一种诱导H22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法
一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法。
背景技术：
2.钙网蛋白(crt)是一种相对分子量为46kda的蛋白，是一种高度保守的内质网ca
2+
结合伴侣蛋白，除了维持细胞内ca
2+
平衡及负债糖蛋白的折叠外，还参与线粒体代谢、基因表达和细胞凋亡等过程。采用蒽环类化疗药物处理肿瘤细胞时，肿瘤细胞引起的内质网应激能导致肿瘤细胞内crt的外翻，外翻的 crt可有效增强抗原提呈细胞对肿瘤细胞的识别与吞噬，由此引发抗同种肿瘤细胞的免疫杀伤效应。由此说明，crt是引起肿瘤细胞免疫原性凋亡的关键因子，实现抗肿瘤治疗可能的一个潜在方法就是增加细胞表面crt的暴露。因此，crt在肿瘤免疫综合治疗过程中具有广泛的应用价值，有望在肿瘤免疫治疗中扮演越来越重要的角色。
3.h22细胞是1952年由苏联医学科学院肿瘤研究所以c3ha小鼠诱发的h22 肝癌实体瘤的瘤细胞悬液，昆明种小鼠(km)皮下移植后转腹水瘤。该瘤株在km小鼠、615小鼠、c57bl/6小鼠、balb/c小鼠体内可以形成实体瘤和腹水瘤，并且由于造价低廉、极易培养，因此被广泛应用于小鼠肿瘤动物模型的复制。
4.因此，可采用h22细胞表达钙网蛋白，并对其进行分离纯化，将纯化所得的钙网蛋白制成肿瘤免疫疫苗，提高机体对肿瘤细胞的免疫识别与清除能力，有望实现对肿瘤的免疫预防。但是，单纯采用h22细胞产生钙网蛋白提纯所得的钙网蛋白量较低，使得钙网蛋白制备成本较高。因此，有必要提供一种可诱导h22细胞高表达钙网蛋白的方法。
技术实现要素：
5.针对h22细胞对钙网蛋白表达量较低，钙网蛋白制备成本较高的问题，本发明提供一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
7.一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，包括香菇酸性多糖和氯化钾。
8.相对于现有技术，本发明提供的诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，以香菇酸性多糖作为诱导物，协同钾离子的细胞调节作用，诱导h22细胞高表达钙网蛋白，有效提高了钙网蛋白的产生量，为扩大钙网蛋白的应用以及工业化生产提供了保障，且原料成本低廉，具有较高的应用前景。
9.优选的，所述香菇酸性多糖的制备方法包括如下步骤：将香菇多糖溶于氢氧化钠溶液中，于50℃～70℃静置30min～50min，离心，取上清液，调节ph 至6.8～7.2，冷冻干燥，得香菇酸性多糖。
10.优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为1.0mol/l～1.2mol/l。
11.优选的，所述香菇多糖与氢氧化钠溶液的质量体积比为1:35～45，其中，质量的单位是克，体积的单位是毫升。
12.优选的香菇酸性多糖的制备方法可以获得收率和纯度较高的香菇酸性多糖。
13.本发明还提供了一种利用上述组合物诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
14.步骤a，将h22细胞加入完全培养基中制成细胞悬液，然后加入香菇酸性多糖，调节完全培养基的ph为7.3～7.5，然后将完全培养基置于co2培养箱中培养10h～14h后，调整完全培养基的ph为6.4～6.6，加入氯化钾水溶液，继续培养2h～3h后，调整完全培养基的ph为7.3～7.5，继续培养20h～25h，得共培养物；
15.步骤b，将所述共培养物进行冻融，离心，取上清液，向所述上清液中加入硫酸铵进行盐析，离心，取沉淀溶于生理盐水后进行透析除盐，浓缩，将浓缩液纯化，得钙网蛋白。
16.本发明提供的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，通过以香菇酸性多糖作为诱导物，并通过分阶段ph调整以及k离子细胞调节的协同作用，对h22 细胞进行诱导产生诱导蛋白，对诱导蛋白中产生的钙网蛋白进行分离纯化，可制备得到高表达量的钙网蛋白，且制备过程中采用的试剂成本低廉，为钙网蛋白的工业制备以及应用提供了有效保障，具有较高的推广应用价值。
17.优选的，步骤a中，所述香菇酸性多糖加入完全培养基后的浓度为 100μg/ml～170μg/ml。
18.优选的，步骤a中，所述氯化钾在共培养物中的浓度为 0.1μg/ml～0.5μg/ml。
19.优选的香菇酸性多糖和氯化钾浓度有利于促进h22细胞表达钙网蛋白，提高钙网蛋白的获得量。
20.优选的，步骤b中，将所述共培养物进行4～6次反复冻融；其中，冻融的具体步骤为：先将所述共培养物置于-15℃～-25℃冷冻2h～3h后，于30℃～37℃解冻。
21.经过上述优选条件下的反复冻融，可使细胞在较温和的条件下破碎，使细胞中的蛋白质、脂类物质等物质在充分释放的同时还能充分保持其生物学活性。
22.优选的，步骤b中，所述硫酸铵在上清液中的终浓度为28wt％～32wt％。
23.示例性的，步骤b中，加入硫酸铵以后搅拌50min～70min，静置1h～2h，然后再进行离心，以保证盐析效果。
24.示例性的，步骤b中所有离心均采用低温离心的方法，离心温度为3℃～5℃，离心转速为10000rpm，离心时间为10min。
25.示例性的，步骤b中，采用透析袋进行透析除盐，除盐温度为3℃～5℃，除盐时间为3天，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天，每隔8h更换一次无菌纯水。
26.示例性的，步骤b中，透析除盐结束后，在透析袋外放置聚乙二醇2000 进行浓缩，浓缩至滤余液为3ml。
