一种治疗烧烫伤的中药膜剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种治疗烧烫伤的中药膜剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.烧烫伤是指因沸水(油)、烈火、电、光或化学物质等作用于人体而引起的损伤，它包含皮肤或黏膜损伤，严重者可能伤及皮下组织，如肌肉、骨、关节甚至内脏，是日常生活和工作中发生率最高的皮肤性损伤之一，是一种常见且极其复杂的外伤疾病。随着社会生活方式和空间的不断扩大，受伤人数也逐年上升，特别是儿童、青少年和老年人。据统计，我国每年均有大约2000万人遭受不同程度烧烫伤，其中住院人数占5.0％。热力所致的皮肤组织损伤可因热力的温度和接触时间不同，导致皮肤不同层次或深度的变性坏死。烧烫伤作为临床外科常见的创伤性疾病，大多数烫伤多为ⅱ度以下的中、小面积烫伤，一旦发生将对人的身心带来极大的痛苦和伤害因此，预防烧烫伤的发生尤为重要，而如果烧烫伤不幸发生，烫伤治疗中的创伤愈合修复过程则至关重要，值得引起重视。
3.创面愈合过程属于一个进行自我修复的复杂生物学过程，主要包括三个阶段：炎症期、增殖期(再上皮化与肉芽组织形成期)和组织重塑期。这三个阶段既具有一定的连续性，又相互重叠，涉及多种炎症介质、生长因子、修复细胞和细胞外基质之间的相互作用，在机体的调控下呈现出高度的网络性、完整性和有序性。其中任何一个环节中的某个因素出错或发生紊乱，都将影响创面愈合的进程。在创伤修复的领域研究中，治疗烫伤的根本目的就是，以调控参与创面愈合的相关因子和细胞为切入点，从而有效地促进创面愈合，缩短愈合时间并预防瘢痕增生。
4.目前在治疗烧烫伤方面，西药主要有抗菌药物、银盐等，具有消炎、抗菌和镇痛作用。这些化学药物应用广泛，治疗效果较好，但存在一定的不良反应，如磺胺嘧啶银在治疗浅ⅱ度及以下烧烫伤具有强大的抗菌效果，而长期使用易引起全身并发症(中性粒细胞减少和肾毒性等)，同时存在一些不足之处，如治疗烧烫伤后的消水肿效果不理想以及治疗深度烧伤时促进肌肤组织的再生能力较差。因此，在治疗烧烫伤过程中寻找不良反应更小的药物一直是医学研究的重点。从古至今，中药治疗轻中度烧烫伤的效果获得了广泛认可，中药制剂不仅剂型丰富，还具有无不良反应、药源丰富、配制简单、价格低廉、疗效显著等特点，常用的有美宝湿润烧伤膏、烧伤止痛药膏、紫草烧烫伤喷剂、康复新液、复方桐叶烧伤油等。目前用于烧伤治疗的中药多为复方，存在用量大，物质基础、量效关系及作用机制不明确的问题。而且市场主流产品为软膏剂、搽剂、喷雾剂等剂，给药时会给创面带来物理刺激，在制剂稳定性及患者依从性等方面也存在一定问题。
5.膜剂是以原料药与适宜的辅料经加工制成的膜状制剂。膜剂的制剂处方构成相对简单且给药方便，能够克服软膏剂、搽剂、喷雾剂等治疗烧烫伤临床常用剂型在给药时带给患者的物理刺激，顺应性更好。本发明按照中医临床外治法理论，采用虎杖提取物为治疗药物，以鱼鳞明胶为主要辅料制备成虎杖苷鱼鳞明胶膜用于烧烫伤的治疗。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的以哺乳动物为来源的明胶资源有限，生产成本相对较高，可能导致人畜共患的疾病及现有制剂依从性不好等问题，提供一种治疗烧烫伤的中药膜剂及其制备方法与应用。该中药膜剂采用与人类亲缘关系较远的鱼类鳞片为原料生产的明胶为主要辅料，以虎杖提取物(主要有效成分为虎杖苷，不低于80％)为药物，选择剂型为膜剂，制备成虎杖苷鱼鳞明胶膜用于烧烫伤的治疗。
7.为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种治疗烧烫伤的中药膜剂，该中药膜剂含有鱼鳞明胶、虎杖提取物和甘油。
8.优选地，所述鱼鳞明胶、虎杖提取物和甘油的质量比为(5～20):(0.1～2):(0.1～3)。
9.本发明第二方面提供了一种制备前文所述的中药膜剂的方法，该方法包括以下步骤：
10.(1)采用酶解法提取鱼鳞明胶；
11.(2)向鱼鳞明胶中加水浸泡，然后将吸水溶胀后的鱼鳞明胶在40～80℃的水浴中加热溶解，然后加入甘油，搅拌后得到胶浆；
12.(3)将研磨后过120目筛的虎杖提取物粉末加入所述胶浆中，搅拌后加水混合，真空脱泡后得到含药胶浆；
13.(4)将20～80℃保温条件下，将所述含药胶浆均匀涂布在模板上，冷却凝固后，干燥、脱模，然后分剂量、包装、灭菌。
14.优选地，步骤(1)中采用酶解法提取鱼鳞明胶的方法包括以下步骤：
15.s1、将鱼鳞洗净、晾干后用粉碎；
16.s2、按照固液比为1:12～18(g/ml)的比例向粉碎后的鱼鳞中加入盐酸溶液，搅拌后浸泡，然后抽滤并用超纯水洗涤滤渣至ph值为6.8～7.5；
17.s3、按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例向洗涤后的滤渣中加水，然后加入protease a，于30～40℃下酶解4～8h；
18.s4、将酶解后的样品用100目的滤布过滤，并用超纯水多次浸洗滤渣，每次浸洗的同时搅拌15min以上，然后于85～95℃水浴中加热8～15min灭酶；
19.s5、将灭酶后的样品干燥后，按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例加水，然后于50～60℃、ph值为6.0～7.0的条件下浸提4～8h，冷冻干燥后得到鱼鳞明胶。
20.优选地，在步骤(2)中，鱼鳞明胶与甘油的质量之比为10:(2.8～5)。
21.优选地，步骤(2)加入的鱼鳞明胶与步骤(3)加入的虎杖提取物粉末的质量之比为10:(0.1～2)。
22.优选地，在步骤(3)中，所述含药胶浆中含有5～20质量％的鱼鳞明胶、0.1～2质量％的虎杖提取物和0.1～3质量％的甘油。
23.优选地，在步骤(4)中，所述模板为玻璃板、304不锈钢板或pvc塑料板。
24.优选地，在步骤(4)中，所述干燥采用热风干燥。
25.优选地，在步骤(4)中，所述干燥温度为20～80℃。
26.优选地，在步骤(4)中，干燥至干品含水量为5～15质量％。
27.优选地，在步骤(4)中，所述包装采用铝箔或塑料包装。
28.优选地，在步骤(4)中，所述灭菌方式为辐照灭菌。
29.优选地，在步骤s2中，所述盐酸溶液的浓度为0.2～0.8mol/l。
30.优选地，在步骤s3中，protease a的浓度为0.1～0.2质量％。
31.优选地，在步骤s4中，浸洗滤渣的次数为3～5次。
32.优选地，在步骤s5中，灭酶后的样品进行干燥的温度为30～50℃。
33.本发明第三方面提供了一种前文所述的中药膜剂以及前文所述的方法制备的中药膜剂在制备用于治疗烧烫伤药物中的应用。
34.采用本发明所述的方法所制得的中药膜剂(虎杖苷鱼鳞明胶膜)，能明显促进sd大鼠深ⅱ度烫伤的创面愈合，其作用机制是，促进创面胶原纤维的合成和血管生成、提高烫伤创面巨噬细胞数量和清除氧自由基的能力，通过下调il-6、mcp-1和nf-κb的表达，起到减轻炎症反应，促进烫伤创面愈合的作用。本发明制得的中药膜剂作用确切、刺激性小、无抗原性，能具有广阔的应用前景。
附图说明
35.图1是大鼠烫伤创面及其病理切片图；
36.图2是大鼠深二度烫伤创面愈合情况图；
37.图3是各时间点正常组、模型组、给药组和阳性组大鼠烫伤创面组织的masson染色图(
×
100)；
38.图4是各时间点正常组、模型组、给药组和阳性组创面组织的cd31表达的免疫组化检测图(
×
200)；
39.图5是各时间点正常组、模型组、给药组和阳性组创面组织的cd68表达的免疫组化检测图(
×
200)；
40.图6是各时间点正常组、模型组、给药组和阳性组创面组织的grp78表达的免疫组化检测图(
