一株高产纤维素酶细菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及一株高产纤维素酶细菌及其应用。


背景技术：

2.随着工业化的进程，化石能源日益短缺已经成为了一个全球性问题，寻找新的绿色可再生能源是我们必须面临的新的问题和方向。其中，开发和利用生物质资源是近些年来的研究热点。秸秆作为一类比较重要的可再生生物质资源，其最主要成分是纤维素，纤维素是地球上储量最丰富的且可再生的有机分子。因此，基于农业生产和环境保护之间的矛盾，研究秸秆的降解和利用显得尤为重要，而研究纤维素的降解机理是解决秸秆问题的一大重要因素。
3.纤维素分子是构成纤维素的基本单位，纤维素分子呈丝状，这些分子以氢键的形式连接成纤维素胶束，物理化学性质比较稳定。纤维素经过自然水解的产物是纤维二塘，其最终水解产物是葡萄糖。此外，在大多数植物细胞中，纤维素被半纤维素和木质素包埋在内形成网状结构，在纤维素束周围，聚集有木质素形成保护层，使之难以被水解。
4.纤维素的降解主要是通过纤维素酶的作用，降解纤维素的主要目的是将其转化为简单的小分子供生物重新利用。常规降解纤维素的方法主要有：酸降解、碱降解、热降解、氧化降解等。但是酸、碱和水解液中都含有较多的有毒物质，在降解纤维素的同时或多或少会对环境带来一定的影响。与传统方法相比，微生物降解具有条件温和、成本低、绿色无污染等优点。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3在制备纤维素酶或降解纤维素中的应用。本发明最后所要解决的技术问题在于提供所述高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3制备的菌剂或纤维素酶。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一株高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2021680，保藏日期为2021年6月7日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
8.所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3在降解纤维素中的应用。
9.所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3在产纤维素酶中的应用。
10.进一步地，所述的纤维素酶是内切β-1，4葡聚糖酶、外切β-1，4葡聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶。
11.含有所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的菌剂。
12.进一步地，所述的菌剂是含有高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的发酵液。
13.进一步地，将所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3接种在液体培养基
中发酵培养，即得所述的菌剂。
14.进一步地，，所述的液体培养基，包含组分：羧甲基纤维素钠、蛋白胨、酵母浸出粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁。
15.所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3发酵生产得到的纤维素酶。
16.所述的纤维素酶在降解纤维素中的应用。
17.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
18.本发明提供的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3是在江苏东台黄海森林公园土壤表层腐殖质中分离得到的，在30℃左右具有较强的产纤维素酶能力，所产的内切β-1，4葡聚糖酶、外切β-1，4葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性均比较高，为处理纤维素提供了一种有效的手段，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
19.图1为细菌cl-3的分离、筛选和鉴定流程图；
20.图2为细菌cl-3的菌落形态图(30℃，3天)；
21.图3为使用邻接方法构建的16s rdna系统发育树图；
22.图4为cl-3刚果红羧甲基纤维素钠平板水解效果示意图；
23.图5为cl-3产纤维素酶测定结果图。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
25.实施例中所用的培养基：
26.r2a培养基，按照浓度包含以下组分：酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g、琼脂粉15g，加入1000ml蒸馏水调至液体ph7.0～7.2，培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min备用。
27.cmc-na固体培养基组成按照浓度包括：羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨3g、酵母浸出粉0.2g、硫酸铵2g、磷酸二氢钾4g、七水硫酸镁0.3g、琼脂粉15g，加入1000ml蒸馏水调至液体ph7.0～7.2，培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min备用。
