一种选择性扩增同种反应性NK细胞的NK细胞体外培养方法与流程

一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)是不同于t、b淋巴细胞的一类大颗粒淋巴细胞，它是天然免疫系统的主要效应细胞，无需抗原预先致敏，表现为速发效应，因此位于机体抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线；同时又能通过分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。nk细胞活性的发挥是依靠其表面表达的各种受体分子与靶细胞相应配体相互作用的结果，其中最重要的是杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor，kir)。
3.kir是属于免疫球蛋白超家族受体，表达于nk细胞表面；kir分为抑制型和活化型两组，每一组均有其特定的细胞外结构域，且均与特定的配体(hla
‑ⅰ
类抗原)结合，分别介导抑制性或活化性反应。其中，kir2dl2/2dl3、2ds2识别hla-cw1、-cw3、-cw7、-cw8、-cw12、-cw13、-cw14、-cw16，这一组hla
‑ⅰ
类抗原的共同特点是第80位氨基酸残基为天门冬氨酸(c1组)；而kir2dl1/2ds1识别hla-cw2、-cw4、-cw5、-cw6、-cw15、cw*-1602、-cw17、-cw18，这一组hla
‑ⅰ
类抗原的共同特点是第80位氨基酸残基为赖氨酸(c2组)。nk细胞通过kir识别自体hla
‑ⅰ
类抗原达到对自身的免疫耐受，当异源细胞不具备被nk细胞表面抑制性kir受体识别的hla
‑ⅰ
类抗原时，即产生同种反应性nk细胞，同种反应性nk细胞活化扩增以杀伤异源细胞。
4.近年来，由于对nk细胞受体识别模式的深入认识，同种反应性nk细胞在异基因造血干细胞移植(allo-hsct)中，尤其是在配型不合的allo-hsct中的作用受到广泛关注。
5.ruggeri等于2002年在science杂志上报道，在急性髓系白血病的骨髓移植研究中，当供者kir与受者mhc-i(mhc即主要组织相容性复合体，人类的mhc被称为hla)受体不相合时，gvhd(移植物抗宿主病)的发生降低，移植后5年无复发生存明显延长。这一重大发现提示供受者kir-配体不相合所引起的同种反应性nk将为从根本上解决骨髓移植中gvhd和gvl(移植物抗白血病效应)的问题带来新的希望。在供、受者之间kir-配体不相容性引发的同种反应性nk细胞活性在理论上将对hsct具有诸多有利影响，nk细胞可能通过杀伤受者树突状细胞等抗原递呈细胞而有效地减少gvhd的发生；通过杀伤宿主t细胞而防止移植排斥，促进移植物植入；同时由于活化nk细胞具有强大的抗肿瘤，因此还能增强gvl效应，避免移植后复发。
6.如公开号为cn109593711a的中国发明专利申请公开了一种制备一可移植的自然杀伤(nk)细胞部分的方法，所述方法包括：(a)获得与一对象为hla单倍体相合或hla错配的一cd3去除的nk细胞部分；(b)在允许细胞增殖的多个条件下，体外培养所述cd3去除的nk细胞部分，其中所述多个条件包括提供用量为1.0毫摩尔至10毫摩尔的多个营养成分、血清、il-15及烟酰胺；(c)在步骤(b)后8至10天用新鲜的多个营养成分、血清、il-15及烟酰胺补
充给所述cd3去除的nk细胞部分，以生产一扩增的cd3去除的nk细胞部分；(d)在步骤(b)后14至16天采集所述扩增的cd3去除的nk细胞部分；及(e)洗涤并浓缩步骤(d)的所述扩增的cd3去除的nk细胞部分；从而生产一可移植的nk细胞部分。
7.但该方法中，“与一对象为hla单倍体相合或hla错配的一cd3去除的nk细胞部分”的获得均依赖于捐赠者的捐赠，一方面捐赠源的寻找较为不便，一方面捐赠源中所需nk细胞的比例一般较低，而一般的纯化或丰富方法效果均较差。


技术实现要素：

8.本发明的发明目的是提供一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，该方法能够快速获得纯度90％以上的同种反应性nk细胞。
9.为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
10.一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，包括将nk细胞置于含饲养细胞的培养液中培养的步骤；
11.所述的饲养细胞为与nk细胞hla-cw位点不合的外周血单个核细胞。