×
200)；
41.图7是各时间点正常组、模型组、给药组和阳性组创面组织的nf-κb表达的免疫组化检测图(
×
200)。
具体实施方式
42.以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
43.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
44.本发明一方面提供了一种治疗烧烫伤的中药膜剂，该中药膜剂含有鱼鳞明胶、虎杖提取物和甘油。
45.在所述中药膜剂中，所述鱼鳞明胶为辅料，所述虎杖提取物(主要成分为虎杖苷)为药物，所述甘油为增塑剂。
46.在优选实施方式中，所述鱼鳞明胶、虎杖提取物和甘油的质量比为(5～20):(0.1
～2):(0.1～3)，例如可以为5:0.1:0.1、5:0.1:1、5:2:0.1、5:2:1、20:0.1:0.1、20:0.1:1、20:2:0.1、20:2:1、10:0.1:0.1、10:0.1:1、10:2:0.1、10:2:1、10:1:0.5、15:1.5:0.8、10:2:3、10:1:3、10:1.5:3或6:2:3。
47.本发明第二方面提供了一种制备前文所述的中药膜剂的方法，该方法包括以下步骤：
48.(1)采用酶解法提取鱼鳞明胶；
49.(2)向鱼鳞明胶中加水浸泡，然后将吸水溶胀后的鱼鳞明胶在40～80℃的水浴中加热溶解，然后加入甘油，搅拌后得到胶浆；
50.(3)将研磨后过120目筛的虎杖提取物粉末加入所述胶浆中，搅拌后加水混合，真空脱泡后得到含药胶浆；
51.(4)将20～80℃保温条件下，将所述含药胶浆均匀涂布在模板上，冷却凝固后，干燥、脱模，然后分剂量、包装、灭菌。
52.所述鱼鳞明胶的来源不限。在优选实施方式中，本发明采用自制的鱼鳞明胶作为辅料，具体地，步骤(1)中采用酶解法自制鱼鳞明胶的方法包括以下步骤：
53.s1、将鱼鳞洗净、晾干后用粉碎；
54.s2、按照固液比为1:12～18(g/ml)的比例向粉碎后的鱼鳞中加入盐酸溶液，搅拌后浸泡，然后抽滤并用超纯水洗涤滤渣至ph值为6.8～7.5(中性)；
55.s3、按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例向洗涤后的滤渣中加水，然后加入protease a(蛋白酶a)，于30～40℃下酶解4～8h；
56.s4、将酶解后的样品用100目的滤布过滤，并用超纯水多次浸洗滤渣，每次浸洗的同时搅拌15min以上，然后于85～95℃水浴中加热8～15min灭酶；
57.s5、将灭酶后的样品干燥后，按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例加水，然后于50～60℃、ph值为6.0～7.0的条件下浸提4～8h，冷冻干燥后得到鱼鳞明胶。
58.在本发明中，制备鱼鳞磷胶所用的鱼鳞可以为常见的鳞片较大的鱼鳞，优选为草鱼鱼鳞。
59.在本发明中，步骤s2中，按照固液比为1:12～18(g/ml)的比例向粉碎后的鱼鳞中加入盐酸溶液是指每g粉碎后的鱼鳞中加入12～18ml的盐酸溶液。在步骤s3中，按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例向洗涤后的滤渣中加水是指每g的滤渣中加入8～13ml的水。在步骤s5中，将灭酶后的样品干燥后，按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例加水是指每g的干燥样品中加入8～13ml的水。
60.采用本发明发明人所述方法自制的鱼鳞明胶为白色的网状结构，质地疏松。
61.在具体实施方式中，在步骤s2中，所述盐酸溶液的浓度为0.2～0.8mol/l，例如可以为0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、0.6mol/l、0.7mol/l或0.8mol/l。
62.在具体实施方式中，在步骤s3中，protease a(蛋白酶a)的浓度为0.1～0.2质量％，例如可以为0.1质量％、0.11质量％、0.12质量％、0.13质量％、0.14质量％、0.15质量％、0.17质量％、0.18质量％、0.19质量％或0.2质量％。
63.在一种优选实施方式中，在步骤s4中，浸洗滤渣的次数可以为3～5次，例如可以为3次、4次或5次。
64.在另一种实施方式中，在步骤s5中，灭酶后的样品进行干燥的温度可以为30～50
℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃。
65.在制备治疗烧烫伤的中药膜剂的方法中，在具体实施方式中，在步骤(2)中，鱼鳞明胶与甘油的质量之比可以为10:(2.8～5)，例如10:2.8、10:3、10:3.2、10:3.4、10:3.6、10:3.8、10:4、10:4.2、10:4.4、10:4.6、10:4.8或10:5。
66.在具体实施方式中，步骤(2)加入的鱼鳞明胶与步骤(3)加入的虎杖提取物粉末的质量之比为10:(0.1～2)，例如10:0.1、10:0.2、10:0.5、10:0.8、10:1、10:1.2、10:1.5、10:1.8或10:2。
67.在制备治疗烧烫伤的中药膜剂的方法中，为了保证中药膜剂对烫伤创面的愈合效果，需要将含药胶浆中鱼鳞明胶、虎杖提取物、甘油三种组分的含量控制在适当范围内。
68.在具体实施方式中，在步骤(3)中，所述含药胶浆中含有5～20质量％的鱼鳞明胶、0.1～2质量％的虎杖提取物和0.1～3质量％的甘油。
69.在本发明所述方法中，在步骤(4)中，所述模板可以为本领域的常规选择。在具体实施方式中，在步骤(4)中，所述模板为玻璃板、304不锈钢板或pvc塑料板。
70.在具体实施方式中，在步骤(4)中，所述干燥采用热风干燥。在优选实施方式中，在步骤(4)中，所述干燥温度可以为20～80℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
71.在具体实施方式中，在步骤(4)中，干燥至干品含水量为5～15质量％，例如可以为5质量％、6质量％、7质量％、8质量％、9质量％、10质量％、11质量％、12质量％、13质量％、14质量％或15质量％。
72.在本发明所述方法中，在步骤(4)中，所述包装材料可以为本领域的常规选择。在具体实施方式中，在步骤(4)中，所述包装可以采用铝箔或塑料包装。
73.在本发明所述方法中，在步骤(4)中，可以采用本领域常规使用的方式进灭菌。在具体实施方式中，所述灭菌方式可以为辐照灭菌。
74.本发明第三方面提供了一种前文所述的中药膜剂以及前文所述的方法制备的中药膜剂在制备用于治疗烧烫伤药物中的应用。
75.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。但本发明的保护范围并不仅限于此。
76.制备例1采用酶解法制备鱼鳞明胶
77.将草鱼鱼鳞洗净、晾干后用高速多功能粉碎机粉碎成絮状。按照固液比为1:15(g/ml)的比例向碎絮状的鱼鳞中加入0.4mol/l的盐酸溶液，搅拌均匀后浸泡2h。抽滤除去盐酸溶液，并用超纯水冲洗滤渣直到ph值为中性(ph值为7)。按照固液比为1:10(g/ml)的比例向滤渣中加水后，加入protease a，于35℃酶解5h。将酶解后的样品用100目的滤布过滤，并用超纯水将滤渣浸洗3次，每次浸洗操作的同时用电磁搅拌器搅拌15min以上，然后于90℃水浴加热10min灭酶。将样品于37℃干燥后，按照固液比为1:10(g/ml)的比例加水，于55℃、ph为6.5的条件下浸提5h后经冷冻干燥即可得到干燥的鱼鳞明胶。其中，protease a的加入量按照下列公式进行计算：(protease a的质量/干鱼鳞的质量)*100％＝0.15％。
