一种含有多种低丰度菌的FMT供体菌液及其制备方法和应用与流程

一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及粪菌移植领域，具体涉及一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.低聚果糖(fructooligosaccharide,fos)是一种重要的益生元，是水溶性膳食纤维，广泛存在于植物中，国际上公认具有保健作用。具有许多生理功能，如促进肠道蠕动，缓解便秘，缩短首便时间，增加排便量和频率；提高脂质代谢，降血糖、降血脂并预防心血管疾病；提高矿物质吸收等等。
3.但是低聚果糖不能被人体直接的消化吸收，只能被肠胃细菌吸收，如果直接食用可能会引起消化不良的现象；有些对低聚果糖不耐受的人直接食用的话，可能会造成腹泻等不良现象。
4.人体肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠人体的肠道生活，同时帮助人体完成多种生理生化功能。肠道微生物不仅在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，其本身以及代谢产物也能调节人体健康，因此肠道微生物与人体健康密切相关。肠道微生物通过与宿主之间的动态性生理作用，达到微生态平衡，有效防止肠道内细菌及内毒素易位。当正常的微生物群落受到宿主及外环境影响时，原有的平衡遭到破坏，肠道菌群失调，肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，转变为病理性组合状态，进而导致宿主致病。目前研究表明，人体的多种疾病都与肠道微生物具有密切关联，多个文献报道megasphaera(巨球型菌)，megamonas(巨单胞菌属)，roseburia(罗氏菌属)，dorea(多尔氏菌属)与t2dm、肥胖和便秘等有关联。
5.如de la cuesta-zuluaga,j.,mueller,n.t.,corrales-agudelo,v.,vel
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squez-mej
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a,e.p.,carmona,j.a.,abad,j.m.,&escobar,j.s.(2016).metformin is associated with higher relative abundance of mucin-degradingakkermansia muciniphilaand several short-chain fatty acid
–
producing microbiota in the gut.diabetes care,40(1),54
–
62.-t2dm提到megasphaera与t2dm有关联；
6.zhao,y.,&yu,y.-b.(2016).intestinal microbiota and chronic constipation.springerplus,5(1)提到roseburia与肥胖有关联；
7.grigor’eva,i.n.(2020).gallstone disease,obesity and the firmicutes/bacteroidetes ratio as a possible biomarker of gut dysbiosis.journal of personalized medicine,11(1),13.提到dorea和便秘等有关联。
[0008]“粪菌移植”(fecal microbiota transplantation，fmt)是指将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。一般来说，为了更好地帮助患者，粪菌移植要求的供体粪菌中有害菌数量要尽可能的低，特别是能够精准配型，降低副作用风险具有重要的临床需求。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液及其制备方法和应用，通过采用低聚果糖，抑制fmt供体菌液中的有害菌。
[0010]
为了达到上述目的，本发明fmt供体菌液的技术方案是：
[0011]
