一种用于诊断消化系统肿瘤的分子标志物及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种用于诊断消化系统肿瘤的分子标志物及试剂盒。


背景技术：

2.胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道恶性肿瘤，5年生存率不到10％，被称为“癌中之王”。近年来，胰腺癌发病率和死亡率呈持续上升趋势，预计到2030年将成为全球第二位的致死性肿瘤。中国国家癌症中心2017年数据显示，胰腺癌居我国男性恶性肿瘤发病率的第7位，女性第11位，位于恶性肿瘤相关死亡率的第6位。胰腺癌起病隐匿，早期症状不典型，就诊时多已进展至晚期，多数已失去手术机会。对于可切除的胰腺癌患者，术后复发风险也较高，部分患者术后早期即出现局部复发或远处转移。国内数据显示2016-2019年期间3279例胰腺癌切除术后患者，9个月内复发率为45.87％(赵玉沛,中国胰腺癌诊治指南(2021).中国实用外科杂志,2021.7)。groot等分析957例胰腺癌术后患者，51.5％的患者在术后一年内出现局部复发或远处转移(groot,v.p.,et al.,defining and predicting early recurrence in 957patients with resected pancreatic ductal adenocarcinoma.ann surg,2019.269(6):p.1154-1162.)。
3.原发性肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率在2018年全球恶性肿瘤中排名第6位，是第4位肿瘤致死原因。75％-85％的病例的原发性肝癌中为肝细胞癌，简称肝癌。中国是肝癌大国，全球约一半的新发病例发生在中国，每年有30万-40万人死于肝癌。在我国，慢性乙肝-肝硬化是导致肝癌的主要原因。肝脏没有痛觉神经，癌变早期没有明显症状，少数病人会出现肝区疼痛、食欲减退、上腹不适、乏力等，多数肝癌患者确诊时已处于中晚期，失去最佳救治机会。
4.胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，预后较差，5年总体生存率为35.1％，严重危害人民健康。据统计，2020年全球胃癌新发病例和因胃癌死亡病例分别居第五位和第四位，其中43.9％发病病例和48.6％死亡病例发生在中国。幽门螺旋杆菌感染是胃癌最重要的危险因素。大部分胃癌患者早期症状不典型，可出现腹痛、乏力、消瘦等症状，确诊时多已进展至晚期。
5.食管癌是我国高发的恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤死亡原因中排名第四位。2020年我国食管癌发病人数达32万，死亡人数30万，均占全球的55％左右。食管癌有明显的地域和人群分布，我国主要分布于太行山区，提示环境是食管癌发病的危险因素。食管癌分为鳞癌和腺癌，在我国，90％左右的食管癌为鳞癌。手术是食管癌最有效的治疗方式，但由于早期症状不典型，多数确诊时已进入中晚期，失去手术机会。因此，发现高敏感性和特异性的早期诊断方法，以及寻找可治疗的靶点，对改善上述恶性肿瘤的疗效和预后具有重要的意义。
6.随着后基因组时代的到来，表观遗传学(epigenetics)已成为生命科学的研究前沿。在消化系肿瘤领域中，表观遗传学研究主要集中dna甲基化及组蛋白乙酰化上。dna甲基
化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与dna甲基化的异常有关，基因启动子区cpg岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。dna甲基化是指在甲基化转移酶的作用下,以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到cg二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。dna甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。
7.本技术意在筛选出具有强敏感性、高特异性的胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌诊断分子标志物，以及寻找有效的检测方法，建立有效监控手段，从而早诊早治，实现重要的临床应用价值。


技术实现要素：

8.本发明的第一个目的在于提供一种用于消化系统肿瘤诊断的分子标志物，该分子标志物具有敏感性强、特异性高的特点，及分子标志物在制备诊断胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌产品中的应用。
9.本发明的第二个目的在于提供一种检测上述分子标志物的物质在制备诊断消化系统肿瘤产品中的应用。
10.本发明的第三个目的在于提供一种基于上述分子标志物的诊断消化系统肿瘤的试剂盒。
