉和高效等特点。针对fadv-4的亚单位疫苗研发中，fiber-2基因由于具有良好的免疫原性，作为疫苗开发的重点。但是fiber-2蛋白由于自身蛋白结构原因，表达后多为包涵体表达，而通过非编码基因调控表达获得针对fiber-2基因的可溶性表达蛋白，对于疫苗的商品化开发和疾病的防控具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、安全有效的i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：一种i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原，其特征在于：所述蛋白抗原对应的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.实现fiber-2蛋白泉城表达的氨基酸序列为seq id no.2。
8.采用上述i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原制备制备基因工程亚单位疫苗的方法，包括如下步骤：（1）扩增序列fiber-2蛋白编码基因seq id no.1；（2）将扩增后基因克隆到表达载体pet-28a获得重组质粒；（3）将重组质粒转化至表达感受态细胞bl21(de3)中，获得重组工程菌；（4）用iptg诱导重组工程菌进行表达、纯化、脱毒后获得fiber-2蛋白，进一步的，
该禽腺病毒fiber-2蛋白含量agp效价≥1:8；（5）将fiber-2蛋白用pbs稀释，并加入tween-80，制成水相，使用白油、span-80、硬脂酸铝混合制成油相，将水相、油相混合乳化，得到亚单位疫苗。
9.本发明在禽腺病毒fadv-4的fiber-2基因前面添加非编码基因，并将其克隆到原核表达载体pet-28a，转化至大肠杆菌构建工程菌，诱导工程菌表达获得可溶性fiber-2蛋白。其中禽腺病毒fiber-2抗原蛋白的氨基酸序列为seq id no.2 ，其编码的基因的核苷酸序列为seq id no.1，并且通过非编码基因调控获得高表达量的可溶性蛋白。
10.本发明的更优技术方案为：步骤（1）中，设计并合成引物序列：fiber2-f：5
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cccgaattcacgatcgcagcgatgctcggggaccctataagaagtc-3’，fiber2-r：5
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；以分离的腺病毒核酸作为模板，用fiber2-f和fiber2-r引物扩增fiber-2基因，并将扩增产物克隆到pmd-18t载体上，获得pmd-18t-fiber2。
11.进一步优选的，步骤（2）中，将pmd-18t-fiber2质粒和pet-28a均用ecor1和hindⅲ进行双酶切，之后将酶切体系放置于37℃水浴中1h，进行回收目的片段和载体；酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分别回收pmd-18t-fiber2质粒中1440bp大小的目的片段和pet-28a治理中5900bp大小的片段；将回收的目的片段和质粒按照t4-dna连接没反应进行连接，连接体系在25℃下反应30min，待反应完成后进行转化。
12.更进一步优选的，步骤（3）中，将连接产物转化至e.coli dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒测序分析，序列正确的质粒命名为pet-28a-fiber-2；将pet28a-fiber-2质粒转化至bl21（de3）感受态细胞，挑取单个菌落于50μg/ml卡那霉素的培养基中过夜培养，即为表达质粒菌液。
13.步骤（4）中，将重组工程菌按照1%的体积比接种到含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃和220rpm条件下摇菌至od600在0.6-0.8之间，加入0.5mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，于28℃条件下振荡诱导过夜，培养结束后，离心收集菌体；在离心管中加入1.0%的曲拉通x-114，涡旋振荡混匀后，放置冷藏条件下过夜，然后放置37℃水浴，并且离心获得脱毒后上清，如此反复多次脱毒，得到fiber-2蛋白。
14.步骤（5）中，将fiber-2蛋白用pbs稀释至100100μg/ml作为水相，并加入tween-80；使用白油、span-80、硬脂酸铝混合均匀、高压灭菌制成油相；将水相和油相按照1:3的体积比进行混合乳化，得到亚单位疫苗，取10ml亚单位疫苗，3000rpm离心15min，管底无水相析出。
15.采用上述方法制备得到的亚单位疫苗在制备预防禽腺病毒感染药物中的应用。
16.本发明制备可溶性蛋白与常规矿物油佐剂配制亚单位疫苗，利用免疫攻毒法评估疫苗保护效果，疫苗组可以提供100%保护，具有很好的商品化开发前景。
17.本发明通过大肠杆菌表达禽腺病毒的fiber-2蛋白，获得可溶性表达产物，制备亚单位疫苗，安全有效，可以预防禽i群4型腺病毒感染。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明的具体内容进行详细描述，但发明的实施方式不限于此。
19.本发明所涉及的主要生物材料如下：e.coli dh5α competent cells（sangon）；bl21（de3）competent cells（sangon）；axyprep