包括gam培养基、低聚果糖溶液、pbs缓冲液和肠道微生物溶液，其中，gam培养基、低聚果糖、pbs缓冲液和肠道微生物之间的比例为2ml：(0.09～0.11)g：1ml：(0.045～0.165)g。
[0012]
进一步地，gam培养基的浓度为50～70g/l；低聚果糖溶液的质量浓度为4.5～5.5％，肠道微生物溶液的质量浓度为9～11％。
[0013]
本发明fmt供体菌液的制备方法的技术方案是：包括以下步骤：
[0014]
步骤一：取gam培养基置于容器中，然后取低聚果糖溶液加入gam培养基中，再加入pbs缓冲液，得到混合液；
[0015]
步骤二：混合液经过置换处理，得到低聚果糖-gam培养基；
[0016]
步骤三：将肠道微生物溶液接种至步骤二得到的低聚果糖-gam培养基中，培养得到fmt供体菌液；
[0017]
其中gam培养基、低聚果糖、pbs缓冲液和肠道微生物之间的比例为2ml：(0.09～0.11)g：1ml：(0.045～0.165)g。
[0018]
进一步地，gam培养基的浓度为50～70g/l；低聚果糖溶液的质量浓度为4.5～5.5％；肠道微生物溶液的质量浓度为9～11％；pbs缓冲液的ph值为7.2～7.9。
[0019]
进一步地，pbs缓冲液和低聚果糖溶液使用前均经过灭菌处理；置换处理是将装有混合液的容器放入厌氧箱中，置换氧气11～13h。
[0020]
进一步地，肠道微生物溶液的制备步骤包括：
[0021]
先取粪便样品加入pbs缓冲液混匀形成悬浊液，然后过滤，将得到的滤液进行离心处理，获得沉淀物；将沉淀物用pbs溶液配成质量浓度为9～11％的肠道微生物溶液。
[0022]
进一步地，步骤三中培养72～96h；
[0023]
还包括以下步骤：
[0024]
步骤四：将步骤三所得的fmt供体菌液，在4500xg、4℃离心30分钟，去除上清液；
[0025]
步骤五：用生理盐水将离心沉淀重悬后直接用于fmt，或制备成胶囊后-80℃保藏备用。
[0026]
如上所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液在粪菌移植中的应用。
[0027]
如上所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液在制备粪菌移植药物中的应用，所述药物包括所述fmt供体菌液经离心处理和生理盐水重悬后制得的菌液型或胶囊型。
[0028]
进一步地，低丰度菌包括大肠埃氏菌属-志贺氏菌属、考拉杆菌属、毛螺菌属、大肠杆菌、副沙门氏菌、别样杆菌属、嗜胆菌属、巨球型菌、巨单胞菌属、罗氏菌属和多尔氏菌属。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0030]
本发明包括由gam培养基、低聚果糖溶液、pbs缓冲液和肠道微生物溶液定向发酵培养后产生的fmt供体菌液，通过体外模拟肠道环境，并以健康人体粪便中收集的肠道菌群作为样本，将低聚果糖应用到抑制其中有害菌的增殖发酵，有害菌如大肠埃氏菌属-志贺氏菌属、考拉杆菌属、毛螺菌属、大肠杆菌、副沙门氏菌、别样杆菌属、嗜胆菌属、巨球型菌、巨
单胞菌属、罗氏菌属和多尔氏菌属，同时，对于其他菌群无抑制作用，如琥珀酸弧菌属；为临床应用提供科学依据，达到高效制备益生菌剂；有效避免直接服用低聚果糖可能导致腹泻的不良症状。本发明通过体外定向培养后的菌液，不仅可以降低疾病风险，而且对于个性化精准化fmt更有重要意义。
附图说明
[0031]
图1为本发明提出的一种将低聚果糖应用到抑制有害菌增殖中的方法的菌群经低聚果糖干预前后的丰度变化示意图。
具体实施方式
[0032]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033]
本发明涉及大肠埃氏菌属-志贺氏菌属escherichia-shigella、考拉杆菌属phascolarctobacterium、毛螺菌属lachnospiraceae_ucg-010、大肠杆菌colidextribacter、副沙门氏菌parasutterella、别样杆菌属alistipes、嗜胆菌属bilophila、巨球型菌megasphaera、巨单胞菌属megamonas、罗氏菌属roseburia、多尔氏菌属dorea和琥珀酸弧菌属succinivibrio。
[0034]
本发明fmt供体菌液包括体积比为2:2:1:(0.5～1.5)的gam培养基、低聚果糖溶液、pbs缓冲液和肠道微生物溶液，其中，gam培养基的浓度为50～70g/l，低聚果糖溶液的质量浓度为4.5～5.5％，肠道微生物溶液的质量浓度为9～11％，低聚果糖溶液和肠道微生物溶液的密度认为与水相同，为1g/ml；因此，本发明中各物质用量之间的关系是：