27.优选的，步骤b中，所述纯化的具体步骤包括：将浓缩液加入阴离子交换层析柱中，以tris-hcl缓冲液、nacl、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸和2-肼基乙醇组成的洗脱液进行洗脱，收集目标组分，干燥，得钙网蛋白。
28.优选的，所述洗脱液中tris-hcl缓冲液的浓度为8mmol/l～12mmol/l， nacl的浓
度为0.15mol/l～0.25mol/l，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 (egta)的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l，2-肼基乙醇的浓度为 0.8mmol/l～1.2mmol/l。
29.进一步优选的，所述tris-hcl缓冲液的ph为8.0。
30.优选的，所述阴离子交换层析柱为deae sephader a-50。
31.优选的纯化方法不但可降低纯化过程钙网蛋白的损失，还能提高获得的钙网蛋白的纯度。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.为了更好的说明本发明，下面通过实施例做进一步的举例说明。
34.以下实施例中所用香菇酸性多糖均是按照如下方法制备得到：
35.取市售香菇多糖10g，溶于400ml 1.2mol/l的naoh溶液中，于60℃静置40min后，于8000rpm离心5min取上清，调节ph至7.0，冷冻干燥备用。
36.以下实施例中所用完全培养基的组成为：
37.1640培养基中补充20％小牛血清和抗生素，抗生素终浓度为：青霉素 100u/ml，链霉素100u/ml。
38.实施例1
39.本实施例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
40.步骤a，h22细胞的制备：
41.取对数生长期的h22细胞用生理盐水调节至细胞浓度为2
×
106cell/ml。选择体重20-25g的昆明种磁性小鼠(km)(6周龄)，腹腔注射接种细胞浓度为 2
×
106cell/ml的h22细胞，接种体积为0.2ml/只。接种后的小鼠放入动物实验室饲养，鼠粮和去纯净水供小鼠自由采食，每日观察小鼠的健康状况，饲养 8天，用医用注射器吸取小鼠腹水，1100rpm离心5min，去上清液，沉淀用去生理盐水洗涤3次，得h22细胞。
42.步骤b，共培养：
43.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为6.5，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.1μg/ml，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为 7.4，继续培养24h，得共培养物。
44.步骤c，共培养物的分离提取：
45.将所述共培养物至于-20℃进行冷冻，2h后取出放入37℃条件下解冻，重复5次进行冻融，将最后解冻后的共培养物于10000rpm条件下离心10min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度为30％，搅拌60min后静置1.5h，4℃、10000rpm条件下离心5min，取沉淀溶于10ml生理盐水中，加入透析袋(500da)在4℃条件下除盐3天，其中，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天每隔8h更换一次无菌纯水，将除盐后透析袋外部加入一层聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至体积为3ml，备用。
46.步骤d，钙网蛋白的纯化：
47.以洗脱液(10mmol/l tris-hcl(ph8.0)、0.2mol/l nacl、1mmol/l egta 和1mmol/l 2-肼基乙醇)将deae sephadex a-50树脂阴离子交换层析柱冲洗至uv检测器记录仪上出现基线后，加入步骤c所得的浓缩液，继续用上述洗脱液冲洗，分步收集样品，每10ml一组，直至uv检测器记录仪上的uv信号接近原来的基线，对收集样品采用钙网蛋白elisa检测试剂盒进行有无鉴定，将含有钙网蛋白的组分合并后进行冷冻干燥，得钙网蛋白样品。
48.本实施例中每克细胞样品得到128μg钙网蛋白。
49.实施例2
50.本实施例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
51.步骤a，h22细胞的制备：
52.取对数生长期的h22细胞用生理盐水调节至细胞浓度为2
×
106cell/ml。选择体重20-25g的昆明种磁性小鼠(km)(6周龄)，腹腔注射接种细胞浓度为 2
×
106cell/ml的h22细胞，接种体积为0.2ml/只。接种后的小鼠放入动物实验室饲养，鼠粮和去纯净水供小鼠自由采食，每日观察小鼠的健康状况，饲养 8天，用医用注射器吸取小鼠腹水，1100rpm离心5min，去上清液，沉淀用去生理盐水洗涤3次，得h22细胞。
53.步骤b，共培养：
54.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 170μg/ml，调节完全培养基的ph为7.3，然后将完全培养基置于37℃、5％的co2培养箱中培养10h后，调整完全培养基的ph为6.4，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.3μg/ml，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为 7.3，继续培养20h，得共培养物。
55.步骤c，共培养物的分离提取：
