一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的引物对及其应用

1.本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的引物对及其应用。


背景技术：

2.胡萝卜(daucus carota l.)属于伞形科胡萝卜属的一类重要的根类蔬菜，其肉质根中富含丰富的类胡萝卜素，具有很高的营养价值，广泛种植于世界各地，是全球性十大蔬菜作物之一。胡萝卜种植面积的迅速增加，不仅对种子的需求量大大增加，而且对种子的质量以及生产效率要求更高。
3.胡萝卜是二年生高度异花授粉作物，花器官又极小，人工去雄困难，难以开展常规人工杂交育种。由于开展常规的人工杂交育种有一定难度，导致胡萝卜的杂种优势利用比较落后。因此，早期育种方法主要采用群体选择和系谱选择法，但这种方法育成的品种一致性和稳定性都比较差，主要原因在于常规品种本身的杂合性和群体内自交造成严重的种性衰退。
4.随着胡萝卜细胞质雄性不育材料的发现，使得胡萝卜一代杂种的选育成为现实。目前胡萝卜细胞质雄性不育类型主要有瓣化型和褐药型两种类型。随着胡萝卜雄性不育遗传机制的深入研究，胡萝卜雄性不育材料广泛应用于实际育种工作中，从而可以保证品种具有较高的一致性和稳定性。20世纪60年代，美国率先投放了第一个胡萝卜一代杂种。目前，欧美国家生产使用的胡萝卜品种多为一代杂种，但不同国家或种子公司使用的雄性不育源不同，如美国主要以瓣化型为主，欧洲多数种子公司使用的是褐药型，亚洲多使用瓣化型。
5.传统常规培育胡萝卜雄性不育系的方法是运用回交转育方法，利用优良可育单株回交，对回交后代进行育性鉴别，重在考查有保持系无恢复基因，育性鉴别方法需在植株开花期，然而由于胡萝卜雄性不育遗传背景复杂，在育种中经常出现几代后，预选的不育系内还出现可育植株。
6.因此，开发胞质基因分子标记对回交材料进行育性鉴定研究，可以在苗期区分胡萝卜育性，提前去除可能掺杂的可育株，可大大节省人力物力及繁种空间，为后续开花后回交提供便利。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明的目的是提供一种利用indel分子标记设计得到的引物对以及采用所述引物对鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育植株的方法和应用，本技术提供的引物对和方法具有简单易行、特异性强、稳定度高的优点。
8.本发明的技术内容如下：
9.第一方面，本发明提供一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育性的引物对，
10.所述引物对的正向引物序列为seq id no.1：
[0011]5’‑
ttgtgcggttaaggttgttgt-3’；
[0012]
所述引物对的反向引物序列为seq id no.2：
[0013]5’‑
cctgttcttgtggatcaatgga-3’。
[0014]
所述引物对由扩增特异性dna片段的上下游两条引物组成，即正向引物和反向引物；所述特异性dna片段中具有能够被正向引物和反向引物组成的引物对扩增的且同时位于胡萝卜参考线粒体基因组中的靶序列，所述参考线粒体基因组的网址如下：
[0015]
http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-51/fasta/daucus_carota/dna/。
[0016]
所述引物对的功能如下：采用引物对对待测胡萝卜样品总dna进行pcr扩增后，当扩增片段大小为264bp时，判定为该胡萝卜品种不育；当扩增片段大小为272bp时，判定为该胡萝卜品种可育。
[0017]
申请人在长期科研实验过程中，利用转录组分析筛选indel分子标记的技术思路，通过对一组稳定的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系的花序提取总rna，进行转录组测序分析，与已公布的胡萝卜参考线粒体基因组进行比对，筛选出数十个在不育系与保持系之间有差异的indel位点，分别设计包含indel位点的上下游引物，并在不同种类的胡萝卜可育株与不育株间进行特异性扩增验证，利用毛细管电泳分离片段，读取分析结果，从而对胡萝卜细胞质雄性不育性进行鉴定。最终，经过重重实验筛选验证，申请人得到了一对特异性引物，其可以完全区分待测品种育性。当扩增片段大小为264bp时，判定为该胡萝卜品种不育；当扩增片段大小为272bp时，判定为该胡萝卜品种可育。利用本发明提供的特异性引物对，能在苗期快速筛选出细胞质雄性不育的胡萝卜品种，准确率高，为选育过程中去除杂株，具有重要的实际应用价值。
[0018]
第二方面，本发明提供一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的方法，包括如下步骤：
[0019]
(1)提取待测胡萝卜样品的总dna；
[0020]
(2)采用第一方面所述的引物对对提取的总dna进行pcr扩增得到产物；
[0021]
(3)将产物进行电泳分离条带，根据条带大小判断胡萝卜品种育性。
[0022]
优选地，所述判断胡萝卜品种育性的标准为：当扩增片段大小为264bp时，判定为该胡萝卜品种不育；当扩增片段大小为272bp时，判定为该胡萝卜品种可育。
[0023]
优选地，所述胡萝卜样品包括叶片和花序。
[0024]
优选地，所述叶片为幼嫩的叶片。
[0025]
优选地，所述电泳方法包括毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0026]
