一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法

1.本发明属于药物载体材料领域，涉及一种介孔二氧化硅药物递送系统及其应用。具体 涉及由葡聚糖包覆的介孔二氧化硅载药体系的构建及其应用。所述的介孔二氧化硅药物递送 系统可以作为诊断和治疗结合的刺激响应型药物递送。


背景技术：

2.结直肠癌是常见的癌症之一，无论是发病率还是死亡率在恶性肿瘤中均位于前三位。研 究表明，结直肠癌的发病过程涉及遗传、环境、饮食和肠道菌群等多种因素。肠道菌群在消 化系统恶性肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，尤其是具核梭杆菌(fn)，在包含口腔癌、食 管癌、结直肠癌等在内的消化道恶性肿瘤患者中被检测到显著富集，并提示不良预后。fn是 一种革兰阴性、厌氧、梭型杆菌，通过黏附定植、诱发炎症、抑制免疫、促进肿瘤增殖、增 强肿瘤侵袭等多种方式参与到相关消化系统恶性肿瘤的进程中，进一步影响化疗药物的作用 效果。
3.近年来，研究者们针对肿瘤部位存在微酸、乏氧、高表达活性氧和谷胱甘肽等特异性微 环境，开发了一系列刺激响应性递送系统并对其作用机制进行了深入研究，而crc部位特殊 的内源性刺激微环境(硫化氢、精胺、偶氮还原酶)为结肠癌的诊断和治疗提供了新的靶点。