12.本发明采用与nk细胞hla-cw位点不合的外周血单个核细胞作为饲养细胞，则nk细胞中表达不能和饲养细胞表面hla-cw位点结合的kir表型的nk细胞亚群即被活化，产生优势扩增；这部分优先扩增的nk细胞亚群即为同种反应性nk细胞，该同种反应性nk细胞能够优先杀伤与饲养细胞表达相同hla-cw亚组的靶细胞，包括肿瘤细胞以及活化增殖的t细胞，能够发挥移植物抗白血病效应以及抑制移植物抗宿主反应。
13.因此，在器官移植前的配型阶段，选择与受者hla-cw位点不合的供者，并可直接采用受者外周血单个核细胞作为饲养细胞对供者nk细胞进行饲养，即可使可供移植的同种反应性nk细胞优先扩增，不仅用时短，经过2-3周的培养，nk细胞数量能够增殖至初始时的40-70倍，而且同种反应性nk细胞的纯度可达90％以上，对hla-cw位点不合的活化t细胞以及肿瘤细胞也具有更强的细胞毒性。
14.在上述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法中，所述的饲养细胞在加入培养液前预先作去增殖能力处理。饲养细胞的最佳状态是没有增殖能力但保持细胞的存活状态，饲养细胞存活才可刺激与之hla-cw位点不合的同种反应性nk细胞优先扩增，而没有增殖能力的饲养细胞则不会抢夺nk细胞的培养资源，不会影响nk细胞的增殖。
15.作为优选，在上述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法中，采用丝裂霉素处理饲养细胞以使培养细胞失去增殖能力；
16.或者，采用γ射线或co
60
放射灭活饲养细胞以使培养细胞失去增殖能力。
17.其中，采用丝裂霉素处理饲养细胞不需要放射源，实施起来更加方便安全。
18.具体地，采用丝裂霉素处理饲养细胞的方法为：用培养液将所述的饲养细胞的浓度调整至1
×
106～2
×
106cells/ml，并加入终浓度为15-40μg/ml的丝裂霉素处理15-45min，而后用pbs洗涤以去除丝裂霉素。
19.优选地，用培养液将所述的饲养细胞的浓度调整至2
×
106cells/ml，并加入终浓度为25μg/ml的丝裂霉素处理30min，而后用pbs洗涤至少五次以去除丝裂霉素。
20.作为优选，在上述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法中，采用植物血凝素刺激饲养细胞增殖至预设数量后再作去增殖能力处理。即待饲养细胞活化增
殖到一定数量后再作去增殖能力处理，以满足刺激同种反应性nk细胞优先扩增的数量要求和配体需求。
21.本发明研究发现，植物血凝素可以刺激外周血单个核细胞中的淋巴细胞发生活化增殖，被活化的淋巴细胞表面nkg2d的配体mica/micb、ulbp-1和ulbp-4表达上调；dnam-1的配体pvr表达上调，lfa-1的配体icam-1、icam-2的表达都有不同程度的上调；而饲养细胞表面配体的表达上调能够给培养中的nk细胞提供一定的活化信号，有助于促进同种反应性nk细胞的体外扩增。
22.在上述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法中，植物血凝素刺激饲养细胞增殖的方法为：用培养液将所述的饲养细胞的浓度调整至1
×
106～2
×
106cells/ml，并加入终浓度为3-8μg/ml的植物血凝素和100-300u/ml的白细胞介素2，培养72-96h。
23.优选地，用培养液将所述的饲养细胞的浓度调整至2
×
106cells/ml，并加入终浓度为5μg/ml的植物血凝素和200u/ml的白细胞介素2，培养96h。
24.在上述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法中，所述的培养液中，nk细胞与饲养细胞的浓度比为1:(3-7)。适宜的饲养细胞浓度能够为nk细胞的扩增提供更为合适的微环境，包括活化性信号的强弱，nk细胞的活化性受体与相应配体结合的机会等。
25.作为优选，所述的培养液中，nk细胞与饲养细胞的浓度比为1:5。
26.作为优选，本发明的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法包括以下步骤：
27.(1)从供者外周血中富集nk细胞；
28.(2)将nk细胞和饲养细胞分别接种至培养液中，并向培养液中加入终浓度为300-800u/ml的白细胞介素2和终浓度为50-200ng/ml的白细胞介素15，而后置于37℃、5％co2、饱和湿度的条件下培养2-3周。