11.为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
12.本发明提供了l3mbtl4基因启动子区dna片段作为分子标志物在制备诊断消化系统肿瘤产品中的应用，其中，所述消化系统肿瘤为胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌。
13.根据本发明的具体实施方式，作为分子标志物的所述l3mbtl4基因启动子区dna片段的核苷酸序列如seq id no.1所示(硫化处理前原始dna序列)，且包含至少一个甲基化位点。
14.mbt结构域是一个与组蛋白尾部甲基化的赖氨酸结合的结构域(如图3所示)，其在发育过程中可结合到靶基因的启动子区而抑制其转录。l3mbtl4是该家族中的一员。基于肿瘤和发育过程的相似机制，我们在不同肿瘤的细胞系中筛选了mbt基因家族不同成员的表达情况，发现l3mbtl4在多种肿瘤细胞中表达缺失，然后分析了其表达调控机制，通过msp的方法在胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌中检测到l3mbtl4启动子区的频繁甲基化。因此推断该基因的启动子区高甲基化状态可能是一个肿瘤分子标记物，l3mbtl4基因可能是一个新的肿瘤相关抑癌候选基因。以此为坚实的理论依据，本发明人应用msp的方法对大量临床肿瘤(胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌)组织及正常胰腺、肝、胃和食管标本进行检测，以明确其l3mbtl4基因启动子区甲基化状态。且本发明首次发现，l3mbtl4参与dna损伤修复的nhej通路，l3mbtl4甲基化是chk1抑制剂结合顺铂等化疗药物杀伤肿瘤细胞的协同致死标志物。
15.本发明还提供了检测l3mbtl4基因启动子区dna片段甲基化状态的物质在制备诊断消化系统肿瘤产品中的应用，其中，所述消化系统肿瘤主要为胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌。
16.可选的，所述l3mbtl4基因启动子区dna片段的核苷酸序列如seq id no.1所示(硫化处理前原始dna序列)，且包含至少一个甲基化位点。
17.本发明还提供了一种诊断消化系统肿瘤的试剂盒，包括用于检测l3mbtl4基因启
动子区甲基化状态的物质，所述消化系统肿瘤主要为胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌。
18.进一步的，所述用于检测l3mbtl4基因启动子区甲基化状态的物质针对l3mbtl4基因启动子区核苷酸序列如seq id no.1所示的dna序列。
19.进一步的，所述物质包括甲基化引物对和非甲基化引物对。
20.优选的，所述甲基化引物对的上游引物为5’ttttagggaacgaatatagagaaggac 3’，如seq id no.2所示，下游引物为5’ccacaccccgaaaaaccgaataacg 3’，如seq id no.3所示；所述非甲基化引物对的上游引物为5’ttttttagggaatgaatatagagaaggat 3’，如seq id no.4所示，下游引物为5’attccacaccccaaaaaaccaaataaca 3’，如seq id no.5所示。
21.利用上述甲基化引物对，以硫化修饰后的dna为模板进行msp扩增，如果l3mbtl4基因启动子区存在甲基化，则会得到117bp大小的片段；如果l3mbtl4基因正常即未甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本技术将该引物对称为甲基化引物对。所述甲基化引物对，其上游引物的tm值为58.6，gc含量37.0％，下游引物的tm值为64.7，gc含量52.0％。
22.利用上述非甲基化引物对，以硫化修饰后的dna为模板进行msp扩增，如果l3mbtl4基因未发生甲基化，则会得到122bp大小的片段。基于此，本技术将该引物对称为非甲基化引物对。所述非甲基化引物对，其上游引物的tm值为57.1，gc含量27.6％，下游引物的tm值为62.6，gc含量35.7％。
23.本发明中，用甲基化引物对进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物进行扩增则无扩增产物为完全甲基化；用甲基化及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物，为部分甲基化；用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物，为无甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定为甲基化。
24.进一步的，所述试剂盒还包括甲基化阳性对照pcr模板和非甲基化阳性对照pcr模板。