技术实现要素：

4.本发明即针对上述技术分析和存在问题，提供一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊 疗一体化纳米粒子的制备方法，该制备方法简便，易于实施且制备成本低
5.本发明的技术方案：
6.一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法，所述纳米材料 为以介孔硅为载体，介孔硅负载氧化亚铜和bnn6将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一 体化纳米粒子的制备方法，制备步骤如下：
7.1)以三乙胺为碱源合成了介孔硅，并用3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行氨基修饰，合成氨 基化介孔二氧化硅纳米粒子(msn-nh2)，进一步利用nh2和苯硼酸羧基的酰胺化反应，制备 苯硼酸修饰的介孔硅。
8.2)通过苯硼酸和葡聚糖形成硼酸酯键，将氧化亚铜和bnn6负载于介孔硅中。
9.本发明的优点是：利用纳米颗粒的被动靶向效应可实现其在肿瘤部位蓄积，而肿瘤部位 的弱酸环境和过表达的过氧化氢能促进硼酸酯键的断裂，从而释放有利于在肿瘤部位深层渗 透的小粒径的氧化亚铜(其粒径20-30nm)，实现在肿瘤部位的深层渗透，进而与肿瘤细胞内 的硫化氢反应生成cu9s8，在特定波长的光照的条件下实现光声成像和光热治疗。
附图说明
10.1)图1为纳米粒子的设计和作用机理图。
11.2)图2为msn，msn-nh2，msn-pba的红外谱图。
12.3)图3为msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex的紫外吸收谱图。
13.4)图4为msn，msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex的粒径分布。
14.5)图5为msn，msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex的电势图。
15.6)图6为不同浓度cu2o/bnn6@msn-dex的温度变化曲线。
16.7)图7为抗菌活性检测的细菌菌落分布。
17.8)图8为抗菌活性检测的数量分析图。
18.9)图9为肿瘤细胞存活率。
19.10)图10为小鼠肿瘤部位的光声信号图。
20.11)图11为不同治疗组小鼠的体重变化曲线。
21.12)图12为不同治疗组小鼠肿瘤体积的变化曲线。
22.13)图13为不同治疗组小鼠肿瘤图像。
具体实施方式
23.附图1给出了本发明纳米粒子的设计和作用机理，由附图可知，本发明为以介孔硅为载 体，负载氧化亚铜和bnn6，通过葡聚糖包覆的纳米粒子(cu2o/bnn6@msn-dex)。
24.下面给出本发明具体实例阐述：
25.1.氧化亚铜的合成
26.在搅拌下，将乙酸铜(40mg)和聚(乙烯基吡咯烷酮)(0.5g)在70℃下加入到15ml乙 二醇中。搅拌2小时后，将5ml氢氧化钠(2m)加入上述混合物中。然后，30分钟后， 将溶于5ml水中的132.1mg抗坏血酸添加到溶液中。搅拌30分钟后，通过离心获得产物并 用蒸馏水洗涤两次。
27.2.bnn6的合成
28.将5ml亚硝酸钠水溶液(6m)加入到含有10mm n，n-二仲丁基对苯二胺的4.5ml乙 醇中，同时将混合液在室温下搅拌并充n2保护。然后向反应溶液中滴加5ml的hcl。4小 时后，固体产物用蒸馏水和50％(v/v)乙醇/水通过离心洗涤三次以清除多余的反应物。产品在 冷冻真空下干燥并在避光条件下储存。
29.3.介孔硅的合成
30.将0.68g三乙胺和20ml超纯水加入到100ml烧杯中，于80℃水浴30分钟，再加入 0.38g十六烷基三甲基溴化铵和0.16g水杨酸钠，搅拌均匀后，加入4ml正硅酸乙酯，搅拌 2小时后离心，用超纯水和乙醇各洗涤2次，烘箱干燥整夜.取0.30g上述材料，加入60ml 乙醇和0.77ml浓盐酸，水浴6小时后离心，用乙醇清洗2次，置于80℃烘箱干燥，即得介 孔硅。
31.4.msn-pba
32.将制备的介孔硅(0.5g)分散在甲苯(50ml)中，并加入200μl(3-氨基丙基)三乙氧 基硅烷。溶液回流12小时。离心并用甲醇和水洗涤3次。得到氨基化介孔硅(msn-nh2)
33.称取0.1g的msn-nh2颗粒，加入到10ml含有20mg/ml的4-羧基苯硼酸的二甲基亚 砜溶液中，然后再加入10mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和20mg的n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺，在室温下搅拌24小时。离心用水洗涤。
34.5.纳米粒子的组装
35.称取10mg的msn-pba加入到3ml含有cu2o和bnn6的pbs(ph＝7.4)溶液中， 室温搅拌12小时。然后在震荡下滴加1ml的葡聚糖水溶液(1mg/ml)，最后用pbs洗涤， 冷冻干燥。
36.6.体外光热
37.在808nm激光(1.2w/cm2)照射下，使用flir a310热像仪记录在nahs存在下 cu2o/bnn6@msn-dex的温度变化。通过将nahs(200μl，10mm)溶液添加到不同浓度的 cu2o/bnn6@msn-dex(1.5ml)。孵育1小时后，将反应后的溶液放入石英比色皿中，通 过热像仪记录上述溶液在激光照射下15分钟的温度变化。
38.7.抗菌实验
39.将过夜培养的细菌fn用1ml的pbs(ph＝7.4)稀释到玻璃管中。并且将各个测试菌 的od600调节至0.01，其对应于约107cfu ml-1
的浓度。之后，为了测试纳米复合物的抗菌 活性，将cu2o/bnn6@msn-dex纳米复合物添加到制备的细菌悬浮液中。然后将所有试管 在37℃、170rpm条件下振动2小时。激光照射10分钟后再次孵育3小时。随后，取出待测 细菌悬浮液，并用适当的稀释因子稀释细菌悬浮液的浓度。将60μl稀释细菌悬浮液涂在固 体琼脂平板上，并在37℃下放置12小时后计数菌落，细菌存活率由药物的菌落计数与空白 组的比率确定。
40.8.结直肠癌细胞和fn的共培养
41.取1ml胰蛋白酶将结直肠癌细胞ht29消化后得到单细胞悬液，以5000细胞/孔的密度 接种于96孔细胞培养板中，在培养18～20小时后，细胞汇合率达60％～70％；将生长状况良 好的fn，按照感染复数(moi)为50～200的比例悬浮于不含胎牛血清的mccoy’5a培养基， 得到细菌悬浮液；再将菌悬液以每孔0.1ml的体积加入到96孔板中，在co2、37℃的恒温 培养箱中培养2-3小时；随后，吸除菌悬液，每孔加入0.1ml的mccoy’5a完全培养基继续 培养。
42.9.细胞活力测定实验
43.ht29细胞接种在96孔板中并培养24小时。在上述细胞和细菌共培养的96孔板中，在 rimp1640完全培养基中加入不同浓度的cu2o/bnn6@msn-dex，在孵育四小时后使用808 nm(1.2w/cm-2
，10min)激光照射。孵育24小时后，将100μl的mtt染料溶液(磷酸盐 缓冲液ph 7.4中的5mg/ml)添加到每个孔中。2.5小时后，每孔加入100μl dmso。用酶 标仪在490nm波长处测量每个孔的吸光度，计算细胞存活率。
44.10.体内光声成像以及抗肿瘤实验
45.将5
×
106ht29细胞接种到4-6周龄的雄性balb/c裸鼠右腋下皮下组织中，构建结直肠 癌异种移植模型，待注射部位的肿瘤体积约为100mm3时，随机取一只小鼠尾静脉给药12 小时后，检测肿瘤部位的光声信号。将小鼠随机分为四组：a)pbs(fn)；b) cu2o/bnn6@msn-dex(fn)；c)cu2o/bnn6@msn-dex，通过尾静脉注射给药，注射12 小时后进行激光照射5分钟。使用以下公式估算肿瘤体积：(l
×
w2)/2，其中l和w分别为 肿瘤组织的长度和宽度。每周记录两次肿瘤体积，每三天记录一次小鼠体重。15天后，处死 所有小鼠，并收集小鼠肿瘤组织，检测肿瘤部位fn的富集量。
46.图2为msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex紫外吸收光谱图。该图说明：如 图1中
所示，相比于msn-nh2来说，msn-pba在255nm处有苯环的紫外吸收峰，证明了 苯硼酸化介孔硅的成功制备，在cu2o/bnn6@msn-dex的紫外谱图中，255nm处的苯环吸 收峰增强，同时在365nm处出现了吸收峰，证实了bnn6的成功负载，这些峰值的变化也表 明了cu2o/bnn6@msn-dex的成功合成。
47.图3为msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex的红外谱图。该图说明：为了进 一步证明cu2o/bnn6@msn-dex的成功合成，进行了红外表征。在msn红外谱图中，1088 cm-1
处的有一个较宽的si-o键吸收峰。与msn相比，msn-nh2在1636cm-1
和3200cm-1
处 有-nh2的振动峰，表明氨基已修饰到msn上，在msn-pba的谱图中，1646cm-1
处的“酰胺 i带”吸收峰和1440cm-1
处的“酰胺ii带”的振动吸收峰，证明了酰胺化键的存在，这些结果表 明msn，msn-nh2，msn-pba的成功合成。
48.图4为msn，msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex的粒径分布，粒径依次 为220
±
1.3nm、250
±
3.2nm、295
±
2.6nm、310
±
4.2nm，粒径发生变化，这表明纳米粒子的成 功制备。
49.图5为msn，msn-nh2，msn-pba，cu2o/bnn6@msn-dex的电势图。该图说明：电 势图可以看出，msn的电势为-27.9
±
0.24mv，氨基修饰后电势变为31.4
±
0.19mv，电荷发 生反转，苯硼酸修饰之后，电势降低变为12.2
±
0.32mv，葡聚糖包覆之后，电势变为-8.7
±
0.14 mv，一步证明葡聚糖的成功包覆和纳米粒子的成功制备。
50.图6为不同浓度的cu2o/bnn6@msn-dex纳米粒子在808nm激光照射后的温度变化， 随着浓度的升高，温度达到48℃，证实可以起到对肿瘤的治疗效果。
51.图7和图8是经过光热治疗后fn在血平板的细菌菌落分布，可以看出未经激光照射的菌 落数没有减少，而在808nm激光照射后细菌菌落数明显减少，200μg/ml时细菌完全被杀死， 证实该纳米粒子有显著的抗fn作用。
52.图9是ht29以及与fn共培养的生物相容性结果。可以看出cu2o/bnn6@msn-dex纳 米粒子对ht29细胞有明显的治疗效果，在加入fn共培养之后，不会对其光热效果产生影响， 进一步解决结直肠癌处的耐药性问题。
53.图10是小鼠肿瘤部位的光声信号图像，给药12小时后光声信号值明显升高。证实可以 利用光声成像系统来进行结肠癌的诊断。图11是小鼠的体重变化以及图12和图13是小鼠肿 瘤的体积变化，从中可以看出治疗组的小鼠体重没有降低，可以证明药物对小鼠的正常生长 不会产生影响，在经过光热治疗后小鼠的肿瘤得到消融，在第六天小鼠肿瘤已经消失，同时 在第三组数据变化中可以看出光热的效果不会受到耐药性的影响。
54.需要说明的是，以上所述实施方式仅为本发明优选实施例，仅仅用于对本发明做进一步 说明，并非因此限制本发明保护范围。对属于本发明技术构思而仅仅显而易见的改动，同样 在本发明保护范围之内。

