用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗的制作方法

用于预防sars-cov-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及用于预防sars-cov-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗。


背景技术：

2.面对新冠肺炎疫情，做好预防，阻断病毒的传播是控制疫情的关键。疫苗是预防和控制新型冠状病毒感染最经济有效的干预措施。sars-cov-2冠状病毒的病毒颗粒结构中，组成“皇冠”的s-蛋白是一个明显的靶点，成为大多数研究团队研究的重点。已有研究团队通过对s蛋白三维结构计算机模拟，成功地揭示了s蛋白与其侵入细胞过程中的受体ace2的关系。因此，s蛋白在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。根据研究报道，s蛋白存在融合前构象和融合后构象， s蛋白与宿主细胞的aceii受体结合，通过宿主细胞的弗林蛋白酶进行切割，使蛋白分为s1和s2，促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合实现病毒的感染入侵，融合后产生的抗体多为结合抗体，没有中和作用，所以在疫苗研发设计中如何维持s蛋白保持融合前构象是疫苗研发成功的关键。
3.根据世界卫生组织报告，有一最新突变株（奥密克戎株），其致病力和传播力均大大的增强。并且奥密克戎突变株其s基因发生至少27个突变之多，现有的疫苗对奥密克戎突变株免疫保护效果极差，极易逃逸现有疫苗中和抗体的中和作用，极大的削弱了目前疫苗的免疫保护作用，有取代delta突变株的趋势。目前上市疫苗为灭活疫苗、亚单位蛋白疫苗、mrna疫苗和腺病毒载体疫苗，这些疫苗主要针对的是原始株sars-cov-2，其对奥密克戎突变株的保护效果均有下降，都不能做到免疫后对奥密克戎株产生十分理想的免疫效果。此外，天然的sars-cov-2的刺突蛋白s基因在人肾细胞hek293表达水平很低，因此如果以sars-cov-2奥密克戎株原始的s密码子来表达为抗原，其sars-cov-2奥密克戎株原始的s基因序列蛋白不能有效在细胞内高效表达，其疫苗可能无效或效价很低，不足以抵抗病毒的感染。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种优化的s蛋白核苷酸序列及其新型疫苗，采用载体携带密码子优化的奥密克戎株（omicron）的s基因，免疫机体后可高效表达s抗原，产生针对奥密克戎株sars-cov-2的中和抗体，可以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染。
5.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供一种疫苗，所述疫苗包括：ａ）seq id no：2所示核酸序列；或ｂ）与seq id no：2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同源性的核酸序列。
6.在一些实例中，所述疫苗用于预防或治疗sars-cov-2引发的感染。在一些实例中，所述疫苗用于预防或治疗sars-cov-2奥密克戎突变株引发的感染。在一些实例中，所述疫
苗用于预防或治疗sars-cov-2原始株、sars-cov-2 delta突变株、sars-cov-2 alpha突变株、sars-cov-2 beta突变株、sars-cov-2 gamma突变株中一种或多种引发的感染。
7.在一些实例中，所述核酸序列用于表达对sars-cov-2引起免疫原性的蛋白。在一些实例中，所述核酸序列用于表达对sars-cov-2奥密克戎突变株引起免疫原性的蛋白。在一些实例中，所述核酸序列用于表达对sars-cov-2原始株、sars-cov-2 delta突变株、sars-cov-2 alpha突变株、sars-cov-2 beta突变株、sars-cov-2 gamma突变株中一种或多种引起免疫原性的蛋白。
8.在一些实例中，所述核酸序列用于在人体内或人源细胞内表达蛋白。
9.在一些实例中，所述蛋白可在人体内：诱导免疫应答；和／或产生生物报告分子；和／或产生用于检测的分子；和／或调节基因功能；和／或成为治疗性分子。
10.所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答。
11.在一些实例中，所述疫苗的载体为dna质粒、rna表达质粒或病毒载体。
12.在一些实例中，所述疫苗为腺病毒载体疫苗。在一些实例中，所述疫苗包括负载有seq id no：2所示核酸序列或其同源序列的腺病毒载体。在一些实例中，所述腺病毒载体为ad1载体、ad2载体、ad3载体、ad4载体、ad5载体、ad6载体、ad7载体、ad8载体、ad9载体、ad10载体、ad11载体、ad12载体、ad13载体、ad14载体、ad15载体、ad16载体、ad17载体、ad18载体、ad19载体、ad20载体、ad21载体、ad22载体、ad23载体、ad24载体、ad25载体、ad26载体、ad27载体、ad28载体、ad29载体、ad30载体、ad31载体、ad32载体、ad33载体、ad34载体、ad35载体、ad36载体、ad37载体、ad38载体、ad39载体、ad40载体、ad41载体、ad42载体、ad43载体、ad44载体、ad45载体、ad46载体、ad47载体、ad48载体、ad49载体、ad50载体、ad51载体、或ad52载体中的至少一种。在一些实例中，所述载体为空载体。在一些实例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型载体。在一些实例中，所述复制缺陷型载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型腺病毒载体。在一些实例中，所述疫苗包括负载有seq id no：2所示核酸序列或其同源序列的ad5载体。在一些实例中，所述载体为ad5空载体。在一些实例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型ad5载体。在一些实例中，所述复制缺陷型ad5载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad5载体。在一些实例中，所述疫苗包括负载有seq id no：2所示核酸序列或其同源序列的ad35载体。在一些实例中，所述载体为ad35空载体。在一些实例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型ad35载体。在一些实例中，所述复制缺陷型ad35载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad35载体。