tm dna gel extraction kit 50-prep（axygen）；easy pure
® viral dna/rna kit（transgen）；质粒小提试剂盒（天根）；ecor i、hind iii内切酶（takara）；sds-page凝胶快速配制试剂盒（beyotime）。
20.实施例1：fiber-2基因的扩增根据ncbi中发表的禽腺病毒fiber-2基因序列，设计并合成引物序列如下：fiber2-f：5
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。
21.采集某养鸡场疑似心包积液综合征病料，经过实验室检测诊断为腺病毒感染，并成功分离出腺病毒。
22.以分离的腺病毒核酸作为模板，用fiber2-f和fiber2-r引物扩增fiber-2基因，并将扩增产物克隆到pmd-18t载体上，获得pmd-18t-fiber2，送上海生工测定序列，fiber-2核苷酸序列为seq id no.1，对应氨基酸序列为seq id no.2。
23.实施例2：表达质粒的构建2.1酶切反应将pmd-18t-fiber2质粒和pet-28a均用ecor i和hind
ꢀⅲ
进行双酶切，50μl双酶切且反应如下：表1将酶切体系及放置37℃水浴中1h，用于回收目的片段和载体。
24.2.2目的片段回收酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒按照说明书，分别回收pmd-18t-fiber2质粒中1440 bp大小左右的目的片段和pet-28a质粒中的5900 bp大小左右的片段。
25.2.3连接反应将回收的目的片段和质粒按照t4 dna连接酶反应进行连接，20μl连接体系如下：
表2连接体系在25℃反应30min，待反应完成后进行转化。
26.2.4转化和鉴定取连接产物10μl，转化至e.coli dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒测序分析，序列正确的质粒命名为pet-28a-fiber-2。
27.将pet28a-fiber-2质粒转化至bl21（de3）感受态细胞，挑取单个菌落于50μg/ml卡那霉素的培养基中过夜培养，即为表达质粒菌液。
28.实施例3：fiber-2蛋白片段诱导表达和鉴定将含有实施例2中制备的pet28a-fiber2的表达菌株，按照1%比例（v/v）接种到含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃和220rpm条件下摇菌至od600在0.6-0.8之间，加入0.5mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（iptg），于28℃条件下振荡诱导过夜，培养结束后，离心收集菌体。菌泥用pbs复溶，破碎，分别在上清和沉淀中加入sds上样缓冲液，煮沸10min，用聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现fiber-2蛋白主要为可溶性表达蛋白。
29.将上一步骤中得到的sds-page胶，经过转膜、封闭、pbst洗涤3次，1:200稀释的一抗（禽腺病毒阳性血清）孵育、pbst洗涤3次、1：5000稀释二抗（hrp标记的抗鸡二抗）孵育、pbst洗涤3次、底物作用和显色等步骤检测目的蛋白的抗原性。结果发现，fiber-2蛋白具有良好的抗原性。
30.实施例4：大肠杆菌表达fiber-2蛋白片段内毒素去除在离心管中加入1.0 %的曲拉通x-114（triton x-114），涡旋振荡混匀后，放置冷藏条件下过夜，然后放置37℃水浴，并且离心获得脱毒后上清，如此反复多次脱毒。测定最终脱毒后蛋白琼扩效价为1:512，内毒素含量为250-2500eu/ml。
31.实施例5：亚单位疫苗制备将实施例4中制备的脱内毒素后的蛋白，用pbs将蛋白稀释至100μg/ml（琼扩效价1:8）作为水相，加入适量的tween-80。
32.油相准备，将marcol 52白油，span-80，硬脂酸铝按照合适比例混匀，高压灭菌后备用。
33.按照水相:油相1:3（v/v）进行乳化获得疫苗，取10ml疫苗，3000rpm离心15min，管底无水相析出。
34.实施例6：疫苗安全性检验用1周龄spf鸡10只，每只颈部皮下注射实施例5中制备的疫苗1.0ml，同时设置空白对照组5只鸡，连续观察14日，是否由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。结果显示，疫苗免疫的所有试验鸡精神、采食及饮水均未见异常，注射部位均无红肿反应。
35.实施例7:疫苗效力检验选择3-5周龄spf鸡20只，随机选择10只，颈部皮下注射实施例5中制备的疫苗0.3ml/只，10只作为对照。于免疫后21d，采血测定抗体琼扩效价，并进行攻毒效检，肌肉攻毒注射攻毒液0.2ml/只，攻毒液为禽腺病毒分离株（含有10
7.0
tcid
50
/0.1ml）。观察14d，统计发病和死亡，并剖检活鸡，观察有无病变。结果，免疫组10/10抗体阳性，对照组10/10抗体阴性；攻毒后，攻毒对照组10/10发病，9/10死亡，免疫组10/10无发病和死亡，剖检无症状。结果表明，该亚单位疫苗具有良好的保护效果，能保护鸡群抵抗fadv-4型强毒攻击。
36.表3备注：发病判定标准，以动物精神沉郁、采食量降低或者剖检可见心包积液或者肝脏发黄易碎中任一项，既判定为发病。