优选地，所述pcr扩增的反应体系为：总体积10μl，包括2
×
taq master mix for page 5μl，10μmol/l的正向引物和反向引物各0.5μl，25ng/μl的dna模板1μl，用无菌水补充至10μl。
[0027]
优选地，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min，1个循环。
[0028]
优选地，所述电泳为毛细管电泳，毛细管电泳步骤：pcr结束后，在每个待测样品孔中分别加入15μl的te，marker孔加入25μl的ladder，再将样品板放置于毛细管电泳仪器中，待电泳结束后，采用分析软件分析结果。
[0029]
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物对在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育性的应用。
[0030]
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物对在制备鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育的试剂和/或试剂盒中的应用。
[0031]
第五方面，本发明提供一种鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育的试剂和/或试剂盒，包含第一方面所述的引物对。
[0032]
具体地，本技术的pcr反应体系：总体积10μl，包括2
×
taq master mix(for page)5μl，上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板(25ng/μl)1μl，用无菌水补充至10μl。
[0033]
具体地，本技术的pcr反应扩增程序：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min，1个循环。
[0034]
具体地，本技术的毛细管电泳：pcr结束后，在样品孔中加入15μl的te，marker孔加入25μl的ladder，再将样品板放置于毛细管电泳仪中，待电泳结束后，采用对应的分析软件prosize 3.0分析结果。实验证明，携带所述264bp片段的胡萝卜样品为不育；携带所述272bp片段的胡萝卜样品为可育。
[0035]
具体地，本技术的方法为：
[0036]
提取待测胡萝卜叶片总dna，使用所述引物对对提取的总dna进行pcr扩增，产物通过毛细管电泳分离片段，通过条带大小，判断待测胡萝卜品种育性；
[0037]
所述引物对的正向引物序列为seq id no.1：
[0038]5’‑
ttgtgcggttaaggttgttgt-3’；
[0039]
所述引物对的反向引物序列为seq id no.2：
[0040]5’‑
cctgttcttgtggatcaatgga-3’。
[0041]
所述的pcr反应体系：总体积10μl，包括2
×
taq master mix(for page)5μl，上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板(25ng/μl)1μl，用无菌水补充至10μl。
[0042]
pcr反应扩增程序：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min，1个循环。
[0043]
毛细管电泳步骤：pcr结束后，在每个待测样品孔中分别加入15μl的te，marker孔加入25μl的ladder，再将样品板放置于毛细管电泳仪器中，待电泳结束后，采用对应的分析软件分析结果。
[0044]
有益效果：
[0045]
本发明主要研究了对胡萝卜瓣化型细胞质不育植株的鉴定问题，解决了回交转育过程中提早除杂的问题，重点是解决筛选合适的分子标记对不同类型胡萝卜瓣化型雄性不育品种的鉴定问题，发明的难点在于用一对分子标记可以完全区分大部分胡萝卜瓣化型雄性不育和可育的品种，本发明的创新点在于利用转录组测序结果比对参考线粒体基因组结果，获得更加准确的瓣化型雄性不育和可育分子标记的筛选，为胡萝卜细胞质雄性不育鉴定提供了可靠的技术手段，有利于加快胡萝卜育种进度。
[0046]
本发明提供了一种利用indel分子标记设计得到的引物对并用于鉴定胡萝卜细胞质雄性不育植株的方法。应用本发明提供的分子标记和引物对能在苗期快速筛选出细胞质雄性不育的胡萝卜品种，该方法具有良好的特异性，稳定性好，准确率高，筛选速度快，为回交转育过程中去除杂株，为加速胡萝卜品系快速育成提供了技术支撑，具有重要的实际应
用价值和广阔的市场前景。
附图说明:
[0047]
图1：九对引物在可育与不育样品之间呈现的多态性电泳图。
[0048]
图2：一对indel分子标记的特异性引物对mt-1鉴定胡萝卜细胞质雄性不育性电泳图；如图标注分别为1：不育系；2：保持系；3：不育系；4：保持系；5：不育系；6：保持系；7：不育系；8：保持系。
[0049]
图3：一对indel分子标记的特异性引物对mt-1鉴定胡萝卜细胞质雄性不育性电泳图；如图标注分别为1：孟德尔3号；2：sk316；3：春奥709；4：诺贝二号；5：玫瑰红；6：腊捻；7：春奥705；8：红宝六寸参。
具体实施方式
[0050]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
[0051]
实施例1
[0052]