29.作为优选，在上述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法的步骤(2)中，每隔3-4天换液一次，并更新饲养细胞、白细胞介素2和白细胞介素15。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
31.(1)本发明采用与nk细胞hla-cw位点不合的外周血单个核细胞作为饲养细胞，则nk细胞中表达不能和饲养细胞表面hla-cw位点结合的kir表型的nk细胞亚群即被活化，产生优势扩增，这部分优先扩增的nk细胞亚群即为同种反应性nk细胞；因此，在器官移植前的配型阶段，选择与受者hla-cw位点不合的供者，并可直接采用受者外周血单个核细胞作为饲养细胞对供者nk细胞进行饲养，即可使可供移植的同种反应性nk细胞优先扩增，不仅用时短，经过2-3周的培养，nk细胞数量能够增殖至初始时的40-70倍，而且获得的同种反应性nk细胞的纯度可达90％以上，对hla-cw位点不合的活化t细胞以及肿瘤细胞也具有更强的细胞毒性。
32.(2)本发明中，饲养细胞在加入培养液前预先作去增殖能力处理，饲养细胞的最佳状态是没有增殖能力但保持细胞的存活状态，饲养细胞存活才可刺激与之hla-cw位点不合的同种反应性nk细胞优先扩增，而没有增殖能力的饲养细胞则不会抢夺nk细胞的培养资源，不会影响nk细胞的增殖。
33.(3)本发明中，采用植物血凝素刺激饲养细胞增殖至预设数量后再作去增殖能力处理；本发明研究发现，植物血凝素可以刺激外周血单个核细胞中的淋巴细胞发生活化增殖，被活化的淋巴细胞表面nkg2d的配体mica/micb、ulbp-1和ulbp-4表达上调；dnam-1的配体pvr表达上调，lfa-1的配体icam-1、icam-2的表达都有不同程度的上调；而饲养细胞表面配体的表达上调能够给培养中的nk细胞提供一定的活化信号，有助于促进同种反应性nk细胞的体外扩增。
附图说明
34.图1为采用流式细胞仪前向散射与侧向散射参数对淋巴细胞进行设门用于流式细胞仪分析；
35.其中，fs：：fs lin表示前向散射光；ss：：ss lin表示侧向散射光；fs lin，ss lin subset表示淋巴细胞亚群；
36.图2为rosettesep免疫密度梯度离心法富集前外周血中nk细胞的比例；
37.其中，fitc-cd56表示fitc染色的cd56
+
细胞的荧光强度；pe-cd3表示pe染色的cd3-细胞的荧光强度；位于q3的cd56
+
cd3-细胞即为nk细胞，显示的百分数为nk细胞占所有淋巴细胞群体的百分比；下同；
38.图3为rosettesep免疫密度梯度离心法富集后收集物中nk细胞的比例；
39.图4为不同饲养细胞扩增nk细胞的效率；
40.其中，0w、1w、2w和3w依次表示0周、1周、2周和3周；纵坐标表示nk细胞数量的增长倍数；auto表示采用自体pmbc作为饲养细胞；allo表示采用异基因pmbc作为饲养细胞；k562表示采用k562细胞作为饲养细胞；下同；
41.图5为不同饲养细胞扩增nk细胞后cd3-cd56
+
nk细胞的比例；
42.其中，纵坐标表示培养体系中cd3-cd56
+
nk细胞的百分比；
43.图6为以自体pmbc作为饲养细胞扩增nk细胞对nk细胞上kir分布的影响；
44.其中，fitc-kir2dl2/3表示fitc染色的表达kir2dl2/3的nk细胞亚群，pe-kir2dl1表示pe染色的表达kir2dl1的nk细胞亚群，下同；
45.图7为以异基因pmbc作为饲养细胞扩增nk细胞对nk细胞上kir分布的影响；
46.图8为以k562细胞作为饲养细胞扩增nk细胞对nk细胞上kir分布的影响；
47.图9为进行脱颗粒活性检测时采用前向散射与侧向散射参数对所有细胞进行设门用于流式细胞仪分析；
48.其中，fsc-h表示前向散射光；ssc-h表示侧向散射光；fsc-h,ssc-h subset表示用于脱颗粒分析的细胞群体；
49.图10为以cw位点基因型为c1/c1亚组患者的白血病原代细胞作为靶细胞时同种反应性nk细胞的脱颗粒效应；
50.其中，pe-cd107a表示nk细胞中pe染色的cd107a
+
细胞的荧光强度；apc-cd56表示apc染色的cd56
+
细胞的荧光强度；位于q2的为cd56
+
cd107a
+
细胞，显示的百分比即为具备脱颗粒活性的nk细胞占总nk细胞的百分比，下同；
51.图11为以cw位点基因型为c1/c1亚组患者的pha刺激后的pbmc作为靶细胞时同种反应性nk细胞的脱颗粒效应。
具体实施方式