78.按照制备例1所述方法自制的鱼鳞明胶外观为白色的网状结构，质地疏松。
79.制备例2-4用于说明中药膜剂的制备过程。
80.制备例2中药膜剂a1的制备
81.称取鱼鳞明胶10g，加入50ml的纯水浸泡明胶，使其充分溶胀。称取虎杖提取物1g，
研磨后过120目筛，备用。将吸水溶胀后的鱼鳞明胶置于50℃的水浴中加热使其溶解，加入3g甘油，充分搅拌。将虎杖提取物粉末加入至胶浆中，搅拌均匀后加入纯水至100ml，混合均匀，真空脱泡，得到含药胶浆，所述含药胶浆中含有10质量％的鱼鳞明胶、1质量％的虎杖提取物和3质量％的甘油。在40℃保温的条件下，采用涂布器将含药胶浆均匀的涂布在pvc模板上，冷却凝固后，于40℃热风干燥1h后脱模，按照2cm*2cm面积分剂量，包装、灭菌后即得。本品每片含虎杖苷不低于2.5mg。
82.制备例3中药膜剂a2的制备
83.称取鱼鳞明胶10g，加入60ml的纯水浸泡明胶，使其充分溶胀。称取虎杖提取物1.5g，研磨后过120目筛，备用。将吸水溶胀后的鱼鳞明胶置于60℃的水浴中加热使其溶解，加入3g甘油，充分搅拌。将虎杖提取物粉末加入至胶浆中，搅拌均匀后加入纯水至100ml，混合均匀，真空脱泡，得到含药胶浆，所述含药胶浆中含有10质量％的鱼鳞明胶、1.5质量％的虎杖提取物和3质量％的甘油。在50℃保温的条件下，采用涂布器将含药胶浆均匀的涂布在pvc模板上，冷却凝固后，于60℃热风干燥1h后脱模，按照2cm*2cm面积分剂量，包装、灭菌后即得。本品每片含虎杖苷不低于2.5mg。
84.制备例4中药膜剂a3的制备
85.称取鱼鳞明胶10g，加入40ml的纯水浸泡明胶，使其充分溶胀。称取虎杖提取物0.9g，研磨后过120目筛，备用。将吸水溶胀后的鱼鳞明胶置于40℃的水浴中加热使其溶解，加入2.8g甘油，充分搅拌。将虎杖提取物粉末加入至胶浆中，搅拌均匀后加入纯水至100ml，混合均匀，真空脱泡，得到含药胶浆，所述含药胶浆中含有10质量％的鱼鳞明胶、0.9质量％的虎杖提取物和2.8质量％的甘油。在60℃保温的条件下，采用涂布器将含药胶浆均匀的涂布在pvc模板上，冷却凝固后，于50℃热风干燥1h后脱模，按照2cm*2cm面积分剂量，包装、灭菌后即得。本品每片含虎杖苷不低于2.5mg。
86.实验例
87.1、实验动物
88.健康的spf级sd大鼠，雄性，体重230-270g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，生产许可证号：scxk(辽)2020-0001，质量合格证号：21072621100783156。本实验中所用实验动物以及动物实验操作程序符合实验动物管理条例规定。
89.2、实验方法
90.2.1大鼠背部深ⅱ度烫伤模型的制备
91.实验大鼠均分笼喂养，自由饮水，采用标准饲料喂养，喂养环境相对湿度保持50-70％，室温为24
±
2℃，适应喂养7d后开始烫伤实验。实验前12h，对实验大鼠断食不断水。腹腔注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉实验大鼠，待实验大鼠失去知觉后，先用电动剃毛刀剃去实验大鼠背部的毛，以正中脊柱为对称轴在背部剔出6x10cm2的造模区域，再用脱毛剂8％硫化钠溶液将脱脂棉浸湿，在造模区域轻轻擦拭数秒，脱去造模区域的短毛，用蒸馏水浸润的纱布将脱毛剂和短毛洗去，并用吹风机吹干实验大鼠背部的造模区域。直径为2cm的50g砝码预先置于沸水中，用镊子夹住，将其底部置于麻醉大鼠的造模区域，紧贴其背部皮肤持续10s，每只实验大鼠背部的造模区域制造2个烫伤创面，均位于正中脊柱部位。烫伤创面呈现局部皮肤发白、水肿、皮肤弹性降低，通过对预实验大鼠的创面组织进行病理切片，可见表皮全层及真皮深层凝固性坏死，胶原纤维大量变性且分布稀疏，验证为深ⅱ度烫伤。
具体烫伤创面如图1所示。
92.2.2实验分组与给药方式
93.在造模实验前，随机选取20只健康sd大鼠，做为正常组，正常喂养。在深ⅱ度烫伤造模成功的实验大鼠中，选取60只，并且随机分为模型组、给药组、阳性对照组(阳性组)，每组20只造模实验大鼠。在造模烫伤实验完成并随机分组后，模型组的实验大鼠不给予任何处理；给药组采用制备例2制备的中药膜剂a1(含虎杖苷的鱼鳞明胶贴剂)敷于烫伤创面；阳性对照组采用润湿烧伤膏涂抹于烫伤创面(涂层厚度约1mm)，每组均每天上药1次，连续给药21天，并且于造模后24h(1d)、3d、7d、14d及21d对每组实验大鼠随机选取4只进行动物取材。
94.2.3烫伤组织的创面愈合情况和创面愈合率的测定
95.对造模实验大鼠进行分组后，在烫伤后24h(1d)、3d、7d、11d、14d、17d及21d，利用数码相机对实验大鼠的烫伤创面进行拍照记录，并观察各组大鼠烫伤创面愈合情况，分别在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d，每组各取4只，采用描记称重法计算实验大鼠烫伤组织的创面愈合率。以烫伤后24h所描绘的烫伤创面的面积作为初始烫伤面积，用透明硫酸纸对烫伤创面进行描绘，然后将描绘的烫伤创面图形剪下并称重，利用透明纸的重量间接表示烫伤创面面积。创面愈合率＝(1-各时间点烫伤创面图纸重量/初始烫伤创面图纸重量)x100％。
96.2.4 elisa检测大鼠血清中il-6和mcp-1的表达水平
97.分别在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d，五个时间点，每组各取4只大鼠，腹腔注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉大鼠，眼眶取血并置于灭菌ep管中，在4℃条件下静置30min后，再以3000rpm离心10min，取上层大鼠血清，保存于-80℃冰箱备用。采用elisa试剂盒，根据试剂盒说明书的实验操作步骤，检测各时间点取得的大鼠血清中il-6和mcp-1的表达水平。
98.2.5比色法(wst-1法)检测大鼠血清的sod活力
99.大鼠血清制备步骤同上述“2.4项”，采用生化试剂盒，根据试剂盒说明书的实验操作步骤，检测各时间点取得的大鼠血清的sod活力。
100.2.6 masson染色观察胶原纤维(病理组织学检查)
101.分别在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d，五个时间点，每组各取4只大鼠，腹腔注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉大鼠并处死，剪取烫伤创面组织的全层皮肤，置于多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋切片(纵切)，masson染色，在显微镜下观察各组烫伤创面组织的胶原纤维情况。
102.实验具体操作如下：
103.(1)取材：将烫伤创面组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
104.(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。
105.(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
106.(4)切片：将修整好的蜡块，放入-20℃冻台冷却，再将冷却的蜡块置于石蜡切片机
切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