28.cmc-na液体培养基：羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨3g、酵母浸出粉0.2g、硫酸铵2g、磷酸二氢钾4g、七水硫酸镁0.3g，加入1000ml蒸馏水调至液体ph7.0～7.2，培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min备用。
29.实施例1：
30.图1示出了本发明纤维素降解细菌cl-3的制备流程图。本发明实施例提供的纤维素降解菌cl-3的制备步骤为：采集江苏东台黄海森林公园土壤表层腐殖质放入装有无菌水的离心管中充分震荡混匀
31.采取梯度稀释法，将配制好的土壤原液稀释至10-6
。随后将稀释好的土壤稀释液吸
取部分到cmc-na培养基平板上进行涂布处理，涂布均匀后放到30℃培养箱中培养，2-3天后待平板上长出明显菌落后进行刚果红染色，挑选其中透明圈最大的菌株进行分离纯化培养、保藏，该菌株经鉴定为xanthomonas sp.，命名为cl-3。
32.1、生态学鉴定
33.将本发明实施例提供的菌株cl-3接种到r2a固体培养基上，然后将平板倒置，在温度为30℃的条件下培养2-3天，观察并记录平板上菌落的生长情况。本发明实施例提供的菌株cl-3的菌落表型如图2所示。图2能够看出菌落均呈现黄色、圆形、凸起、不透明，细菌细胞表面光滑，形状呈杆状，无运动性，经革兰氏染色结果显示为革兰氏阴性。菌株cl-3在4-42℃条件下都能生长，其中在4℃和42℃条件下长势较弱，最适生长温度为15-30℃。最适生长ph为6-7，在ph＝5和ph＝8条件下均不能生长。在添加了1％-4％nacl条件下，菌株都能正常生长，不过在5％nacl条件下长势较弱。同时，还检测了菌株cl-3在不同培养基上的生长情况，可以在tsa培养基(大豆酪蛋白琼脂培养基)、na培养基(营养琼脂培养基)、lb培养基上正常生长，可以利用不同的营养成分。菌株cl-3对氧化酶作用呈阴性，对过氧化氢酶作用呈弱阳性反应。
34.2、16s序列分析
35.本发明实施例采用传统方法提取本菌株中的dna。其中，30μl的pcr反应体系包括1μl模板引物、1μl模板dna、15μltaq酶预混液、12μl无菌水。反应条件为：在温度为94℃预变性7min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1.5min，35个循环，4℃保存。
36.pcr产物由擎科有限公司测序，测序结果如附表中的核苷酸序列所示(seq id no.1)。将所得序列在genbank中进行blast相似性比对，得到与该菌株相似性较高的相关序列，运用mega7.0软件构建菌株的系统发育树，本菌株的发育树图请见图3。综合上述生态学观察及16s序列分析结果，能够确定本菌株cl-3为xanthomonas的成员，其被命名为cl-3。该菌株已于2021年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学；邮政编码：430072)，分离命名：cl-3)，保藏编号为cctcc m 2021680。
37.实施例2：cl-3降解纤维素能力测定
38.本发明实施例提供了纤维素降解菌株cl-3在刚果红羧甲基纤维素钠平板上水解的效果示意图，如图4所示。从图4中能够看出30℃下，接种有cl-3的cmc-na平板2天后刚果红染色出现了明显的透明圈，测得透明圈直径/菌落直径的值为12。因此，根据生长菌落大小、速度和透明圈大小可以看出其生产纤维素酶的效率比较高。
39.实施例3：cl-3的产纤维素酶能力测定
40.本发明实施例对cl-3进行了产纤维素酶能力测定，该测定包括以下内容：
41.1、粗酶液的制备
42.将本发明实施例1提供的cl-3菌株接种到cmc-na液体培养基中，于30℃，150r/min下培养3d，离心过滤菌体取上清液，即为粗酶液。
43.2、葡萄糖标准曲线的制作
44.取0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml(每管差0.2ml)的1mg/ml的葡萄糖标准液分别于刻度试管中，加蒸馏水补足至1ml，再加入dns试剂2ml，ph＝10的硼砂-氢氧化钠缓冲液2ml混匀，沸水浴30min。取出后待冷却至室温，用分光光度计测量od
530
。以光密度值为横坐标，葡萄糖含量(mg)为纵坐标，作葡萄糖标准曲线。
45.3、酶活的测定
46.(1)内切β-1，4葡聚糖酶活力的测定
47.将羧甲基纤维素钠加入到ph＝4.5的柠檬酸钠缓冲液中配制出1％的底物溶液，取底物溶液2ml加入1ml上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，从中取1ml反应液，再加入2ml dns试剂、2mlph＝10的硼砂-氢氧化钠缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在波长530nm下测定其od值。空白组不进行50℃水浴，先加dns以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。
48.(2)外切β-1，4葡聚糖酶活力的测定
49.将微晶纤维素加入到ph＝4.5的柠檬酸钠缓冲液中配制出1％的底物溶液，取底物溶液2ml加入1ml上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，从中取1ml反应液，再加入2ml dns试剂、2mlph＝10的硼砂-氢氧化钠缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在波长530nm下测定其od值。空白组不进行50℃水浴，先加dns以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。