52.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
53.实施例1
54.本实施例一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，包括以下步骤：
55.(1)从供者外周血中富集nk细胞；
56.采用rosettesep免疫密度梯度离心法从供者外周血中富集nk细胞，分选结果见图1-3；
57.由图1-3可见，分选前，供者外周血中nk细胞的比例仅为10.5％；rosettesep免疫密度梯度离心法富集后，nk细胞的比例达到88.3％；
58.(2)将nk细胞和饲养细胞分别接种至培养液中，并向培养液中加入终浓度为300-800u/ml的白细胞介素2和终浓度为50-200ng/ml的白细胞介素15，而后置于37℃、5％co2、饱和湿度的条件下培养，获得同种反应性nk细胞；
59.具体地，包括：
60.①
分别选取供者自体外周血单个核细胞(自体pmbc)、与供者hla-cw位点不合的异基因外周血单个核细胞(异基因pmbc)、k562细胞作为饲养细胞，先用上述培养液将饲养细胞的浓度调整至2
×
106cell/ml，并加入终浓度为5μg/ml的植物血凝素和200u/ml的白细胞介素2，培养96h，备用(k562细胞不作处理)；
61.本实施例中，nk细胞来自hla-cw位点为c1/c2亚组的29岁健康男性供者，自体pmbc与nk细胞来自同一供者，异基因pmbc来自hla-cw位点为c1/c1亚组的白血病患者缓解期外周血。
62.hla-c位点配型及kir基因型信息如表1所示。
63.表1
[0064][0065]
②
继续用上述培养液将植物血凝素处理后的饲养细胞的浓度调整至2
×
106cell/ml，并加入终浓度为25μg/ml的丝裂霉素c处理30min，而后用pbs洗涤至少五次以去除丝裂霉素c，备用；
[0066]
③
采用含有10％ab血清的scgm培养液，将富集的nk细胞的浓度调整至5
×
105cell/ml，而后接种于6孔细胞培养板中，每孔接种2ml；按照nk细胞与饲养细胞数量比为1:5的比例向各细胞孔中加入丝裂霉素c处理后的饲养细胞，并向各细胞孔中加入终浓度为500u/ml的白细胞介素2和终浓度为100ng/ml的白细胞介素15，而后置于37℃、5％co2、饱和湿度的条件下培养；
[0067]
每隔3.5天换液一次，并更新饲养细胞、白细胞介素2和白细胞介素15；
[0068]
培养过程中动态检测细胞数量的扩增及nk细胞中cd3-cd56
+
细胞的纯度，检测结果见图4和图5。
[0069]
如图4所示，在体外培养nk细胞的第一周内，nk细胞的增长倍数较低，第二周出现显著增长；在培养的第三周，nk细胞数量的增长倍数更是走高，其中，采用自体pmbc作为饲养细胞时，nk细胞数量的增长倍数达到了初始时的70倍，采用k562细胞作为饲养细胞时，nk细胞数量的增长倍数达到了初始时的约65倍，而采用异基因pmbc作为饲养细胞时，nk细胞数量的增长倍数达到了初始时的约55倍。
[0070]
如图5所示，随着培养时间的延长，nk细胞中cd3-cd56
+
细胞的比例逐渐升高，其中，在培养2-3周后，与自体pmbc作为饲养细胞相比，以异基因pmbc作为饲养细胞时扩增的nk细胞中cd3-cd56+细胞的比例更高，达到约95％。
[0071]
由以上试验结果可知，以异基因pbmc作为饲养细胞，在促使nk细胞总体数量的增长没有优势，但能使nk细胞中cd3-cd56+细胞(即具有与饲养细胞hla-cw位点不匹配的kir亚型的nk细胞亚群)优势扩增，使得nk细胞中cd3-cd56
+
细胞的比例逐渐升高；而该nk细胞亚群能够优先杀伤表达与饲养细胞相同cw亚组的靶细胞，包括肿瘤细胞以及活化增殖的t细胞，发挥移植物抗白血病效应以及抑制移植物抗宿主反应。
[0072]
培养完成后，通过流式细胞仪检测kir2dl1、kir2dl2/3、kir3l1亚群分布和nkg2a表达，检测结果见图6、图7和图8；并采用cd107a脱颗粒试验检测同种反应性nk细胞功能，检测结果见图9、图10和图11。
[0073]
由图6、图7和图8可见，由于本实施例中nk细胞来源于hla-cw位点为c1/c2亚组的健康供者，自体pbmc与nk细胞来自同一供者，而异基因pmbc则来源于hla-cw位点为c1/c1亚组的白血病患者缓解期外周血。当采用异基因pmbc作为饲养细胞时，来自饲养细胞表面的c1配体与表达kir2dl2/2dl3受者的nk细胞亚群结合，传递抑制性信号，从而抑制该nk细胞亚群的增殖；而表达kir2dl1/2ds1的nk细胞亚群由于缺少相应的配体与之结合，因此不会产生抑制性信号，从而被优先扩增。