107.(5)masson染色：根据masson染液套装的使用说明书，石蜡切片脱蜡至水后，将切片浸入masson a液中浸泡过夜，自来水洗。再将切片放入masson b液及masson c液等比混合的染液，浸染1min，自来水洗，1％盐酸酒精分化，自来水洗。然后，将切片放入masson d液浸染6min，自来水漂洗。masson e液浸染1min。不水洗，稍沥干直接入masson f液染2-30s。再将切片依次用1％冰醋酸漂洗分化、两缸无水乙醇脱水、第三缸无水乙醇5min、二甲苯5min透明，最后切片置于中性树胶封片。
108.(6)取masson染色后的烫伤创面组织切片，每张切片随机选取4个视野，采用image j图像分析系统计算各个视野区域的胶原容积分数(cvf)，取其平均值得出每张切片对应的胶原容积分数(cvf)。cvf＝胶原纤维面积/视野总面积x100％。
109.2.7免疫组化检测创面组织cd31、cd68、grp78及nf-κb的表达情况
110.利用上述组织的石蜡切片，对各组烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d，五个时间点的烫伤创面组织样品中cd31、cd68、grp78及nf-κb的表达情况进行免疫组化检测分析。其中，一抗分别为兔抗大鼠cd31(1:1000)、cd68(1:3000)、grp78(1:1000)、nf-κb(1:1000)多克隆抗体，hrp标记的二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg(1:3000)。
111.实验具体操作如下：
112.(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ(15min)、二甲苯ⅱ(15min)、二甲苯ⅲ(15min)、无水乙醇ⅰ(5min)、无水乙醇ⅱ(5min)、85％酒精(5min)、75％酒精(5min)，最后用蒸馏水洗。
113.(2)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph值为6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph值为7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
114.(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs(ph值为7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
115.(4)封闭:在组化圈内滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。
116.(5)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用pbs稀释的一抗溶液，平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
117.(6)加二抗：玻片置于pbs(ph值为7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加入稀释好的hrp标记的二抗溶液覆盖组织，室温孵育50min。
118.(7)dab显色：玻片置于pbs(ph值为7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
119.(8)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
120.(9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精、85％酒精、无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ、正丁醇和二甲苯ⅰ中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
121.(10)显微镜镜检，图像采集分析。苏木素染细胞核为蓝色，dab显出的阳性表达为
棕黄色。取免疫组化后的烫伤创面组织切片，每张切片随机选取4个视野，棕黄色颗粒状着色为阳性表达采用image j图像分析系统计算各个视野区域的每个指标的阳性率，取其平均值。阳性率＝阳性面积/视野总面积x100％。其中，由于正常组各指标阳性染色程度小且不明显，不纳入计算分析。
122.2.8统计学方法
123.所有数据采用spss 26.0和graphpad prism 8.0软件包对实验数据进行统计分析，组织病理学评分使用秩和检验进行统计学分析，计量资料以平均数
±
标准差表示，多组平均数间的显著性比较采用独立样本t检验方差分析，p《0.05或p《0.01表示差异有统计学意义。
124.3、实验结果
125.3.1各组大鼠烫伤创面的愈合情况及创面愈合率
126.在各时间点对各组大鼠背部的烫伤创面组织的大体变化进行观察和记录，各组创面的愈合情况见图2，各时间点的创面愈合率见表1。
127.通过肉眼观察，在烫伤后的24h里，模型组、给药组和阳性组的大鼠均呈现精神萎靡，此外各组大鼠背部的烫伤创面苍白、轻度肿胀、略高于正常皮肤，并且环绕红斑样边界线，与周围的正常皮肤边界清楚。烫伤3d后，这三组大鼠的食欲和精神均逐渐恢复，创面颜色及边缘加深，边界线更加明显，并且创面逐渐形成软痂。烫伤7d后，各组烫伤创面的面积均可见明显减小，并且软痂逐渐变为硬痂，创面颜色逐渐加深并伴有瘀血。烫伤11d后至17d，部分创面痂皮边缘先出现翘起，开始出现痂皮脱落，并且给药组和阳性组的创面痂皮脱落数量明显多与模型组。烫伤21d后，除部分模型组大鼠的创面痂皮未脱落，其他大鼠的烫伤创面已脱痂，并且脱落部分露出新鲜的肉芽组织，表面光滑平坦，创面面积明显减小，其颜色也接近于正常皮肤。
128.通过描记称重法对实验大鼠烫伤组织的创面愈合率进行计算和分析，结果(如表1所示)表明，在烫伤第3d、7d、14d和21d后每个时间点的创面愈合率，给药组和阳性组均高于模型组，并且在愈合过程的后期具有显著性差异(p《0.05)，但是给药组与阳性组各时间点的创面愈合率比较无统计学意义(p》0.05)。
129.表1各时间点各组的创面愈合率(％，n＝4)
[0130][0131]
注：与模型组比较，*p《0.05
[0132]
通过对烫伤后24h(1d)、3d、7d、11d、14d、17d及21d的烫伤创面进行观察拍照记录，并测量分析3d、7d、14d及21d时间点的创面愈合率，实验可直观发现，给药组和阳性组的创面愈合情况在大体观察上较模型组好，并且两组的创面愈合率也明显高于模型组，因此实验表明，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够促进烫伤创面愈合，缩短脱痂和创面愈合时间。
[0133]
3.2大鼠血清中il-6和mcp-1的表达情况
[0134]
如表2、3所示，与正常组相比较，经烫伤后的模型大鼠(模型组、给药组和阳性组)血清中il-6和mcp-1浓度均显著升高(p《0.01)；并且在烫伤第1d后，三组大鼠血清中il-6和mcp-1浓度之间无明显差异(p》0.05)，随着伤口愈合时间的推移，il-6和mcp-1浓度均呈现不同程度的下降。其中，在烫伤第24h(1d)、3d、7d、14d及21d后，给药组的大鼠血清中il-6浓度显著低于模型组(p《0.05，p《0.01)；在烫伤第3d、14d和21d后，阳性组的大鼠血清中il-6浓度明显低于模型组(p《0.05，p《0.01)；在烫伤第7d、14d及21d后，给药组和阳性组的大鼠血清中mcp-1浓度均明显低于模型组(p《0.01)，而给药组与阳性组各时间点大鼠血清中il-6和mcp-1浓度比较无统计学意义(p》0.05)。而且，随着伤口愈合时间的推移，给药组和阳性组的大鼠血清中il-6和mcp-1浓度下降程度均大于模型组。