56.将所述共培养物至于-15℃进行冷冻，3h后取出放入37℃条件下解冻，重复5次进行冻融，将最后解冻后的共培养物于10000rpm条件下离心10min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度为30％，搅拌60min后静置 1.5h，4℃、10000rpm条件下离心5min，取沉淀溶于10ml生理盐水中，加入透析袋(500da)在4℃条件下除盐3天，其中，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天每隔8h更换一次无菌纯水，将除盐后透析袋外部加入一层聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至体积为3ml，备用。
57.步骤d，钙网蛋白的纯化：
58.以洗脱液(8mmol/l tris-hcl(ph8.0)、0.15mol/l nacl、1.2mmol/l egta 和0.8mmol/l 2-肼基乙醇)将deae sephadex a-50树脂阴离子交换层析柱冲洗至uv检测器记录仪上出现基线后，加入步骤c所得的浓缩液，继续用上述洗脱液冲洗，分步收集样品，每10ml一组，直至uv检测器记录仪上的uv 信号接近原来的基线，对收集样品采用钙网蛋白elisa检测试剂盒进行有无鉴定，将含有钙网蛋白的组分合并后进行冷冻干燥，得钙网蛋白样品。
59.本实施例中每克细胞样品得到118μg钙网蛋白。
60.实施例3
61.本实施例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
62.步骤a，h22细胞的制备：
63.取对数生长期的h22细胞用生理盐水调节至细胞浓度为2
×
106cell/ml。选择体重20-25g的昆明种磁性小鼠(km)(6周龄)，腹腔注射接种细胞浓度为 2
×
106cell/ml的h22细胞，接种体积为0.2ml/只。接种后的小鼠放入动物实验室饲养，鼠粮和纯净水供小鼠自由采食，每日观察小鼠的健康状况，饲养8 天，用医用注射器吸取小鼠腹水，1100rpm离心5min，去上清液，沉淀用去生理盐水洗涤3次，得h22细胞。
64.步骤b，共培养：
65.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 100μg/ml，调节完全培养基的ph为7.5，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养14h后，调整完全培养基的ph为6.6，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.5μg/ml，继续培养3h后，调整完全培养基的ph为 7.5，继续培养25h，得共培养物。
66.步骤c，共培养物的分离提取：
67.将所述共培养物至于-25℃进行冷冻，2h后取出放入37℃条件下解冻，重复4次进行冻融，将最后解冻后的共培养物于10000rpm条件下离心10min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度为28％，搅拌60min后静置 1.5h，4℃、10000rpm条件下离心5min，取沉淀溶于10ml生理盐水中，加入透析袋(500da)在4℃条件下除盐3天，其中，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天每隔8h更换一次无菌纯水，将除盐后透析袋外部加入一层聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至体积为3ml，备用。
68.步骤d，钙网蛋白的纯化：
69.以洗脱液(12mmol/l tris-hcl(ph8.0)、0.25mol/l nacl、0.8mmol/l egta和1.2mmol/l 2-肼基乙醇)将deae sephadex a-50树脂阴离子交换层析柱冲洗至uv检测器记录仪上出现基线后，加入步骤c所得的浓缩液，继续用上述洗脱液冲洗，分步收集样品，每10ml一组，直至uv检测器记录仪上的uv信号接近原来的基线，对收集样品采用钙网蛋白elisa检测试剂盒进行有无鉴定，将含有钙网蛋白的组分合并后进行冷冻干燥，得钙网蛋白样品。
70.本实施例中每克细胞样品得到121μg钙网蛋白。
71.对比例1
72.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中维持培养基的ph为7.4，且不加入kcl，具体步骤b为：
73.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为7.4，继续培养2h后，再次调整完全培养基的ph为7.4，继续培养24h，得共培养物。
74.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
75.本对比例每克细胞样品得到57μg钙网蛋白。
76.对比例2
77.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中维持培养基的ph为7.4，具体步骤b为：
78.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数
(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为7.4，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.1μg/ml，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为 7.4，继续培养24h，得共培养物。
79.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
80.本对比例每克细胞样品得到69μg钙网蛋白。
81.对比例3
82.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中不加kcl，具体步骤b为：