25.其中，所述甲基化阳性对照pcr模板为硫化修饰后的l3mbtl4基因启动子区100％甲基化的肿瘤细胞dna，例如胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌细胞；所述非甲基化阳性对照pcr模板为硫化修饰后的l3mbtl4基因启动子区100％非甲基化的正常淋巴细胞或正常组织细胞dna，例如正常胰腺、肝、胃或食管组织细胞。
26.进一步的，所述试剂盒还包括ms-pcr反应所需试剂，例如10
×
msp buffer缓冲液，20mmdntp，hot start taq酶，去离子水等。
27.进一步的，利用本发明的试剂盒进行消化系统肿瘤诊断时，尤其是胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌，可以使用现有技术中已知的ms-pcr方法。
28.优选的，反应条件如下：
29.95℃下预变性5min，接着进入循环，在95℃下变性30s，在60℃下退火30s，在72℃下延伸40s，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸5min。
30.本发明的有益效果如下：
31.利用本发明所述分子标志物，检测物质(引物)及试剂盒检测胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌组织细胞，在肿瘤细胞中l3mbtl4基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化率在胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌中分别约为48.8％，53.3％，50.0％和21.4％，而在正常组织细胞中，l3mbtl4基因启动子区呈非甲基化状态，表明该基因启动子区的甲基化状态对于胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌具有特异性；同时应用本发明所述引物及试剂盒、反应体系及反应
条件可使检测胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌细胞的灵敏度达到0.1％，即1000个细胞中有1个癌细胞就能够被检测出，这说明l3mbtl4基因启动子区甲基化状态可作为胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌的一个新的分子标志物。本发明首次选用l3mbtl4基因作为目标基因，我们探讨了胰腺癌细胞对chk1抑制剂(mk8776)敏感性，结果发现，顺铂药物诱导下，l3mbtl4甲基化的胰腺癌细胞(miapaca2)的ic50值为1.24
±
0.03μm，l3mbtl4非甲基化的胰腺癌细胞(cfpac1)的ic50值为7.28
±
0.15μm，l3mbtl4甲基化的胰腺癌细胞对mk8776更加敏感(p《0.05)。发现l3mbtl4参与dna损伤修复的nhej通路，l3mbtl4甲基化是chk1抑制剂结合顺铂等化疗药物杀伤肿瘤细胞的协同致死标志物。因此，应用本发明分子标志物、引物或试剂盒来检测l3mbtl4基因启动子区高甲基化状态可作为胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌的诊断、疗效观察、预后判断等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
32.图1示出以硫化修饰后的胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌组织dna，硫化修饰后的正常胰腺、肝、胃和食管组织dna为模板，分别用甲基化引物对及非甲基化引物对进行msp，扩增产物琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳结果图；其中，
33.pc1-pc5为胰腺癌，hcc1-hcc5为肝癌，gc1-gc5为胃癌，ec1-ec5为食管癌，np1-np2为正常胰腺，nh1、nh2为正常肝，ng1、ng2为正常胃，ne1、ne2为正常食管。另有ivd标记的为甲基化阳性对照，nl标记的为非甲基化阳性对照，h2o阴性对照(去离子水)。
34.图2示出将胰腺癌细胞系miapaca2的dna(l3mbtl4基因启动子区100％甲基化)与正常淋巴细胞的dna(l3mbtl4基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰，此后用甲基化引物进行扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳结果图；其中，
35.第1组：100％miapaca2细胞dna +0％正常细胞dna；
36.第2组：50％miapaca2细胞dna+50％正常细胞dna；
37.第3组：5％miapaca2细胞dna+95％正常细胞dna；
38.第4组：1％miapaca2细胞dna+99％正常细胞dna；
39.第5组：0.1％miapaca2细胞dna+99.9％正常细胞dna；
40.第6组：0％miapaca2细胞dna+100％正常细胞dna。