[0135]
表2各组大鼠血清中il-6的浓度(pg/ml，n＝4)
[0136][0137]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0138]
表3各组大鼠血清中mcp-1的浓度(pg/ml，n＝4)
[0139][0140]
注：与模型组比较，**p《0.01
[0141]
炎症反应作为组织损伤或致病因子入侵机体时的基本反应，在创面愈合过程是损伤修复的始动环节。适度的炎症反应是创伤修复所需要的，但是过度的炎症反应是烧烫伤创面早期继续加深和坏死的重要原因之一，会导致修复细胞过度增殖、胶原大量沉积、瘢痕增生过度，组织修复不良等。另外，烫伤后创面还会因炎症反应、毛细血管扩张和通透性增加导致体液渗出，皮肤含水量增加，局部组织水肿，创面缺血、缺氧，加重组织损害，使创面加重。有研究证明，发生严重烫伤后，白细胞介素-1(interleukin-1，il-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，tnf-α)等炎症介质在全身炎症反应中通过以下两个途径发挥主导作用，第一个途径是这些炎症介质与炎症细胞相互作用，进而加重局部炎症反应；第二个途径是它们激活细胞因子级联反应，从而诱发
炎症介质的释放，使机体发生剧烈的全身炎症反应，导致炎症反应失控，最后发展到不可逆转的多器官功能障碍综合征阶段。因此，在烧烫伤早期，可以通过减轻创面的炎症反应来促进创面愈合，减少患者全身反应。
[0142]
白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)作为促炎性细胞因子之一，可诱导其他有害炎症因子的产生，在炎症、免疫以及肿瘤发生发展等病理生理过程中发挥着重要作用[167]。在感染或组织损伤时，机体通过损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,damp)或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,pamp)刺激il-6迅速产生，激活炎症反应，参与宿主的防御应激[168]。其中，pamp的信号可被免疫细胞(如单核细胞和巨噬细胞)的模式识别受体(pattern recognition receptor，prr)识别。这些prr包括有，dna受体、toll样受体(toll-like receptor，tlr)、维甲酸诱导基因-1样受体(retinoic acid inducible gene-1-like receptors,rlr)、核苷酸结合寡聚化结构域受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,nlr)等。prr激活又与核因子κb(nuclear factor kappa-b，nf-κb)在内的一系列信号通路有关，并且可以增强相关炎性细胞因子(如il-1β、il-6、tnf-α等)的mrna转录。damp信号由坏死的细胞以及受损降解的细胞外基质(如线粒体dna、热休克蛋白)产生，然后damp刺激各自的tlr产生前炎症因子，其中就包括il-6。
[0143]
单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,mcp-1)，也称趋化因子配体2(c-c motif ligand 2,ccl2)，是cc趋化因子家族成员之一，也是单核细胞有效的趋化因子。mcp-1可由许多类型的细胞产生，包括单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、小胶质细胞、系膜细胞、星形胶质细胞等，其中单核细胞/巨噬细胞是mcp-1的主要来源。另外有研究发现，中性粒细胞可以被某些物质刺激并产生炎症细胞因子或趋化因子mcp-1，这些炎性细胞因子又可以激活邻近的中性粒细胞来分泌更多的细胞因子或趋化因子。mcp-1是能够调节单核细胞/巨噬细胞、t淋巴细胞等细胞的迁移、渗透和聚集，参与多种炎症的发生发展，是一种重要的促炎细胞因子。mcp-1还能够诱导多种细胞表达趋化因子受体2(cc chemokine receptor 2，ccr2)，当mcp-1与ccr2结合后，单核细胞及其它一些免疫细胞(记忆t淋巴细胞和自然杀伤细胞等)被直接趋化和激活至炎症部位，并促进炎症反应的发展。此外，mcp-1还可以通过激活细胞内的信号转导通路，诱导多种细胞表达粘附分子及tnf-α、il-1、il-6等细胞因子，促进嗜碱粒细胞和肥大细胞释放组胺，调节巨噬细胞的吞噬功能及其促凋亡作用，参与炎症性疾病及新生血管形成和损伤修复。另外，mcp-1能聚集和激活炎症细胞，活化的巨噬细胞分泌促纤维化因子如转化生长因子-β1(tgf-β1)、基质金属蛋白酶(mmps)、血小板源性生长因子(pdgf)等，调节并诱导纤维母细胞分化成为肌成纤维细胞，在间质纤维化过程中起着重要作用。除了趋化单核细胞/巨噬细胞等炎症相关细胞，mcp-1还能影响t细胞的增殖及免疫功能。
[0144]
基于il-6和mcp-1作为炎症反应中两个重要的促炎细胞因子，实验采用elisa试剂盒，检测并分析在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d五个时间点各组大鼠血清中il-6和mcp-1的表达水平。由实验结果得，经烫伤后，大鼠血清中的il-6和mcp-1呈现高表达状态，随着伤口愈合时间的推移，给药组和阳性组的大鼠血清中il-6和mcp-1表达水平下降程度均大于模型组。因此，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够通过下调il-6和mcp-1的表达，在一定程度上减轻炎症反应从而促进创面的愈合。
[0145]
3.3大鼠血清的sod活力情况
[0146]
如表4所示，与正常组相比较，经烫伤后的模型大鼠(模型组、给药组和阳性组)血清的sod活力显著降低(p《0.01)；并且在烫伤第1d后，三组大鼠血清的sod活力之间的差异无统计学意义(p》0.05)，随着伤口愈合时间的推移，sod活力均逐渐上升。其中，在烫伤第3d、7d、14d及21d后，给药组大鼠血清的sod活力明显高于模型组(p《0.05)；在烫伤第3d、14d及21d后，阳性组大鼠血清的sod活力明显高于模型组(p《0.05，p《0.01)，同时给药组与阳性组两者之间的差异无统计学意义(p》0.05)。在烫伤第21d后，模型组、给药组和阳性组大鼠血清的sod活力均未恢复至正常组水平。随着伤口愈合时间的推移，给药组和阳性组的大鼠血清的sod活力上升程度均大于模型组。
[0147]
表4各组大鼠血清的sod活力(u/ml，n＝4)
[0148][0149]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0150]
除炎症反应外，氧化应激也是创面修复的最初时期。烧烫伤会使创面组织处于一个暂时性的缺氧状态，使得机体内氧自由基爆发性产生。自由基的清除与抗氧化物的活性相关，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)是抗氧化酶类的重要成员之一，是机体内唯一以氧自由基为底物的酶，具有高效的催化作用，同时也是抗氧化系统的第一道防线。超氧化物歧化酶(sod)作为机体主要的抗氧化酶之一能清除自由基，提高创面抗氧化能力，保护细胞免受损伤，进而加快创面愈合，因此sod活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力和抗炎反应的强弱。