83.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为6.5，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为7.4，继续培养24h，得共培养物。
84.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
85.本对比例每克细胞样品得到78μg钙网蛋白。
86.对比例4
87.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中诱导物采用的是香菇多糖混合物 (即市售的香菇多糖)，具体步骤b为：
88.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇多糖，使香菇多糖的浓度为130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为6.5，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为7.4，继续培养24h，得共培养物。
89.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
90.本对比例每克细胞样品得到85μg钙网蛋白。
91.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，其特征在于，包括香菇酸性多糖和氯化钾。2.如权利要求1所述的诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，其特征在于，所述香菇酸性多糖的制备方法包括如下步骤：将香菇多糖溶于氢氧化钠溶液中，于50℃～70℃静置30min～50min，离心，取上清液，调节ph至6.8～7.2，冷冻干燥，得香菇酸性多糖。3.如权利要求2所述的诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，其特征在于，所述香菇多糖与氢氧化钠溶液的质量体积比为1:35～45，其中，质量的单位是克，体积的单位是毫升。4.一种利用权利要求1-3任一项所述的组合物诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，将h22细胞加入完全培养基中制成细胞悬液，然后加入香菇酸性多糖，调节完全培养基的ph为7.3～7.5，然后将完全培养基置于co2培养箱中培养10h～14h后，调整完全培养基的ph为6.4～6.6，加入氯化钾水溶液，继续培养2h～3h后，调整完全培养基的ph为7.3～7.5，继续培养20h～25h，得共培养物；步骤b，将所述共培养物进行冻融，离心，取上清液，向所述上清液中加入硫酸铵进行盐析，离心，取沉淀溶于生理盐水后进行透析除盐，浓缩，将浓缩液纯化，得钙网蛋白。5.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤a中，所述香菇酸性多糖加入完全培养基后的浓度为100μg/ml～170μg/ml。6.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤a中，所述氯化钾在共培养物中的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml。7.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤b中，将所述共培养物进行4～6次反复冻融；其中，冻融的具体步骤为：先将所述共培养物置于-15℃～-25℃冷冻2h～3h后，于30℃～37℃解冻。8.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤b中，所述纯化的具体步骤包括：将浓缩液加入阴离子交换层析柱中，以tris-hcl缓冲液、nacl、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸和2-肼基乙醇组成的洗脱液进行洗脱，收集目标组分，干燥，得钙网蛋白。9.如权利要求8所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，所述洗脱液中tris-hcl缓冲液的浓度为8mmol/l～12mmol/l，nacl的浓度为0.15mol/l～0.25mol/l，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l，2-肼基乙醇的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l。10.如权利要求8所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱为deae sephader a-50。
技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，具体公开一种诱导H22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法。所述诱导H22细胞表达钙网蛋白的组合物包括香菇酸性多糖和氯化钾。本发明提供的诱导H22细胞产生钙网蛋白的方法，通过以香菇酸性多糖作为诱导物，并通过分阶段pH调整以及K离子细胞调节的协同作用，对H22细胞进行诱导产生诱导蛋白，对诱导蛋白中产生的钙网蛋白进行分离纯化，可制备得到高表达量的钙网蛋白，且制备过程中采用的试剂成本低廉，为钙网蛋白的工业制备以及应用提供了有效保障，具有较高的推广应用价值。具有较高的推广应用价值。
技术研发人员：韩雪 杨新 李研东 郑艳铭 李雪梅 胡高爽 刘志勤 高山 赵紫华 王超
受保护的技术使用者：河北科技大学
技术研发日：2021.12.07