41.图3示出l3mbtl4的mbt结构域示意图。
具体实施方式
42.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
43.实施例1
44.1.模板的制备(基因组dna的提取及硫化修饰过程)
45.dna的制备：获取胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌及正常组织标本。在本实施例中胰腺癌5例(pc1-pc5)、肝癌5例(hcc1-hcc5)、胃癌5例(gc1-gc5)、食管癌5例(ec1-ec5)，正常胰腺(np1-np2)、正常肝(nh1-nh2)、正常胃(ng1-ng2)、正常食管(ne1-ne2)，应用酚-氯仿抽提
nh2)、胃(ng1-ng2)、食管(ne1-ne2)，胰腺癌(pc2，pc4)、肝癌(hcc3，hcc4)、胃癌(gc4，gc5)、食管癌(ec1，ec2，ec4，ec5)无扩增产物。而用非甲基化引物进行扩增，全部标本组织均有扩增产物。因此，胰腺癌(pc1，pc3，pc5)、肝癌(hcc1，hcc2，hcc5)、胃癌(gc1，gc2，gc3)、食管癌ec3为部分甲基化；正常胰腺(np1-np2)、肝(nh1-nh2)、胃(ng1-ng2)、食管(ne1-ne2)，胰腺癌(pc2，pc4)、肝癌(hcc3，hcc4)、胃癌(gc4，gc5)、食管癌(ec1，ec2，ec4，ec5)无甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定为甲基化。
67.实施例2临床标本检测
68.取胰腺癌临床标本160例，肝癌15例，胃癌16例，食管癌14例。进行msp扩增，模板制备、pcr扩增体系及条件、扩增产物的检测均与实施一中的相同，检测结果请见下表：
69.分类例数m(甲基化)例数u(无甲基化)例数甲基化阳性率胰腺癌160788248.8％肝癌158753.3％胃癌168850.0％食管癌1431121.4％
70.实施例3敏感度实验
71.将胰腺癌miapaca2细胞系dna(l3mbtl4基因启动子区100％甲基化)与正常淋巴细胞的dna(l3mbtl4基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰(方法同实施例一)后行msp。pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪测定并照相。
72.分组：第1组：100％miapaca2细胞dna+0％正常细胞dna；
73.第2组：50％miapaca2细胞dna+50％正常细胞dna；
74.第3组：5％miapaca2细胞dna+95％正常细胞dna；
75.第4组：1％miapaca2细胞dna+99％正常细胞dna；
76.第5组：0.1％miapaca2细胞dna+99.9％正常细胞dna；
77.第6组：0％miapaca2细胞dna+100％正常细胞dna。
78.结果见图2：在1000个正常细胞中有1个胰腺癌细胞就可以被检测出，即用本发明引物及反应体系、条件检测胰腺癌细胞l3mbtl4基因启动子区的甲基化状态其灵敏度可达到0.1％，灵敏度较高。
79.实施例4 chk1抑制剂(mk8776)结合顺铂等化疗药物杀伤肿瘤细胞的协同致死标志物的检测
80.将胰腺癌细胞miapaca2(l3mbtl4基因启动子区100％甲基化)与cfpac1(l3mbtl4基因启动子区100％非甲基化)进行药物敏感性实验，通过设置不同的mk8776浓度梯度miapaca2(0，0.5，1，2，4，8，16，32μm)和cfpac1(0，0.5，1，2，4，8，16，32，64μm)处理48小时后使用mtt实验检测490nm波长下的吸光度值，计算细胞对chk1抑制剂(mk8776)的敏感性，即ic50值(细胞的半数致死量)。检测结果见下表：
81.胰腺细胞ic50(μm)miapaca21.24
±
0.03cfpac17.28
±
0.15
82.实施例5检测胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌细胞的试剂盒组成
83.检测胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌细胞的试剂盒包括以下成分，其中，进行1次msp
的用量为：
84.1.浓度为50pmol/μl的甲基化引物对：核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物，各为0.5μl。
85.2.浓度为50pmol/μl的非甲基化引物对：核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no.5所示的下游引物，各为0.5μl。
86.3.反应体系2份，分别配合甲基化引物对和非甲基化引物对使用，每份反应体系包括：
87.(1)10
×
msp buffer(缓冲液)：2.5μl；
88.(2)25mmdntps：1.25μl；
89.(3)hot start taq酶：0.5μl；