[0151]
实验通过比色法(wst-1法)对烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d五个时间点各组大鼠血清的sod活力进行检测和分析。实验结果表明，经烫伤后大鼠血清的sod活力显著降低，随着伤口愈合时间的推移，sod活力逐渐上升，虽未能恢复至正常水平，但给药组和阳性组的大鼠血清的sod活力上升程度在愈合的中后期均明显大于模型组。因此，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够促进sod活力的恢复，提高清除氧自由基的能力，进而加快烫伤创面的愈合。
[0152]
3.4 masson染色情况
[0153]
从烫伤创面组织masson染色结果图3可知，胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；通过image j对各时间点各masson染色切片进行计算分析，得其胶原容积分数(cvf)，具体结果见表5。由实验结果可知，各时间点正常组的表皮结构完整，层次清晰，真皮层胶原纤维量多且均匀分布，排列整齐；经烫伤后的模型大鼠(模型组、给药组和阳性组)创面组织的胶原纤维含量明显降低(p《0.01)，胶原纤维大量变性，胶原纤维粗大，分布稀疏。在烫伤第1d后，三组烫伤创面的胶原容积分数(cvf)之间的差异无统计学意义(p》0.05)，随着伤口愈合时间的推移，在烫伤第3d和7d后，模型组、给药组和阳性组创面组织的胶原纤维
沉积逐渐增加，真皮层胶原纤维粗大，排列紊乱。其中，在烫伤第7d后，给药组和阳性组的cvf均明显大于模型组(p《0.05)，两组之间的差异无统计学意义(p》0.05)。在烫伤第14d后，masson染色切片明显可见，给药组和阳性组新生表皮正在形成，胶原纤维沉积，有少量絮状新生胶原产生，并且交错分布，给药组和阳性组的cvf均显著性大于模型组(p《0.01)，但两组之间的差异无统计学意义(p》0.05)。在烫伤第21d后，模型组胶原纤维稍粗大，排列稍紊乱，有新生胶原产生，给药组和阳性组均可见新生表皮再生与正常表皮相似，大量新生胶原分泌，交错分布，排列规律，连接成片。此时，给药组和阳性组的cvf均显著性大于模型组(p《0.01)，两组之间的差异无统计学意义(p》0.05)，且模型组、给药组和阳性组的cvf均明显低于正常组(p《0.01)。因此，随着伤口愈合时间的推移，给药组和阳性组烫伤创面组织胶原容积分数(cvf)逐渐增加，并且与模型组之间的差异存在统计学意义。
[0154]
表5各组masson染色的胶原容积分数
[0155][0156]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0157]
胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞的骨架，在各种动物中都有存在。它是由成纤维细胞分泌，然后经过原胶原蛋白分子，紧接着逐渐演变成胶原原纤维，最后多条胶原原纤维相互之间融合形成胶原纤维，同样在创面愈合过程中也具有重要作用。因为烧伤创面修复过程中所形成的结缔组织的主要成分，就是成纤维细胞及其产生的胶原蛋白，胶原蛋白构成烧伤创面基质，为创面上皮化提供一个支架。烫伤创面的修复一定程度上也就是成纤维细胞增殖并产生大量胶原的过程。
[0158]
皮肤的胶原纤维主要分为ⅰ型和ⅲ型。ⅰ型胶原主要存在于真皮深层且纤维粗大；ⅲ型胶原纤维主要存在于真皮浅层，纤维细小且弹性良好，其合成分泌后容易规则排列。创伤后，ⅲ型胶原首先在在创面中出现，可作为桥梁作用，ⅰ型胶原依靠ⅲ型胶原形成稳固的支架。同时有研究证明，粗大的ⅰ型胶原纤维是创面癒痕组织纤维化的根本物质基础，ⅲ型胶原是影响创面修复、瘢痕轻重的重要因素，ⅲ型胶原表达量越高则胶原纤维越细，且弹性更好，瘢痕纤维化程度越低。因此，胶原作为重要的结构蛋白，它的生成是创面修复、瘢痕形成的决定性因素，一直被公认为是创面修复状况的评价指标。
[0159]
通过masson染色显微镜下可直观分析肉芽组织胶原纤维的沉积情况。实验通过对各时间点各masson染色切片进行观察分析并计算其胶原容积分数(cvf)可得，经烫伤后，可见创面组织的胶原纤维大量变性流失，随着伤口愈合时间的推移，胶原纤维逐渐沉积，伴有新生胶原产生、交错分布，并且给药组和阳性组的创面组织胶原纤维新生和沉积情况优于模型组；同时，给药组和阳性组烫伤创面组织胶原容积分数(cvf)逐渐增加，并且与模型组
之间的差异存在统计学意义。由此证明，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够促进创面胶原纤维的合成，从而缩短创面愈合时间。
[0160]
3.5免疫组化检测结果
[0161]
3.5.1 cd31染色结果
[0162]
由图4和表6可知，正常组创面组织几乎不见cd31的阳性表达，经烫伤后的模型大鼠(模型组、给药组和阳性组)创面组织的cd31明显表达(p《0.01)。在烫伤第1d、3d和7d后，模型组、给药组和阳性组烫伤创面组织的cd31阳性率随时间逐渐上升，在烫伤第14d和21d后，三组的cd31阳性率随时间均呈现下降趋势。在整个愈合过程中，各时间点给药组和阳性组烫伤创面组织的cd31阳性率均明显高于模型组(p《0.05，p《0.01)，而给药组和阳性组数据之间的差异无统计学意义(p》0.05)。因此，随着伤口愈合时间的推移，烫伤创面组织的cd31表达先上升后下降，且给药组和阳性组均能明显提高cd31的表达，同时也能明显抑制cd31表达的下降。
[0163]
表6各组的cd31阳性率(n＝4)
[0164][0165]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0166]
血管的形成在生理及病理状态下均会发生，参与了创面修复愈合、肿瘤及怀孕的发生。其中，血管形成是创面修复的基础，可通过血管为创面输送大量养分并提供营养物质，若血管形成不足，会导致创面延迟愈合。在各种调节因素的精密调控下，创面的新生毛细血管进行形态结构和功能的改变，从而完成创面的修复，许多细胞因子、信号通路及其调控环节均可通过影响血管形成而影响创面愈合的进程。因此，在创面愈合过程中，血管的形成起着十分重要的作用。
[0167]
血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，pecam-1，又称cd31)是分子量为130kda的细胞膜表面单链糖蛋白，属于黏附分子免疫球蛋白超家族成员，它通常位于血小板、血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞和某些类型的t细胞表面，以及内皮细胞间紧密连接处，与血管生成和内皮细胞运动相关。cd31与细胞粘附的作用有关，有研究发现，敲除cd31某些胞内域的表达会导致小鼠成纤维细胞缺乏信息连接；cd31胞内域的磷酸化作用会对细胞连接和细胞迁移的起调控作用。cd31常作为血管生成的标记物，可以作为血管内皮细胞的特异性标志，用于评估新生血管的生成和数量。
[0168]
本实验利用免疫组织化学技术对cd31的表达进行标记，检测分析在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d五个时间点各组大鼠烫伤创面愈合过程中，创面毛细血管的新生情况。实验结果显示，随着伤口愈合时间的推移，烫伤创面组织的cd31表达先上升后下降，且给药组和阳性组均能明显提高cd31的表达，同时也能明显抑制cd31表达的下降。因此，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够增加创面组织中cd31的表达，促进血管生成，改善局部创面供血，加速