技术公布日：2022/3/8
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法。
背景技术：
2.钙网蛋白(crt)是一种相对分子量为46kda的蛋白，是一种高度保守的内质网ca
2+
结合伴侣蛋白，除了维持细胞内ca
2+
平衡及负债糖蛋白的折叠外，还参与线粒体代谢、基因表达和细胞凋亡等过程。采用蒽环类化疗药物处理肿瘤细胞时，肿瘤细胞引起的内质网应激能导致肿瘤细胞内crt的外翻，外翻的 crt可有效增强抗原提呈细胞对肿瘤细胞的识别与吞噬，由此引发抗同种肿瘤细胞的免疫杀伤效应。由此说明，crt是引起肿瘤细胞免疫原性凋亡的关键因子，实现抗肿瘤治疗可能的一个潜在方法就是增加细胞表面crt的暴露。因此，crt在肿瘤免疫综合治疗过程中具有广泛的应用价值，有望在肿瘤免疫治疗中扮演越来越重要的角色。
3.h22细胞是1952年由苏联医学科学院肿瘤研究所以c3ha小鼠诱发的h22 肝癌实体瘤的瘤细胞悬液，昆明种小鼠(km)皮下移植后转腹水瘤。该瘤株在km小鼠、615小鼠、c57bl/6小鼠、balb/c小鼠体内可以形成实体瘤和腹水瘤，并且由于造价低廉、极易培养，因此被广泛应用于小鼠肿瘤动物模型的复制。
4.因此，可采用h22细胞表达钙网蛋白，并对其进行分离纯化，将纯化所得的钙网蛋白制成肿瘤免疫疫苗，提高机体对肿瘤细胞的免疫识别与清除能力，有望实现对肿瘤的免疫预防。但是，单纯采用h22细胞产生钙网蛋白提纯所得的钙网蛋白量较低，使得钙网蛋白制备成本较高。因此，有必要提供一种可诱导h22细胞高表达钙网蛋白的方法。
技术实现要素：
5.针对h22细胞对钙网蛋白表达量较低，钙网蛋白制备成本较高的问题，本发明提供一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
7.一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，包括香菇酸性多糖和氯化钾。
8.相对于现有技术，本发明提供的诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，以香菇酸性多糖作为诱导物，协同钾离子的细胞调节作用，诱导h22细胞高表达钙网蛋白，有效提高了钙网蛋白的产生量，为扩大钙网蛋白的应用以及工业化生产提供了保障，且原料成本低廉，具有较高的应用前景。
9.优选的，所述香菇酸性多糖的制备方法包括如下步骤：将香菇多糖溶于氢氧化钠溶液中，于50℃～70℃静置30min～50min，离心，取上清液，调节ph 至6.8～7.2，冷冻干燥，得香菇酸性多糖。
10.优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为1.0mol/l～1.2mol/l。
11.优选的，所述香菇多糖与氢氧化钠溶液的质量体积比为1:35～45，其中，质量的单位是克，体积的单位是毫升。
12.优选的香菇酸性多糖的制备方法可以获得收率和纯度较高的香菇酸性多糖。
13.本发明还提供了一种利用上述组合物诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
14.步骤a，将h22细胞加入完全培养基中制成细胞悬液，然后加入香菇酸性多糖，调节完全培养基的ph为7.3～7.5，然后将完全培养基置于co2培养箱中培养10h～14h后，调整完全培养基的ph为6.4～6.6，加入氯化钾水溶液，继续培养2h～3h后，调整完全培养基的ph为7.3～7.5，继续培养20h～25h，得共培养物；
15.步骤b，将所述共培养物进行冻融，离心，取上清液，向所述上清液中加入硫酸铵进行盐析，离心，取沉淀溶于生理盐水后进行透析除盐，浓缩，将浓缩液纯化，得钙网蛋白。
16.本发明提供的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，通过以香菇酸性多糖作为诱导物，并通过分阶段ph调整以及k离子细胞调节的协同作用，对h22 细胞进行诱导产生诱导蛋白，对诱导蛋白中产生的钙网蛋白进行分离纯化，可制备得到高表达量的钙网蛋白，且制备过程中采用的试剂成本低廉，为钙网蛋白的工业制备以及应用提供了有效保障，具有较高的推广应用价值。
17.优选的，步骤a中，所述香菇酸性多糖加入完全培养基后的浓度为 100μg/ml～170μg/ml。
18.优选的，步骤a中，所述氯化钾在共培养物中的浓度为 0.1μg/ml～0.5μg/ml。
19.优选的香菇酸性多糖和氯化钾浓度有利于促进h22细胞表达钙网蛋白，提高钙网蛋白的获得量。
20.优选的，步骤b中，将所述共培养物进行4～6次反复冻融；其中，冻融的具体步骤为：先将所述共培养物置于-15℃～-25℃冷冻2h～3h后，于30℃～37℃解冻。
21.经过上述优选条件下的反复冻融，可使细胞在较温和的条件下破碎，使细胞中的蛋白质、脂类物质等物质在充分释放的同时还能充分保持其生物学活性。
22.优选的，步骤b中，所述硫酸铵在上清液中的终浓度为28wt％～32wt％。
23.示例性的，步骤b中，加入硫酸铵以后搅拌50min～70min，静置1h～2h，然后再进行离心，以保证盐析效果。
24.示例性的，步骤b中所有离心均采用低温离心的方法，离心温度为3℃～5℃，离心转速为10000rpm，离心时间为10min。
25.示例性的，步骤b中，采用透析袋进行透析除盐，除盐温度为3℃～5℃，除盐时间为3天，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天，每隔8h更换一次无菌纯水。
26.示例性的，步骤b中，透析除盐结束后，在透析袋外放置聚乙二醇2000 进行浓缩，浓缩至滤余液为3ml。
27.优选的，步骤b中，所述纯化的具体步骤包括：将浓缩液加入阴离子交换层析柱中，以tris-hcl缓冲液、nacl、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸和2-肼基乙醇组成的洗脱液进行洗脱，收集目标组分，干燥，得钙网蛋白。