技术特征：
1.一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法，其特征是所述纳米粒子为以介孔硅载体，负载氧化亚铜和bnn6，利用葡聚糖包覆的纳米粒子，制备步骤如下：1)介孔硅用3-氨基丙基三甲氧基硅烷进行氨基化，进一步通过与苯硼酸羧基的酰胺化反应，得到苯硼酸修饰的介孔硅(msn-pba)。2)将msn-pba分散在n-n二甲基甲酰胺中，然后加入氧化亚铜和bnn6，搅拌24小时后，离心。在磷酸盐缓冲溶液中(ph＝7.4)和葡聚糖混匀震荡30秒，获得负载氧化亚铜和bnn6的介孔硅体系(cu2o/bnn6@msn-dex)。2.根据权利要求1所述的一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法，其特征是：所述介孔硅是经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷进行氨基化，进一步通过酰胺化反应制备的苯硼酸化的介孔硅。3.根据权利要求1所述的一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法，其特征是：所述介孔硅负载氧化亚铜和bnn6的比例：3∶3∶1。4.根据权利要求1所述的一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法，其特征是：所述氨基化介孔硅是以甲醇作为溶剂，80℃回流4小时制备。

技术总结
本发明公开了一种将抗菌和抗肿瘤结合实现结肠癌的诊疗一体化纳米粒子的制备方法，属于药物载体材料领域。通过硫化氢激活后产生光热和光声成像效应的氧化亚铜以及一氧化氮供体BNN6负载于介孔硅中，葡聚糖通过硼酸酯键与介孔硅表面的苯硼酸结合，得到纳米粒子，本发明简便易行、成本低廉，可广泛应用于材料学、生物学、医学等领域，不仅可以通过光声成像来进行结肠癌的诊断，而且光热疗法和NO气体疗法相结合进一步增强治疗效果。结合进一步增强治疗效果。


技术研发人员：高辉 辛友涛 马艳梅
受保护的技术使用者：天津理工大学
技术研发日：2021.10.15
技术公布日：2022/3/8