13.在一些实例中，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。可以根据具体的需要选择适合的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
14.在一些实例中，所述腺病毒载体疫苗的剂型包括但不限于口服剂、注射剂、气雾吸入剂等常见的疫苗剂型。
15.在一些实例中，所述腺病毒载体疫苗还可以和其他药物联用。在一些实例中，所述疫苗还包括至少一种对covid-19有预防和／或治疗作用的药物。
16.为进一步提高产品的纯度和安全性，在一些实例中，所述载体（如ad5载体、ad35载体等腺病毒载体）可以调控所述核酸序列的表达。
17.为保证seq id no：2所示核酸序列或其同源序列更为高效的表达，在一些实例中，seq id no：2所示核酸序列或其同源序列的转录方向与所述载体（如ad5载体、ad35载体等腺病毒载体）其它基因的转录方向相反。
18.本发明的第二个方面，提供一种表达载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸序列（seq id no：2所示核酸序列或其同源序列）。
19.在一些实例中，所述载体可以调控本发明第一方面所述核酸序列的表达。在一些实例中，本发明第一方面所述的核酸序列转录方向与所述载体其他基因的转录方向相反。可以进一步保证表达所得到的蛋白具有更高的纯度和安全性。
20.在一些实例中，所述载体为dna质粒、rna表达质粒或病毒载体。
21.在一些实例中，所述的病毒载体为腺病毒载体。在一些实例中，所述腺病毒载体为前述ad1-ad52载体中的至少一种。在一些实例中，所述载体为空载体。在一些实例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。在一些实例中，所述复制缺陷型腺病毒载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型腺病毒载体。在一些实例中，所述腺病毒载体为ad5载体。在一些实例中，所述载体为ad5空载体。在一些实例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型ad5载体。在一些实例中，所述复制缺陷型ad5载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad5载体。在一些实例中，所述腺病毒载体为ad35载体。在一些实例中，所述载体为ad35空载体。在一些实例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型ad35载体。在一些实例中，所述复制缺陷型ad35载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad35载体。
22.本发明的第三个方面，提供：本发明第一方面所述的疫苗或本发明第二方面所述表达载体的应用，所述应用包括：制备预防或治疗sars-cov-2引发的感染的药物。
23.制备covid-19检测试剂；或制备基因功能调节剂。
24.在一些实例中，所述感染是sars-cov-2奥密克戎突变株引发的感染。
25.在一些实例中，所述感染是sars-cov-2原始株、sars-cov-2 delta突变株、sars-cov-2 alpha突变株、sars-cov-2 beta突变株、sars-cov-2 gamma突变株中一种或多种引发的感染。
26.本发明的第四个方面，提供，一种预防或治疗sars-cov-2株引发的感染的方法，包括给予有需要的受试者预防有效量或治疗有效量的本发明第一方面所述疫苗。
27.在一些实例中，所述感染是sars-cov-2奥密克戎突变株引发的感染。
28.在一些实例中，所述感染是sars-cov-2原始株、sars-cov-2 delta突变株、sars-cov-2 alpha突变株、sars-cov-2 beta突变株、sars-cov-2 gamma突变株中一种或多种引发的感染。
29.根据本发明的前述方面，在一些实例中，本发明所述sars-cov-2原始株的刺突蛋白（spike protein，s）的氨基酸序列如ncbi登录号yp_009724390.1所示。在一些实例中，本发明所述sars-cov-2原始株的全基因组序列如ncbi登录号nc_045512.2所示。
30.本发明的有益效果是：
1）sars-cov-2奥密克戎株原始的s基因序列蛋白不能有效在细胞内高效表达，我们采用密码子偏好性进行优化得到新的s基因序列，其能高效在人源细胞内高效表达，免疫机体后可高效表达s抗原。
31.2）优化的序列在人体或人源性细胞内表达后，可诱导产生较高滴度的针对奥密克戎株sars-cov-2的中和抗体，可以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染；还可诱导针对sars-cov-2原始株以及其他类型突变株的特异性抗体，发挥多重保护作用。
附图说明
32.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本技术要求保护的范围。
33.图1是分别转染等量的pga1-s-ori、pga1-s50，pga261-s50和pga351-s50后 s 蛋白的表达结果。
34.图2是pad5-s50构建的流程图。
35.图3是pad5-s50的病毒纯化图。
36.图4是pad35-s50构建的流程图。
37.图5是pad35-s50的病毒纯化图。
38.图6是pad5-s50和ad35-s50侵染a549细胞后s蛋白的表达图。1为a549细胞的空白对照，2为ad35-s50样品，3为ad5-s50样品，4为s蛋白阳性对照，m为marker。
39.图7是ad5-s50免疫小鼠针对新冠病毒omicron株的血清结合抗体水平。
40.图8是ad5-s50免疫小鼠针对新冠病毒原始株的血清结合抗体水平。
41.图9是ad5-s50免疫小鼠针对新冠病毒delta株的血清结合抗体水平。
42.图10是ad5-s50免疫小鼠的血清中和抗体水平。
43.图11是ad35-s50免疫小鼠针对新冠病毒omicron株的血清结合抗体水平。
44.图12是ad35-s50免疫小鼠针对新冠病毒原始株的血清结合抗体水平。
45.图13是ad35-s50免疫小鼠针对新冠病毒delta株的血清结合抗体水平。
46.图14是ad35-s50免疫小鼠的血清中和抗体水平。
具体实施方式