28.优选的，所述洗脱液中tris-hcl缓冲液的浓度为8mmol/l～12mmol/l， nacl的浓
度为0.15mol/l～0.25mol/l，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 (egta)的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l，2-肼基乙醇的浓度为 0.8mmol/l～1.2mmol/l。
29.进一步优选的，所述tris-hcl缓冲液的ph为8.0。
30.优选的，所述阴离子交换层析柱为deae sephader a-50。
31.优选的纯化方法不但可降低纯化过程钙网蛋白的损失，还能提高获得的钙网蛋白的纯度。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.为了更好的说明本发明，下面通过实施例做进一步的举例说明。
34.以下实施例中所用香菇酸性多糖均是按照如下方法制备得到：
35.取市售香菇多糖10g，溶于400ml 1.2mol/l的naoh溶液中，于60℃静置40min后，于8000rpm离心5min取上清，调节ph至7.0，冷冻干燥备用。
36.以下实施例中所用完全培养基的组成为：
37.1640培养基中补充20％小牛血清和抗生素，抗生素终浓度为：青霉素 100u/ml，链霉素100u/ml。
38.实施例1
39.本实施例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
40.步骤a，h22细胞的制备：
41.取对数生长期的h22细胞用生理盐水调节至细胞浓度为2
×
106cell/ml。选择体重20-25g的昆明种磁性小鼠(km)(6周龄)，腹腔注射接种细胞浓度为 2
×
106cell/ml的h22细胞，接种体积为0.2ml/只。接种后的小鼠放入动物实验室饲养，鼠粮和去纯净水供小鼠自由采食，每日观察小鼠的健康状况，饲养 8天，用医用注射器吸取小鼠腹水，1100rpm离心5min，去上清液，沉淀用去生理盐水洗涤3次，得h22细胞。
42.步骤b，共培养：
43.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为6.5，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.1μg/ml，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为 7.4，继续培养24h，得共培养物。
44.步骤c，共培养物的分离提取：
45.将所述共培养物至于-20℃进行冷冻，2h后取出放入37℃条件下解冻，重复5次进行冻融，将最后解冻后的共培养物于10000rpm条件下离心10min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度为30％，搅拌60min后静置1.5h，4℃、10000rpm条件下离心5min，取沉淀溶于10ml生理盐水中，加入透析袋(500da)在4℃条件下除盐3天，其中，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天每隔8h更换一次无菌纯水，将除盐后透析袋外部加入一层聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至体积为3ml，备用。
46.步骤d，钙网蛋白的纯化：
47.以洗脱液(10mmol/l tris-hcl(ph8.0)、0.2mol/l nacl、1mmol/l egta 和1mmol/l 2-肼基乙醇)将deae sephadex a-50树脂阴离子交换层析柱冲洗至uv检测器记录仪上出现基线后，加入步骤c所得的浓缩液，继续用上述洗脱液冲洗，分步收集样品，每10ml一组，直至uv检测器记录仪上的uv信号接近原来的基线，对收集样品采用钙网蛋白elisa检测试剂盒进行有无鉴定，将含有钙网蛋白的组分合并后进行冷冻干燥，得钙网蛋白样品。
48.本实施例中每克细胞样品得到128μg钙网蛋白。
49.实施例2
50.本实施例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
51.步骤a，h22细胞的制备：
52.取对数生长期的h22细胞用生理盐水调节至细胞浓度为2
×
106cell/ml。选择体重20-25g的昆明种磁性小鼠(km)(6周龄)，腹腔注射接种细胞浓度为 2
×
106cell/ml的h22细胞，接种体积为0.2ml/只。接种后的小鼠放入动物实验室饲养，鼠粮和去纯净水供小鼠自由采食，每日观察小鼠的健康状况，饲养 8天，用医用注射器吸取小鼠腹水，1100rpm离心5min，去上清液，沉淀用去生理盐水洗涤3次，得h22细胞。
53.步骤b，共培养：
54.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 170μg/ml，调节完全培养基的ph为7.3，然后将完全培养基置于37℃、5％的co2培养箱中培养10h后，调整完全培养基的ph为6.4，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.3μg/ml，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为 7.3，继续培养20h，得共培养物。
55.步骤c，共培养物的分离提取：