通过分别提取一组来源于天津市农业科学院蔬菜研究所选育的红玥品系的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系(hys698和hyd698)的花序rna，建立cdna文库，转录组测序，与胡萝卜参考线粒体基因组比对分析，所述参考线粒体基因组的网址如下：http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-51/fasta/daucus_carota/dna/；筛选出32个在可育与不育之间有碱基数量差异(indel≥4bp)的位置，示意性举例如表1。
[0053]
表1转录组分析筛选的9个差异位置
[0054][0055]
在包含此差异位点基础上，序列上下延长各100bp左右，按顺序依次设计9对引物扩增条带，分别对应差异位置1-9，见表2。
[0056]
表2引物对序列
[0057][0058][0059]
通过我们设计的9个引物对mt-1至mt-9对胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系(hys698和hyd698)进行检测，经过pcr扩增，电泳分离，毛细管电泳验证结果如图1所示。其中，引物对mt-2、mt-3、mt-4、mt-7和mt-8在可育与不育间扩增条带几乎无差异，无法区分育性。引物对mt-5、mt-6和mt-9扩增的片段差异较小，不利于观察和应用。引物对mt-1扩增的条带差异较明显，与参考线粒体基因组比对分析，可育条带与参考线粒体基因组序列一致，大小为272bp，而不育条带呈现大小为264bp。因此，所述特异性引物对mt-1及方法可以根据条带明确区分可育和不育(hys698和hyd698)，进而利用此引物对验证其它育性品种。
[0060]
实施例2
[0061]
(1)样品组1：wma-477和wmb-477来源于日本黑田类型的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系；lssa-128和lssb-128来源于美国切分型的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系；sks35-027和skd35-027来源于具有南特和黑田结合类型的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系；hys698和hyd698来源于天津市农业科学院蔬菜研究所选育
的红玥品系的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系。
[0062]
(2)试剂：2
×
taq master mix(for page)；金唯智合成的特异性扩增引物。
[0063]
正向引物序列为seq id no.1：5
’‑
ttgtgcggttaaggttgttgt-3’[0064]
反向引物序列为seq id no.2：5
’‑
cctgttcttgtggatcaatgga-3’。
[0065]
(3)多态性检测：提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组dna，并以其为模板，采用本发明提供的特异性引物对进行pcr扩增。
[0066]
(4)pcr反应体系：总体积10μl，包括2
×
taq master mix(for page)5μl，上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板(25ng/μl)1μl，用无菌水补充至10μl。
[0067]
(5)pcr反应扩增程序：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min，1个循环。
[0068]
(6)毛细管电泳：pcr结束后，在样品孔中加入15μl的te，h12孔加入25μl的ladder，再将样品板放置于毛细管电泳仪中，待电泳结束后，采用对应的分析软件prosize3.0分析结果。
[0069]
(7)结果判断：如果pcr扩增产物为带型a(显示一条带，为264bp)，则待测胡萝卜为不育系；如果pcr扩增产物为带型b(显示一条带，为272bp)，则待测胡萝卜为保持系。
[0070]
(8)以胡萝卜瓣化型雄性不育系及其保持系为测试样品，对通用型分子标记的引物对扩增dna片段大小进行测试。结果见图2和表3，胡萝卜瓣化型雄性不育系dna片段为264bp；胡萝卜瓣化型雄性不育保持系dna片段为272bp。
[0071]
实验结果表明，本发明筛选的通用型分子标记和特异性引物对在胡萝卜细胞质雄性不育植株鉴定中有良好的应用。应用该indel分子标记和引物对可以准确地区分开不同类型资源的胡萝卜瓣化型雄性不育系及其保持系。
[0072]
表3胡萝卜细胞质雄性不育性鉴定结果
[0073][0074]
实施例3
[0075]
(1)样品组2：市面可购买的商品种8份(孟德尔3号、sk316、春奥709、诺贝二号、玫瑰红、腊捻、春奥705、红宝六寸参)。
[0076]
(2)试剂：2
×
taq master mix(for page)；金唯智合成的特异性扩增引物。
[0077]
正向引物序列为seq id no.1：5
’‑
ttgtgcggttaaggttgttgt-3’[0078]
反向引物序列为seq id no.2：5
’‑
cctgttcttgtggatcaatgga-3’。
[0079]
(3)多态性检测：提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组dna，并以其为模板，采用本发
明提供的特异性引物对进行pcr扩增。
[0080]
(4)pcr反应体系：总体积10μl，包括2
×