47.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
48.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
49.sars-cov-2的刺突蛋白（spike protein，s）的核酸序列如gisaid：epi_isl_6640916所示, 命名为seq id no：1。真核细胞转录的mrna前体能够通过不同剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mrna剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产
生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了蛋白表达的唯一性，减少了蛋白表达错误剪切的发生。优化得到的核酸序列记为seq id no：2（下文载体命名为s50）。
50.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
51.实施例1 spike基因密码子优化效果分析1、构建奥密克戎突变株的s基因的穿梭质粒pga1-s50以pcdna3.1-s50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，s50即为seq id no：2）质粒为模板，以s50-f和s50-r为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段s50。
52.s50扩增引物序列：s50-f：gtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgttcctggtcctactgcc（seq id no：3）；s50-r：agaatagggccctctagactagtttatcaggtgtagtgcagcttt（seq id no：4）。
53.pcr程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
54.以pga1-egfp质粒（由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以cmv-r和bgh-f为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段pga1。
55.pga1骨架扩增引物序列：cmv-r：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（seq id no：5）；bgh-f：tctagagggccctattctatagtgtc（seq id no：6）。pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
56.将目的片段s50和载体骨架pga1采用同源重组酶（vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株s基因的穿梭质粒pga1-s50。
57.2、构建奥密克戎突变株的s基因的穿梭质粒pga261-s50以pcdna3.1-s50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，s50即为seq id no：2）质粒为模板，以s50-f（seq id no：3）和s50-r（seq id no：4）为引物，采用primer star mix（takara） pcr扩增得到目的片段s50。
58.pcr程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
59.以pga261-egfp质粒（由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以cmv-r（seq id no：5）和bgh-f（seq id no：6）为引物，采用primer star mix（takara） pcr扩增得到目的片段pga261。
60.pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
61.将目的片段s50和载体骨架pga261采用同源重组酶（vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株s基因的穿梭质粒pga261-s50。
62.3、构建奥密克戎突变株的s基因的穿梭质粒pga351-s50
以pcdna3.1-s50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，s50即为seq id no：2）质粒为模板，以s50-f（seq id no：3）和s50-r（seq id no：4）为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段s50。
63.pcr程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
64.以pga351-egfp质粒（携带ad35e1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以cmv-r（seq id no：5）和bgh-f（seq id no：6）为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段pga351。
65.pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
66.将目的片段s50和载体骨架pga351采用同源重组酶（vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株s基因的穿梭质粒pga351-s50。
67.4、构建奥密克戎突变株的原始s基因的穿梭质粒pga1-s-ori以pcdna3.1-s-ori（购自南京金斯瑞生物科技有限公司，负载s-ori，即seq id no：1）质粒为模板，以sori-f和sori-r为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段s-ori。
68.s-ori扩增引物序列：sori-f：gtaccgagctcggatccgccaccatgtttgtttttcttgttttattgccact（seq id no：7）；sori-r：tagaatagggccctctagactagtttattatgtgtaatgtaatttgactcctt（seq id no：8）。