56.将所述共培养物至于-15℃进行冷冻，3h后取出放入37℃条件下解冻，重复5次进行冻融，将最后解冻后的共培养物于10000rpm条件下离心10min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度为30％，搅拌60min后静置 1.5h，4℃、10000rpm条件下离心5min，取沉淀溶于10ml生理盐水中，加入透析袋(500da)在4℃条件下除盐3天，其中，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天每隔8h更换一次无菌纯水，将除盐后透析袋外部加入一层聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至体积为3ml，备用。
57.步骤d，钙网蛋白的纯化：
58.以洗脱液(8mmol/l tris-hcl(ph8.0)、0.15mol/l nacl、1.2mmol/l egta 和0.8mmol/l 2-肼基乙醇)将deae sephadex a-50树脂阴离子交换层析柱冲洗至uv检测器记录仪上出现基线后，加入步骤c所得的浓缩液，继续用上述洗脱液冲洗，分步收集样品，每10ml一组，直至uv检测器记录仪上的uv 信号接近原来的基线，对收集样品采用钙网蛋白elisa检测试剂盒进行有无鉴定，将含有钙网蛋白的组分合并后进行冷冻干燥，得钙网蛋白样品。
59.本实施例中每克细胞样品得到118μg钙网蛋白。
60.实施例3
61.本实施例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，包括如下步骤：
62.步骤a，h22细胞的制备：
63.取对数生长期的h22细胞用生理盐水调节至细胞浓度为2
×
106cell/ml。选择体重20-25g的昆明种磁性小鼠(km)(6周龄)，腹腔注射接种细胞浓度为 2
×
106cell/ml的h22细胞，接种体积为0.2ml/只。接种后的小鼠放入动物实验室饲养，鼠粮和纯净水供小鼠自由采食，每日观察小鼠的健康状况，饲养8 天，用医用注射器吸取小鼠腹水，1100rpm离心5min，去上清液，沉淀用去生理盐水洗涤3次，得h22细胞。
64.步骤b，共培养：
65.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 100μg/ml，调节完全培养基的ph为7.5，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养14h后，调整完全培养基的ph为6.6，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.5μg/ml，继续培养3h后，调整完全培养基的ph为 7.5，继续培养25h，得共培养物。
66.步骤c，共培养物的分离提取：
67.将所述共培养物至于-25℃进行冷冻，2h后取出放入37℃条件下解冻，重复4次进行冻融，将最后解冻后的共培养物于10000rpm条件下离心10min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至饱和度为28％，搅拌60min后静置 1.5h，4℃、10000rpm条件下离心5min，取沉淀溶于10ml生理盐水中，加入透析袋(500da)在4℃条件下除盐3天，其中，第一天每隔2h更换一次无菌纯水，第二天每隔4h更换一次无菌纯水，第三天每隔8h更换一次无菌纯水，将除盐后透析袋外部加入一层聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至体积为3ml，备用。
68.步骤d，钙网蛋白的纯化：
69.以洗脱液(12mmol/l tris-hcl(ph8.0)、0.25mol/l nacl、0.8mmol/l egta和1.2mmol/l 2-肼基乙醇)将deae sephadex a-50树脂阴离子交换层析柱冲洗至uv检测器记录仪上出现基线后，加入步骤c所得的浓缩液，继续用上述洗脱液冲洗，分步收集样品，每10ml一组，直至uv检测器记录仪上的uv信号接近原来的基线，对收集样品采用钙网蛋白elisa检测试剂盒进行有无鉴定，将含有钙网蛋白的组分合并后进行冷冻干燥，得钙网蛋白样品。
70.本实施例中每克细胞样品得到121μg钙网蛋白。
71.对比例1
72.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中维持培养基的ph为7.4，且不加入kcl，具体步骤b为：
73.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为7.4，继续培养2h后，再次调整完全培养基的ph为7.4，继续培养24h，得共培养物。
74.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
75.本对比例每克细胞样品得到57μg钙网蛋白。
76.对比例2
77.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中维持培养基的ph为7.4，具体步骤b为：
78.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数
(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为7.4，加入氯化钾水溶液，使钾离子的浓度为0.1μg/ml，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为 7.4，继续培养24h，得共培养物。
79.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
80.本对比例每克细胞样品得到69μg钙网蛋白。
81.对比例3
82.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中不加kcl，具体步骤b为：