[0074]
对于cw基因型为c1/c1亚组的白血病患者而言，扩增的表达kir2dl1/2ds1的nk细胞亚群即为具有同种反应性的nk细胞亚群，该nk细胞亚群能够杀伤表达肿瘤细胞发挥移植物抗肿瘤效应，防止疾病复发；又可以杀伤活化增殖的t细胞，抑制移植物抗宿主反应。
[0075]
由图9、图10和图11可见，当以hla-cw位点基因型为c1/c1亚组患者的白血病原代细胞或pha刺激后的pbmc作为靶细胞时，经过c1/c1异基因饲养细胞扩增后的nk细胞对c1/c1亚组患者的白血病原代细胞或pha刺激后的pbmc的脱颗粒活性分别为34.1％、26.5％。

技术特征：
1.一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，包括将nk细胞置于含饲养细胞的培养液中培养的步骤；所述的饲养细胞为与nk细胞hla-cw位点不合的外周血单个核细胞。2.如权利要求1所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，所述的饲养细胞在加入培养液前预先作去增殖能力处理。3.如权利要求2所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，采用丝裂霉素处理饲养细胞以使培养细胞失去增殖能力；或者，采用γ射线或co
60
放射灭活饲养细胞以使培养细胞失去增殖能力。4.如权利要求3所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，用培养液将所述的饲养细胞的浓度调整至1
×
106～2
×
106cells/ml，并加入终浓度为15-40μg/ml的丝裂霉素处理15-45min，而后用pbs洗涤以去除丝裂霉素。5.如权利要求2所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，采用植物血凝素刺激饲养细胞增殖至预设数量后再作去增殖能力处理。6.如权利要求5所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，用培养液将所述的饲养细胞的浓度调整至1
×
106～2
×
106cells/ml，并加入终浓度为3-8μg/ml的植物血凝素和100-300u/ml的白细胞介素2，培养72-96h。7.如权利要求1所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，所述的培养液中，nk细胞与饲养细胞的浓度比为1:(3-7)。8.如权利要求7所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，所述的培养液中，nk细胞与饲养细胞的浓度比为1:5。9.如权利要求1-8中任意一项所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从供者外周血中富集nk细胞；(2)将nk细胞和饲养细胞分别接种至培养液中，并向培养液中加入终浓度为300-800u/ml的白细胞介素2和终浓度为50-200ng/ml的白细胞介素15，而后置于37℃、5％co2、饱和湿度的条件下培养2-3周。10.如权利要求9所述的选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法，其特征在于，步骤(2)中，每隔3-4天换液一次，并更新饲养细胞、白细胞介素2和白细胞介素15。

技术总结
本发明公开了一种选择性扩增同种反应性NK细胞的NK细胞体外培养方法，该方法包括将NK细胞置于含饲养细胞的培养液中培养的步骤；所述的饲养细胞为与NK细胞HLA-Cw位点不合的PMBC。本发明采用与NK细胞Cw位点不合的PMBC作为饲养细胞，则NK细胞中表达不能和饲养细胞表面Cw位点结合的KIR表型的NK细胞亚群即被活化，产生优势扩增；因此，在器官移植前的配型阶段，选择与受者Cw位点不合的供者，并采用受者PMBC作为饲养细胞对供者NK细胞进行饲养，即可使同种反应性NK细胞优先扩增，经过2-3周的培养，NK细胞数量能够增殖至初始时的40-70倍，且同种反应性NK细胞的纯度可达90％以上。同种反应性NK细胞的纯度可达90％以上。


技术研发人员：盛立霞 欧阳桂芳 牧启田
受保护的技术使用者：宁波市第一医院
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2022/3/8