69.pcr程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
70.以pga1-egfp质粒（由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以cmv-r（seq id no：5）和bgh-f（seq id no：6）为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段pga1。
71.pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
72.将目的片段s-ori和载体骨架pga1采用同源重组酶（vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株原始s基因的穿梭质粒pga1-s-ori。
[0073] 5、spike基因密码子优化效果分析按照常规方法，利用阳离子脂质体，分别2.5g的实施例1步骤1-4制备得到的pga1-s-ori、pga1-s50，pga261-s50和pga351-s50转染法转染hek293细胞，转染48小时后，收集细胞，按照常规的westernblot方法处理样品，并进行蛋白检测。参见图1可以看出，pga1-s-ori 样品中没有检测到s蛋白的表达，而经过密码子优化的pga1-s50，pga261-s50和pga351-s50样品中均能够观察到高效的s蛋白的表达，说明我们优化的s50序列具有意料之外的效果。
[0074]
实施例2携带奥密克戎突变株的s抗原载体pad5-s50构建1、构建奥密克戎突变株的s基因的穿梭质粒pga1-s50
以pcdna3.1-s50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，s50即为seq id no：2）质粒为模板，以s50-f（seq id no：3）和s50-r（seq id no：4）为引物，采用primer star mix （takara）pcr扩增得到目的片段s50。
[0075]
pcr程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
[0076]
以pga1-egfp质粒（携带ad5e1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以cmv-r（seq id no：5）和bgh-f（seq id no：6）为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段pga1。
[0077]
pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
[0078]
将目的片段s50和载体骨架pga1采用同源重组酶（vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株s基因的穿梭质粒pga1-s50。
[0079]
2、构建携带奥密克戎突变株的s基因的pad5-s50以pga1-s50质粒为模板，pcr扩增得到携带同源重组臂的cmv-s50-bgh目的片段，胶回收。
[0080]
cmv-s50-bgh目的片段扩增引物序列：ad5-sb-f：ttggattgaagccaatatgataatgagggggtgg（seq id no：9）；ad5-sb-r：gcatcggtcgaggacaggcctctcaagtctgtatac（seq id no：10）。pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 50 s， 28个循环；72℃ 5min，采用胶回收试剂盒回收目的片段，4℃保存。
[0081]
pad5δe1δe3以clai线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的cmv-s50-bgh目的片段和线性化的pad5δe1δe3共转化bj5183，同源重组得到携带s50基因的pad5-s50质粒，技术流程如图2所示。
[0082]
3、ad5-s50载体的拯救与生产1）按照常规方法，ad5-s50以paci线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞；2）转染后4小时，加入2毫升含5%胎牛血清的dmem培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；3）出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；4）2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；5）2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；6）上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；7）上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；8）以od260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度=od260
×
稀释倍数
×
36/基因组长度（kb）；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化如图3所示。
[0083]
实施例3携带奥密克戎突变株的s抗原载体pad35-s50构建1、构建奥密克戎突变株的s基因的穿梭质粒pga351-s50以pcdna3.1-s50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，s50即为seq id no：2）质粒为模板，以s50-f（seq id no：3）和s50-r（seq id no：4）为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段s50。
[0084]
pcr程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4
℃保存。
[0085]
以pga351-egfp质粒（携带ad35e1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以cmv-r（seq id no：5）和bgh-f（seq id no：6）为引物，采用primer star mix（takara）pcr扩增得到目的片段pga351。
[0086]
pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
[0087]
将目的片段s50和载体骨架pga351采用同源重组酶（vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株s基因的穿梭质粒pga351-s50。
[0088]
2、构建携带奥密克戎突变株突变株的s基因的pad35-s50以pga351-s50质粒为模板，pcr扩增得到携带同源重组臂的cmv-s50-bgh目的片段，胶回收。
[0089]
cmv-s50-bgh目的片段扩增引物序列：ad35-sb-f：agaattggatccgaattcgcggccgcgcgatcgccatcatcaataatatacctt（seq id no：11）；ad35-sb-r：gcgtcgcagatccgaattcgtatacccatccaagctgcacgataa（seq id no：12）。pcr程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 50 s， 28个循环；72℃ 5min，采用胶回收试剂盒回收目的片段，4℃保存。
[0090]
pad35δe1δe3以pmei线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的cmv-s50-bgh目的片段和线性化的pad35δe1δe3（5e4）共转化bj5183，同源重组得到携带s50基因的pad35-s50质粒，技术流程如图4所示。
[0091]
3、ad35-s50载体的拯救与生产1）按照常规方法，ad35-s50以asisi线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞；2）转染后4小时，加入2毫升含5%胎牛血清的dmem培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；3）出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；4）2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；5）2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；6）上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；7）上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；8）以od260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度=od260
×
稀释倍数
×
36／基因组长度（kb）；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化结果如图5所示。
[0092]
实施例4 检测spike基因表达用ad5-s50和ad35-s50病毒侵染a549细胞，24h后收集细胞。按照常规的westernblot方法处理样品，并进行蛋白检测，结果如图6所示。可以看出疫苗候选株ad5-s50和ad35-s50样品中能够观察到奥密克戎突变株s蛋白的表达，说明ad5-s50和ad35-s50疫苗候选株构建正确，可以成功表达s抗原蛋白抗原蛋白。
[0093]
实施例5 ad5-s50动物免疫原性评价6-8周龄balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）分为2组，每组10只；第0天，疫苗组（即样品组）肌注免疫实施例2制备的ad5-s50剂量：5
×
109vp/只，对照组
（即阴性组）肌注免疫ad5-empty剂量：5
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109vp/只；第9天，眼眶取血并分离血清。
[0094]
1、结合抗体采用酶联免疫吸附测定（elisa），以新冠病毒的奥密克戎突变株、原始株、delta突变株的rbd蛋白（购自北京义翘神州科技有限公司）为抗原检测血清中的抗体水平。
[0095]
具体操作为：1）96孔板，每孔加50ng的rbd蛋白，4℃过夜；2）吸掉上清，采用pbst洗3次，每孔加入200μl 5%bsa室温封闭2h；3）pbst洗3次；每孔加入采用pbs以1:400，和1:800，和1:1600，和1:3200，和1:6400，和1:12800，和1:25600，和1:51200稀释的小鼠血清，37℃孵育2h；4）加酶标抗体：加入100μl稀释后 hrp标记igg二抗，37℃孵育2h；5）pbst洗6-8次；6）加底物液显色：加入100μl tmb显色；7）终止反应：加入50μl 1m硫酸终止反应；8）结果判定：测od值，od值控制在0.1-4；9）实验结果如图7、图8和图9所示，图7显示ad5-s50能够诱异小鼠产生针对奥密克戎突变株rbd蛋白的特异性结合抗体；此外图8和图9显示ad5-s50同样可以产生针对原始株rbd蛋白和delta突变株rbd蛋白的的特异性结合抗体。
[0096]
2、中和抗体假病毒中和抗体的测定具体操作为：1）将待检测的血清于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min；将血清进行30倍梯度稀释；2）用dmem无血清培养基将奥密克戎假病毒（购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：dd1768-02）稀释至1.3
×
104tcid50/ml与上述稀释的血清充分混匀，置于细胞培养箱中（37℃，5%co2）孵育1小时；3）将孵育后的血清加入96孔板的aceii细胞中，放入细胞培养箱中，37 ℃，5% co2培养72小时；4）培养72小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃100μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min；5）计算中和抑制率：抑制率＝［1－（样品组的发光强度均值－空白对照发光强度均值）/（阴性组的发光强度均值－空白对照值发光强度均值）］
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100％；空白对照指的是96孔细胞背景值；阴性组指的是ad5-empty免疫组；6）根据中和抑制率结果，利用reed-muench法计算ic50。
[0097]
结果如图10所示：该疫苗可以刺激小鼠机体产生较高滴度的针对奥密克戎株新冠病毒的特异性中和抗体。