taq master mix(for page)5μl，上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板(25ng/μl)1μl，用无菌水补充至10μl。
[0081]
(5)pcr反应扩增程序：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min，1个循环。
[0082]
(6)毛细管电泳：pcr结束后，在样品孔中加入15μl的te，h12孔加入25μl的ladder，再将样品板放置于毛细管电泳仪中，待电泳结束后，采用对应的分析软件分析结果。
[0083]
(7)结果判断：如果pcr扩增产物为带型a(显示一条带，为264bp)，则待测胡萝卜为不育品种；如果pcr扩增产物为带型b(显示一条带，为272bp)，则待测胡萝卜为可育品种。
[0084]
(8)结果见表4和图3，由表4和图3可知，应用该indel分子标记和引物对可以准确地区分开胡萝卜瓣化型雄性不育和可育品系，该标记适合广泛应用。
[0085]
表4胡萝卜细胞质雄性不育性鉴定结果
[0086][0087]
综上所述，本发明通过转录组分析筛选indel分子标记并设计得到一对鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的特异性引物，采用所述引物对的鉴定方法具有良好的特异性，稳定性高，筛选速度快的优势，适合应用于胡萝卜细胞质雄性不育植株的鉴定，为加速胡萝卜品系快速育成提供了技术支撑。
[0088]
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

技术特征：
1.一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育性的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物序列：5
’‑
ttgtgcggttaaggttgttgt-3’；所述引物对的反向引物序列：5
’‑
cctgttcttgtggatcaatgga-3’。2.一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测胡萝卜样品的总dna；(2)采用权利要求1所述的引物对对提取的总dna进行pcr扩增得到产物；(3)将产物进行电泳分离条带，根据条带大小判断胡萝卜品种育性。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述判断胡萝卜品种育性的标准为：当扩增片段大小为264bp时，判定为该胡萝卜品种不育；当扩增片段大小为272bp时，判定为该胡萝卜品种可育。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述胡萝卜样品包括叶片和花序。5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述电泳的方法包括毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：总体积10μl，包括2
×
taq master mix for page 5μl，10μmol/l的正向引物和反向引物各0.5μl，25ng/μl的dna模板1μl，用无菌水补充至10μl。7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸5min，1个循环。8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述电泳为毛细管电泳，毛细管电泳步骤为：pcr结束后，在每个待测样品孔中分别加入15μl的te，marker孔加入25μl的ladder，再将样品板放置于毛细管电泳仪器中，待电泳结束后，采用分析软件分析结果。9.如权利要求1所述的引物对在制备鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育的试剂和/或试剂盒中的应用。10.一种鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育的试剂和/或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物对。

技术总结
本发明公开了一种鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育的引物对及其应用，所述引物对根据转录组分析筛选的Indel分子标记设计得到，所述应用为采用所述引物对鉴定胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育。本申请通过对一组稳定的胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育系及其保持系的总RNA进行转录组测序分析，与已公布的胡萝卜参考线粒体基因组进行比对，筛选出在不育系与保持系之间有差异的Indel位点并设计得到引物。通过在不同品种的胡萝卜可育株与不育株间进行特异性扩增验证，结果显示本申请的引物对能够完全区分待测品种育性，能在苗期快速筛选出细胞质雄性不育的胡萝卜品种，准确率高，为选育过程中去除杂株，具有重要的实际应用价值和市场前景。景。景。


技术研发人员：孙海波 王一衡 付任胜 岳东霞 陈磊 杨迎霞
受保护的技术使用者：天津市农业科学院
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2022/3/8