90.(4)ddh2o：17.75μl。
91.一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次msp的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。
92.为防止出现msp扩增产物的假阳性和假阴性，试剂盒还可包括以下几项组成：
93.a、甲基化阳性对照pcr模板：经甲基转移酶处理过，硫化修饰后的l3mbtl4基因启动子区为100％甲基化的肿瘤组织dna，进行1次msp其用量为：2μl。
94.b、非甲基化阳性对照pcr模板：硫化修饰后的l3mbtl4基因启动子区为100％非甲基化的正常淋巴细胞dna，进行1次msp其用量为：2μl。
95.c、双阴性的体系对照：ddh2o，用以评估体系是否存在pcr产物的污染，如ddh2o检测的结果为双阴性(m和u均为阴性)，则体系结果可信。
96.显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

技术特征：
1.l3mbtl4基因启动子区dna片段作为分子标志物在制备诊断消化系统肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述消化系统肿瘤为胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述l3mbtl4基因启动子区dna片段的核苷酸序列如seq id no.1所示，且包含至少一个甲基化位点。3.检测l3mbtl4基因启动子区dna片段甲基化状态的物质在制备诊断消化系统肿瘤产品中的应用，其特征在于，所述消化系统肿瘤为胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述l3mbtl4基因启动子区dna片段的核苷酸序列如seq id no.1所示，且包含至少一个甲基化位点。5.一种诊断消化系统肿瘤的试剂盒，其特征在于：包括用于检测l3mbtl4基因启动子区甲基化状态的物质，所述消化系统肿瘤为胰腺癌、肝癌、胃癌或食管癌。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测l3mbtl4基因启动子区甲基化状态的物质针对l3mbtl4基因启动子区核苷酸序列如seq id no.1所示的dna序列。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述物质包括甲基化引物对和非甲基化引物对；优选的，所述甲基化引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示；所述非甲基化引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no.4所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.5所示。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括甲基化阳性对照pcr模板和非甲基化阳性对照pcr模板。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述甲基化阳性对照pcr模板为硫化修饰后的l3mbtl4基因启动子区100％甲基化的肿瘤细胞dna；所述非甲基化阳性对照pcr模板为硫化修饰后的l3mbtl4基因启动子区100％非甲基化的正常淋巴细胞或正常组织细胞dna。10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ms-pcr反应所需试剂。

技术总结
本发明公开了一种用于诊断消化系统肿瘤的分子标志物及试剂盒，尤其是L3MBTL4基因启动子区DNA甲基化作为分子标志物在制备诊断消化系统肿瘤产品中的应用。本发明首次通过MSP的方法在胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌中发现L3MBTL4启动子区频繁发生高甲基化，并发现L3MBTL4参与DNA损伤修复的NHEJ通路，L3MBTL4甲基化是CHK1抑制剂结合顺铂等化疗药物杀伤肿瘤细胞的协同致死标志物。本发明还提供了用于检测L3MBTL4基因启动子区甲基化状态的引物、试剂盒。应用本发明引物、试剂盒来检测L3MBTL4基因启动子区高甲基化状态可作为胰腺癌、肝癌、胃癌和食管癌诊断、疗效观察、预后判断、微小残留病检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。具有深远的临床意义和推广性。具有深远的临床意义和推广性。


技术研发人员：郭明洲 张美英 姚远新 苏小茉 吕红慧 李媛
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第一医学中心
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2022/3/8