[0098]
实施例6 ad35-s50动物免疫原性评价6-8周龄balb/c小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）分为2组，每组10只；第0天，疫苗组（即样品组）肌注免疫实施例3制备ad35-s50剂量：5
×
109vp/只，对照组（即阴性组）肌注免疫ad35-empty剂量：5
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109vp/只；第14天，眼眶取血并分离血清。
[0099]
1、结合抗体
采用酶联免疫吸附测定（elisa），分别以新冠病毒奥密克戎突变株、原始株、delta突变株的rbd蛋白（购自北京义翘神州科技有限公司）为抗原检测血清中的抗体水平。
[0100]
elisa结合抗体测定的具体操作为：1）96孔板，每孔加50ng的rbd蛋白，4℃过夜；2）吸掉上清，采用pbst洗3次，每孔加入200μl 5%bsa室温封闭2h；3）pbst洗3次；每孔加入采用pbs以1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600和，1:51200稀释的小鼠血清，37℃孵育2h；4）加酶标抗体：加入100μl稀释后 hrp标记igg二抗，37℃孵育2h；5）pbst洗6-8次；6）加底物液显色：加入100μl tmb显色；7）终止反应：加入50μl 1m硫酸终止反应；8）结果判定：测od值，od值控制在0.1-4；9）实验结果如图11、图12和图13所示，图11显示ad35-s50能够诱异小鼠产生针对奥密克戎突变株rbd蛋白的特异性结合抗体。图12和图13显示ad35-s50同样可以产生针对原始株rbd蛋白和delta突变株rbd蛋白的特异性结合抗体。
[0101]
2、中和抗体假病毒中和抗体的测定具体操作为：1）将待检测的血清于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min；将血清进行30倍梯度稀释；2）用dmem无血清培养基将奥密克戎假病毒（购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：dd1768-02）稀释至1.3
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104tcid50/ml与上述稀释的血清充分混匀，置于细胞培养箱中（37℃，5%co2）孵育1小时；3）将孵育后的血清加入96孔板的aceii细胞中，放入细胞培养箱中，37 ℃，5% co2培养72小时；4）培养72小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃100μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min；5）计算中和抑制率：抑制率＝［1－（样品组的发光强度均值－空白对照发光强度均值）/（阴性组的发光强度均值－空白对照值发光强度均值）］
×
100％；空白对照指的是96孔细胞背景值；阴性组指的是ad35-empty免疫组；6）根据中和抑制率结果，利用reed-muench法计算ic50。
[0102]
结果如图14所示：该疫苗可以刺激小鼠机体产生较高滴度的针对奥密克戎株新冠病毒的特异性中和抗体。
[0103]
以上对本技术实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本技术的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本技术的思想，基于本技术的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本技术保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。

技术特征：
1.一种疫苗，所述疫苗包括：seq id no：2所示核酸序列。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的核酸序列可在人源细胞或人体内表达蛋白；所述的蛋白可在人体内：诱导免疫应答；和／或产生生物报告分子；和／或产生用于检测的分子；和／或调节基因功能；和／或成为治疗性分子。3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的疫苗为腺病毒载体疫苗。4.根据权利要求3所述的疫苗，所述的疫苗包括负载有权利要求1或2所述的核酸序列的ad5载体，或负载有权利要求1或2所述的核酸序列的ad35载体。5.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗，其特征在于：还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。6.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗，其特征在于：还包括至少一种对covid-19有预防和／或治疗作用的药物。7.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1或2所述的核酸序列。8.根据权利要求 7所述的表达载体，其特征在于：所述的载体为dna质粒、rna表达质粒或病毒载体。9.根据权利要求7或8所述的表达载体，其特征在于：所述的载体可以调控所述的核酸序列的表达。10.权利要求1-6任一项所述的疫苗或权利要求7-9任一项所述的表达载体的应用，所述应用包括：制备预防和／或治疗sars-cov-2引发的感染的药物；制备covid-19的检测试剂；和／或制备基因功能调节剂。

技术总结
本发明涉及用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗。本发明采用密码子偏好性进行优化得到新的S基因序列，其能高效在人源细胞内高效表达，免疫机体后可高效表达S抗原，产生针对奥密克戎株SARS-CoV-2的中和抗体，可以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染。以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染。以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染。


技术研发人员：陈凌 杨臣臣 汪乾 关素华
受保护的技术使用者：广州恩宝生物医药科技有限公司
技术研发日：2022.02.09
技术公布日：2022/3/8