创面愈合。
[0169]
3.5.2 cd68染色结果
[0170]
由图5和表7可知，正常组创面组织的cd68表达较低，而经烫伤后的模型大鼠(模型组、给药组和阳性组)创面组织的cd68表达显著(p《0.01)。在烫伤第1d、3d和7d后，模型组、给药组和阳性组烫伤创面组织的cd68阳性率较高，呈现高表达的状态，且给药组和阳性组烫伤创面组织的cd68阳性率均显著高于模型组(p《0.01)；其中在烫伤第3d后，给药组的cd68阳性率明显高于阳性组数据(p《0.05)；在烫伤第14d和21d后，三组的cd68阳性率均随时间逐渐下降，且给药组和阳性组的cd68阳性率下降趋势明显小于模型组(p《0.05，p《0.01)，同样给药组和阳性组数据之间的差异无统计学意义(p》0.05)。因此，随着伤口愈合时间的推移，烫伤创面组织的cd68先高表达随后下降，且给药组和阳性组均能明显提高cd68的表达，同时也能明显抑制cd68表达的下降。
[0171]
表7各组的cd68阳性率(n＝4)
[0172][0173]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01；与阳性组比较，#p《0.05
[0174]
巨噬细胞是参与炎症反应的主要细胞，也是调控创面愈合修复的重要细胞。巨噬细胞通过产生炎症介质和分泌细胞因子参与对创面表皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等细胞的调控，影响它们的迁移、增殖和分化，从而参与创面愈合过程的各个阶段。在正常的皮肤组织中，一般巨噬细胞含量极少，并且处于未活化的状态，当受到烧烫伤刺激时可以被激活。巨噬细胞在创面愈合过程中具有促炎和消炎、清除坏死组织、主动防御、刺激诱导分泌多种生长因子、促进细胞增殖、促进组织修复等功能。因此，巨噬细胞在创面愈合炎症反应期向增殖期顺利过渡的阶段起着关键性作用。cd68是分子量为110kda的细胞膜表面单链糖蛋白，是巨噬细胞膜表面分子，可作为检测巨噬细胞存在的标志。有研究证明，在创伤炎症阶段cd68高表达通过吞噬病原体和分泌多种酶降解细胞外基质减轻炎症反应，在增殖阶段，大量cd68分泌细胞生长因子和趋化因子诱导组织的增生。
[0175]
实验中利用免疫组织化学染色通过cd68胞浆染色来标记巨噬细胞，检测分析在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d五个时间点四组大鼠烫伤创面愈合过程中，巨噬细胞的表达情况。实验结果显示，随着伤口愈合时间的推移，烫伤创面组织的cd68先高表达随后下降，且给药组和阳性组均能明显提高cd68的表达，同时也能明显抑制cd68表达的下降。因此，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够提高烫伤创面巨噬细胞数量，加快创面以巨噬细胞为主导作用的炎症反应期，使其迅速进入修复期，缩短愈合时间。
[0176]
3.5.3 grp78染色结果
[0177]
由图6和表8可得出，正常组创面组织几乎不见grp78的阳性表达，经烫伤后的模型
大鼠(模型组、给药组和阳性组)创面组织的grp78明显表达(p《0.01)，可见大量阳性染色细胞。在烫伤第1d和3d后，模型组、给药组和阳性组烫伤创面组织的grp78阳性率呈现高表达的状态，其中在第3d后，给药组和阳性组烫伤创面组织的grp78阳性率均显著低于模型组(p《0.01)，而给药组和阳性组数据之间的差异无统计学意义(p》0.05)；在烫伤第7d、14d和21d后，三组grp78的阳性表达均随时间呈现下降趋势，且给药组和阳性组的grp78阳性率显著小于模型组(p《0.01)；此外，在烫伤第21d后，给药组烫伤创面组织的grp78阳性率大于阳性组，两者之间的差异具有统计学意义(p《0.05)。因此，创面组织经烫伤后立即呈现grp78高表达，随着伤口愈合时间的推移，grp78的表达逐渐下降，给药组和阳性组均能明显抑制grp78的高表达，同时也能明显促进grp78表达的下降。
[0178]
表8各组的grp78阳性率(n＝4)
[0179][0180]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01；与阳性组比较，#p《0.05
[0181]
内质网(endoplasmic reticulum，er)作为真核细胞中的一种细胞器，具有合成蛋白质、调节蛋白质稳态、控制脂质代谢、储存钙离子、保护细胞等主要功能。在某些生理病理条件下，当出现错误蛋白质或未折叠蛋白质过度堆积、脂质和固醇等水平失调时，会诱导内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ers)，即内质网通过激活多个信号通路来避免错误折叠以及未折叠蛋白的累积，从而来维持真核细胞稳态，起到保护作用，并影响相关基因表达。ers主要以未折叠蛋白反应(upr)为主，upr所具有的三大信号通路，与内质网膜上的三种跨膜蛋白有关，分别为肌醇必需酶-1(inositol requring 1，ire1/ern1)、活性转录因子6(activating transcription factor 6，atf6)和蛋白激酶r样内质网激酶(pek like er kinase，perk/pek)。当内质网处于非应激状态时，ire1、perk、atf6三种跨膜蛋白与内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein of 78kd，grp78)/(heavy chain-binding protein，bip)结合形成二聚体，但此时三种跨膜蛋白不具有活性；当内质网处于应激状态时，grp78/bip就会与三者解离并协助蛋白的折叠，三种跨膜蛋白因此被激活，以此启动upr，即启动内质网应激(ers)。但是，当发生持续性严重的内质网应激(ers)，超过了细胞的未折叠蛋白反应(upr)的处理能力时，细胞会启动凋亡程序，从而发生细胞凋亡。所以，内质网应激通路(ers)是机体内细胞凋亡的重要途径之一。其中，grp78/bip是内质网应激的一个重要蛋白，它作为内质网的伴侣蛋白，具有调节内质网稳态的作用，被公认为内质网应激的标志物之一。
[0182]
有研究证明，烧烫伤可激活内质网应激反应，从而严重影响细胞及机体代谢，所以内质网应激可能作为治疗烧烫伤的重要靶点。本实验利用免疫组织化学技术对grp78的表达进行标记，检测分析在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d五个时间点各组大鼠烫伤创面愈合过程中，创面组织的内质网应激情况。实验结果显示，随着伤口愈合时间的推移，grp78从
持续性高表达至逐渐下降，给药组和阳性组均能明显抑制grp78的高表达，同时也能明显促进grp78表达的下降。因此，虎杖苷鱼鳞明胶贴剂能够抑制grp78的高表达，减轻内质网应激(ers)，抑制细胞凋亡途径，从而促进烫伤创面的愈合。
[0183]
3.5.4 nf-κb染色结果
[0184]
由图7和表9可得出，正常组创面组织的nf-κb表达较低，而经烫伤后的模型大鼠(模型组、给药组和阳性组)创面组织的nf-κb表达显著(p《0.01)，可见许多阳性染色细胞。在烫伤第1d后，模型组、给药组和阳性组烫伤创面组织的nf-κb的表达立即呈现较高水平，且三组nf-κb阳性率之间的差异无统计学意义(p》0.05)；在烫伤第3d、7d、14d和21d后，模型组、给药组和阳性组烫伤创面组织的nf-κb阳性率随着伤口的愈合逐渐下降，且给药组和阳性组烫伤创面组织的nf-κb阳性率均明显低于模型组(p《0.05，p《0.01)，下降程度大于模型组。因此，创面组织经烫伤后立即呈现nf-κb高表达，随着伤口愈合时间的推移，nf-κb的表达逐渐下降，并且给药组和阳性组均能明显促进nf-κb表达的下降。