37.在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构思下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原，其特征在于：所述蛋白抗原对应的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原，其特征在于：实现fiber-2蛋白泉城表达的氨基酸序列为seq id no.2。3.采用如权利要求1所述的i群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原制备制备基因工程亚单位疫苗的方法，其特征为，包括如下步骤：（1）扩增序列fiber-2蛋白编码基因seq id no.1；（2）将扩增后基因克隆到表达载体pet-28a获得重组质粒；（3）将重组质粒转化至表达感受态细胞bl21(de3)中，获得重组工程菌；（4）用iptg诱导重组工程菌进行表达、纯化、脱毒后获得fiber-2蛋白；（5）将fiber-2蛋白用pbs稀释，并加入tween-80，制成水相，使用白油、span-80、硬脂酸铝混合制成油相，将水相、油相混合乳化，得到亚单位疫苗。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，设计并合成引物序列：fiber2-f：5
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cccgaattcacgatcgcagcgatgctcggggaccctataagaagtc-3’， fiber2-r：5
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ꢀ‑3’
；以分离的腺病毒核酸作为模板，用fiber2-f和fiber2-r引物扩增fiber-2基因，并将扩增产物克隆到pmd-18t载体上，获得pmd-18t-fiber2。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，将pmd-18t-fiber2质粒和pet-28a均用ecor1和hindⅲ进行双酶切，之后将酶切体系放置于37℃水浴中1h，进行回收目的片段和载体；酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分别回收pmd-18t-fiber2质粒中1440bp大小的目的片段和pet-28a治理中5900bp大小的片段；将回收的目的片段和质粒按照t4-dna连接没反应进行连接，连接体系在25℃下反应30min，待反应完成后进行转化。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，将连接产物转化至e.coli dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒测序分析，序列正确的质粒命名为pet-28a-fiber-2；将pet28a-fiber-2质粒转化至bl21（de3）感受态细胞，挑取单个菌落于50μg/ml卡那霉素的培养基中过夜培养，即为表达质粒菌液。7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，将重组工程菌按照1%的体积比接种到含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃和220rpm条件下摇菌至od600在0.6-0.8之间，加入0.5mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，于28℃条件下振荡诱导过夜，培养结束后，离心收集菌体；在离心管中加入1.0%的曲拉通x-114，涡旋振荡混匀后，放置冷藏条件下过夜，然后放置37℃水浴，并且离心获得脱毒后上清，如此反复多次脱毒，得到fiber-2蛋白。8.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，将fiber-2蛋白用pbs稀释至100100μg/ml作为水相，并加入tween-80；使用白油、span-80、硬脂酸铝混合均匀、高压灭菌制成油相；将水相和油相按照1:3的体积比进行混合乳化，得到亚单位疫苗，取10ml亚单位疫苗，3000rpm离心15min，管底无水相析出。9.采用权利要求3所述方法制备得到的亚单位疫苗在制备预防禽腺病毒感染药物中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程疫苗技术领域，特别公开了一种I群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用。本发明在禽腺病毒FAdV-4的fiber-2基因前面添加非编码基因，并将其克隆到原核表达载体pET-28a，转化至大肠杆菌构建工程菌，诱导工程菌表达获得可溶性fiber-2蛋白。其中禽腺病毒fiber-2抗原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，其编码的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，并且通过非编码基因调控获得高表达量的可溶性蛋白。本发明通过大肠杆菌表达禽腺病毒的fiber-2蛋白，获得可溶性表达产物，制备亚单位疫苗，安全有效，可以预防禽I群4型腺病毒感染。可以预防禽I群4型腺病毒感染。


技术研发人员：朱杰 王楠 杨灵芝 王慧 李香云 王成举
受保护的技术使用者：山东滨州沃华生物工程有限公司
技术研发日：2021.12.08
技术公布日：2022/3/8