83.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇酸性多糖，使香菇酸性多糖的浓度为 130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的 co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为6.5，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为7.4，继续培养24h，得共培养物。
84.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
85.本对比例每克细胞样品得到78μg钙网蛋白。
86.对比例4
87.本对比例提供一种诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其步骤与实施例1 完全相同，不同的仅是步骤b中共培养过程中诱导物采用的是香菇多糖混合物 (即市售的香菇多糖)，具体步骤b为：
88.将步骤a制备的h22细胞加入到4ml完全培养基中制成细胞悬液，进行细胞计数(107/ml)，然后加入香菇多糖，使香菇多糖的浓度为130μg/ml，调节完全培养基的ph为7.4，然后将完全培养基置于37℃、5％的co2培养箱中培养12h后，调整完全培养基的ph为6.5，继续培养2h后，调整完全培养基的ph为7.4，继续培养24h，得共培养物。
89.步骤a、步骤c和步骤d与实施例1完全相同。
90.本对比例每克细胞样品得到85μg钙网蛋白。
91.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，其特征在于，包括香菇酸性多糖和氯化钾。2.如权利要求1所述的诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，其特征在于，所述香菇酸性多糖的制备方法包括如下步骤：将香菇多糖溶于氢氧化钠溶液中，于50℃～70℃静置30min～50min，离心，取上清液，调节ph至6.8～7.2，冷冻干燥，得香菇酸性多糖。3.如权利要求2所述的诱导h22细胞表达钙网蛋白的组合物，其特征在于，所述香菇多糖与氢氧化钠溶液的质量体积比为1:35～45，其中，质量的单位是克，体积的单位是毫升。4.一种利用权利要求1-3任一项所述的组合物诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，将h22细胞加入完全培养基中制成细胞悬液，然后加入香菇酸性多糖，调节完全培养基的ph为7.3～7.5，然后将完全培养基置于co2培养箱中培养10h～14h后，调整完全培养基的ph为6.4～6.6，加入氯化钾水溶液，继续培养2h～3h后，调整完全培养基的ph为7.3～7.5，继续培养20h～25h，得共培养物；步骤b，将所述共培养物进行冻融，离心，取上清液，向所述上清液中加入硫酸铵进行盐析，离心，取沉淀溶于生理盐水后进行透析除盐，浓缩，将浓缩液纯化，得钙网蛋白。5.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤a中，所述香菇酸性多糖加入完全培养基后的浓度为100μg/ml～170μg/ml。6.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤a中，所述氯化钾在共培养物中的浓度为0.1μg/ml～0.5μg/ml。7.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤b中，将所述共培养物进行4～6次反复冻融；其中，冻融的具体步骤为：先将所述共培养物置于-15℃～-25℃冷冻2h～3h后，于30℃～37℃解冻。8.如权利要求4所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，步骤b中，所述纯化的具体步骤包括：将浓缩液加入阴离子交换层析柱中，以tris-hcl缓冲液、nacl、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸和2-肼基乙醇组成的洗脱液进行洗脱，收集目标组分，干燥，得钙网蛋白。9.如权利要求8所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，所述洗脱液中tris-hcl缓冲液的浓度为8mmol/l～12mmol/l，nacl的浓度为0.15mol/l～0.25mol/l，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l，2-肼基乙醇的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l。10.如权利要求8所述的诱导h22细胞产生钙网蛋白的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱为deae sephader a-50。
技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，具体公开一种诱导H22细胞表达钙网蛋白的组合物及利用该组合物产生钙网蛋白的方法。所述诱导H22细胞表达钙网蛋白的组合物包括香菇酸性多糖和氯化钾。本发明提供的诱导H22细胞产生钙网蛋白的方法，通过以香菇酸性多糖作为诱导物，并通过分阶段pH调整以及K离子细胞调节的协同作用，对H22细胞进行诱导产生诱导蛋白，对诱导蛋白中产生的钙网蛋白进行分离纯化，可制备得到高表达量的钙网蛋白，且制备过程中采用的试剂成本低廉，为钙网蛋白的工业制备以及应用提供了有效保障，具有较高的推广应用价值。具有较高的推广应用价值。
技术研发人员：韩雪 杨新 李研东 郑艳铭 李雪梅 胡高爽 刘志勤 高山 赵紫华 王超
受保护的技术使用者：河北科技大学
技术研发日：2021.12.07
技术公布日：2022/3/8
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