[0185]
表9各组的nf-κb阳性率(n＝4)
[0186][0187]
注：与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0188]
nf-κb是nf-κb/rel蛋白家族成员之一，目前在哺乳动物中已发现，nf-κb家族主要是由5个亚基两两组成的同质二聚体蛋白和异质二聚体，这5个亚基包括p50(即nf-κb 1，由前体蛋白p105产生)、p52(即nf-κb 2，由前体蛋白p100产生)、rel a(p65)、rel b和rel c-rel。这些蛋白具有与dna结合的特点，其中存在最为广泛的p50-p65异源二聚体发挥主要的生理功能。当机体处于正常状态时，nf-κb二聚体被隔离在细胞溶胶中与iκb蛋白结合，处于未被激活的状态；当机体细胞受到外界或机械信号的刺激时，iκb激酶(iκb kinase，ikk)被激活，引起iκb的磷酸化，随后iκb通过泛素-蛋白酶体系统被降解，从而使nf-κb二聚体活化并可以自由地从细胞质转移到细胞核，与靶基因结合，进而调控数百种免疫调节蛋白、促炎细胞因子、黏附分子、趋化因子和生长因子的表达。因此，nf-κb作为普遍存在的转录因子，对许多基因发挥着中心性转录调节作用，在炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等方面起到重要作用，并且已有许多研究证明烧烫伤的刺激会导致机体中nf-κb的活化，nf-κb作为炎症性信号通路因子，会加剧炎症反应对上皮细胞膜完整性的破坏。
[0189]
实验中利用免疫组织化学染色通过nf-κb胞浆染色来标记巨噬细胞，检测分析在烫伤后24h(1d)、3d、7d、14d及21d五个时间点四组大鼠烫伤创面愈合过程中，巨噬细胞的表达情况。实验结果显示，经烫伤后，烫伤创面的nf-κb立即呈现高表达状态，随着伤口愈合时间的推移，nf-κb的表达逐渐下降，并且给药组和阳性组均能明显促进nf-κb表达的下降。因此，虎杖苷鱼鳞明胶膜能够抑制nf-κb高表达，促进nf-κb表达的下降，从而减轻炎症反应，加快伤口愈合的进程。
[0190]
综上所述，虎杖苷鱼鳞明胶膜能明显促进大鼠深ⅱ度烫伤创面愈合，其作用机制初探为，促进创面胶原纤维的合成和血管生成、提高烫伤创面巨噬细胞数量和清除氧自由基的能力，下调il-6、mcp-1和nf-κb的表达，从而减轻炎症反应，促进烫伤创面愈合。
[0191]
本发明通过动物实验对虎杖苷鱼鳞明胶膜的治疗烫伤作用进行探究，通过对创面愈合率、masson染色切片、il-6、mcp-1、sod、cd31、cd68、grp78及nf-κb指标进行检测并分析其机制研究，为进一步促进其在临床上的推广应用提供充分的理论和实验依据。
[0192]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种治疗烧烫伤的中药膜剂，其特征在于，该中药膜剂含有鱼鳞明胶、虎杖提取物和甘油。2.根据权利要求1所述的中药膜剂，其特征在于，所述鱼鳞明胶、虎杖提取物和甘油的质量比为(5～20):(0.1～2):(0.1～3)。3.一种制备权利要求1或2所述的中药膜剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采用酶解法提取鱼鳞明胶；(2)向鱼鳞明胶中加水浸泡，然后将吸水溶胀后的鱼鳞明胶在40～80℃的水浴中加热溶解，然后加入甘油，搅拌后得到胶浆；(3)将研磨后过120目筛的虎杖提取物粉末加入所述胶浆中，搅拌后加水混合，真空脱泡后得到含药胶浆；(4)将20～80℃保温条件下，将所述含药胶浆均匀涂布在模板上，冷却凝固后，干燥、脱模，然后分剂量、包装、灭菌。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中采用酶解法提取鱼鳞明胶的方法包括以下步骤：s1、将鱼鳞洗净、晾干后用粉碎；s2、按照固液比为1:12～18(g/ml)的比例向粉碎后的鱼鳞中加入盐酸溶液，搅拌后浸泡，然后抽滤并用超纯水洗涤滤渣至ph值为6.8～7.5；s3、按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例向洗涤后的滤渣中加水，然后加入protease a，于30～40℃下酶解4～8h；s4、将酶解后的样品用100目的滤布过滤，并用超纯水多次浸洗滤渣，每次浸洗的同时搅拌15min以上，然后于85～95℃水浴中加热8～15min灭酶；s5、将灭酶后的样品干燥后，按照固液比为1:8～13(g/ml)的比例加水，然后于50～60℃、ph值为6.0～7.0的条件下浸提4～8h，冷冻干燥后得到鱼鳞明胶。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，鱼鳞明胶与甘油的质量之比为10:(2.8～5)；优选地，步骤(2)加入的鱼鳞明胶与步骤(3)加入的虎杖提取物粉末的质量之比为10:(0.1～2)。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述含药胶浆中含有5～20质量％的鱼鳞明胶、0.1～2质量％的虎杖提取物和0.1～3质量％的甘油；优选地，在步骤(4)中，所述模板为玻璃板、304不锈钢板或pvc塑料板。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述干燥采用热风干燥；优选地，在步骤(4)中，所述干燥温度为20～80℃；优选地，在步骤(4)中，干燥至干品含水量为5～15质量％。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述包装采用铝箔或塑料包装；优选地，在步骤(4)中，所述灭菌方式为辐照灭菌。9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述盐酸溶液的浓度为0.2～0.8mol/l；优选地，在步骤s3中，protease a的浓度为0.1～0.2质量％；
优选地，在步骤s4中，浸洗滤渣的次数为3～5次；优选地，在步骤s5中，灭酶后的样品进行干燥的温度为30～50℃。10.权利要求1或2所述的中药膜剂以及权利要求3-9中任意一项所述的方法制备的中药膜剂在制备用于治疗烧烫伤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及中药制剂技术领域，公开了一种治疗烧烫伤的中药膜剂及其制备方法与应用。该方法包括：(1)采用酶解法提取鱼鳞明胶；(2)向鱼鳞明胶中加水浸泡，然后将吸水溶胀后的鱼鳞明胶在40～80℃的水浴中加热溶解，然后加入甘油，搅拌后得到胶浆；(3)将研磨后过120目筛的虎杖提取物粉末加入所述胶浆中，搅拌后加水混合，真空脱泡后得到含药胶浆；(4)将20～80℃保温条件下，将所述含药胶浆均匀涂布在模板上，冷却凝固后，干燥、脱模，然后分剂量、包装、灭菌。该中药膜剂采用鱼类鳞片为原料生产的明胶为主要辅料，以虎杖提取物(主要有效成分为虎杖苷)为药物，选择剂型为膜剂，制备成虎杖苷鱼鳞明胶膜用于烧烫伤的治疗。鳞明胶膜用于烧烫伤的治疗。鳞明胶膜用于烧烫伤的治疗。


技术研发人员：颜春潮 陈运中
受保护的技术使用者：湖北中医药大学
技术研发日：2021.12.01
技术公布日：2022/3/8