50.(3)β-葡萄糖苷酶活力的测定
51.将水杨素加入到ph＝4.5的柠檬酸缓冲液中配制出1％的底物溶液，取底物溶液2ml加入1ml上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，从中取1ml反应液，再加入2ml dns试剂、2ml ph＝10的硼砂-氢氧化钠缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在波长530nm下测定其od值。空白组不进行50℃水浴，先加dns以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。
52.(4)滤纸酶活测定
53.取1g滤纸剪碎加入到2ml ph＝4.5的柠檬酸缓冲液中，再加入1ml上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，从中取1ml反应液，再加入2ml dns试剂、2mlph＝10的硼砂-氢氧化钠缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在波长530nm下测定其od值。空白组不进行50℃水浴，先加dns以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。
54.本发明提供了降解纤维素菌株cl-3的产纤维素酶测定结果图，包括内切β-1，4葡聚糖酶、外切β-1，4葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活。结果参考如图5所示。
55.从图5中能够看出在30℃条件下，菌株cl-3具有较强的产酶能力，且在发酵培养3天后，内切β-1，4葡聚糖酶、外切β-1，4葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶均具有较高的酶活力，分别为0.3133u/ml、0.1104u/ml、0.0278u/ml和0.0183u/ml，具有良好的工业化应用前景。
56.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2021680，保藏日期为2021年6月7日，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.权利要求1所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3在降解纤维素中的应用。3.权利要求1所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3在产纤维素酶中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的纤维素酶包括内切β-1，4葡聚糖酶、外切β-1，4葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。5.含有权利要求1所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的菌剂。6.根据权利要求5所述含有高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的菌剂，其特征在于，所述的菌剂是含有高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的发酵液。7.根据权利要求6所述含有高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的菌剂，其特征在于，将所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3接种在液体培养基中发酵培养，即得所述的菌剂。8.根据权利要求7所述含有高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3的菌剂，其特征在于，所述的液体培养基，包含组分：羧甲基纤维素钠、蛋白胨、酵母浸出粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁。9.由权利要求1所述的高产纤维素酶细菌xanthomonas sp.cl-3发酵生产得到的纤维素酶。10.权利要求9所述的纤维素酶在降解纤维素中的应用。

技术总结
本发明公开了一株高产纤维素酶细菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的高产纤维素酶细菌Xanthomonas sp.CL-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021680，保藏日期为2021年6月7日，保藏地址为中国武汉武汉大学。高产纤维素酶细菌Xanthomonas sp.CL-3在30℃下具有较强的产纤维素酶的能力，产生的纤维素酶包括内切β-1，4葡聚糖酶、外切β-1，4葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。其中，本发明提供的新菌产生的内切β-1，4葡聚糖酶明显高于外切β-1，4葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，因而具有良好的应用前景。因而具有良好的应用前景。因而具有良好的应用前景。


技术研发人员：金龙 卓也 崔成妲
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/3/8