[0035]
gam培养基、低聚果糖、pbs缓冲液和肠道微生物之间的比例为2ml：(0.09～0.11)g：1ml：(0.045～0.165)g。
[0036]
pbs缓冲液的ph值为7.2～7.9。
[0037]
下面通过具体的实施例来做进一步详细说明。
[0038]
实施例一
[0039]
考虑到来源于人体的肠道菌群无法完全在小鼠体内进行定殖，导致菌群丰度测定结果不准确的问题，在体外进行体内模拟实验，取人体粪便作为肠道菌群样品，观察低聚果糖干预对于肠道菌群的作用，具体操作过程如下：
[0040]
1、原料处理及配制
[0041]
(1)pbs缓冲液配制
[0042]
先将kh2po4、na2hpo4·
12h2o、nacl和kcl按质量比为0.24：2.90：8.00：0.20混合，得到混合物；然后向混合物中加水，并用0.1m的hcl或naoh调节ph值，得到pbs缓冲液，pbs缓冲液的ph值为7.2～7.9，优选7.4，kh2po4的浓度为0.24g/l。
[0043]
pbs缓冲液经过高压灭菌处理，在高压灭菌锅中121℃处理15分钟，密封冷却至室温后，存于3～5℃冰箱中，可保存6个月。
[0044]
(2)粪便样品处理
[0045]
先取10g粪便样品加入适量pbs缓冲液充分混匀形成悬浊液，然后在生物安全柜内
过滤，依次通过20目、50目、100目、200目的滤网，将得到的滤液进行离心处理，6000g，4℃离心15min，弃上清，获得沉淀物；将沉淀物用pbs溶液配成质量浓度为10％的肠道微生物溶液。
[0046]
2、低聚果糖干预实验
[0047]
(1)配制用于培养肠道微生物的基础培养基：
[0048]
取改良gam肉汤药品(可以在市场上购买得到)，加超纯水配成浓度为60g/l的溶液，再置于脉冲高压灭菌锅，使用液体程序，121℃，15分钟灭菌。灭菌完后，立即密封，冷却至室温，得到gam培养基。
[0049]
(2)低聚果糖-gam培养基配制
[0050]
于无菌操作台上，取上述浓度为60g/l的gam培养基分装至玻璃管等容器中；将黑色盖子放在瓶口上微掩。接着取低聚果糖溶液加入gam培养基中，得到混合液；低聚果糖购于西安奥赛生物科技有限公司，纯度99％，用pbs缓冲液溶解至质量百分浓度为：5％。混合液经过置换处理，得到低聚果糖-gam培养基。
[0051]
置换处理：将装有混合液的每个玻璃管盖拧紧后，转移至经过84消毒液消毒处理的厌氧箱传递箱中，拧松瓶盖，置换氧气12个小时。
[0052]
取2ml所得的低聚果糖-gam培养基作为试验组。同时还设置有空白对照组，空白对照组经过同样的置换处理；每组3个重复，分组配比具体如下：
[0053]
试验组：2ml gam培养基+2ml低聚果糖溶液+1ml pbs缓冲液；
[0054]
对照组：2ml gam培养基+3ml pbs缓冲液；
[0055]
将上述处理后得到的肠道微生物样品分别接种至试验组(低聚果糖-gam培养基)以及空白对照组(gam培养基-pbs缓冲液)中，每管1ml。
[0056]
于厌氧箱中培养72小时后，观察菌群的生长状况，拍照留存，获得含有多种低丰度菌的fmt供体菌液。
[0057]
接着分别将试验组样品和对照组样品，10000rpm，3min离心，弃上清，将沉淀用液氮处理，并送至武汉艾康健生物科技有限公司，利用二代测序法(16s rdna)分别测定试验组和对照组中的肠道菌群丰度，即不同肠道微生物在检测到的所有菌种中所占的百分比，其中部分肠道菌群的丰度测定结果如表1所示。
[0058]
表1不同处理组的肠道菌群丰度
[0059][0060]
由表1可以看出，本发明向gam培养基中按特定比例添加特定浓度的低聚果糖溶液，所形成的低聚果糖-gam培养基能够有效对肠道微生物进行调整，与未添加低聚果糖溶液的对照组相比，本发明能有效抑制有害菌增长。
[0061]
并对部分肠道菌群经低聚果糖干预前后的丰度变化进行显著性分析。
[0062]
分析结果如图1所示，其中**表示p＜0.01，即丰度变化有极显著差异；*表示p＜0.05，即丰度变化有显著差异。megasphaera(巨球型菌)、megamonas(巨单胞菌属)、roseburia(罗氏菌属)和dorea(多尔氏菌属)在多糖的培养下，有极其显著性的降低，succinivibrio(琥珀酸弧菌属)变化不明显。
[0063]
实施例二
[0064]
考察不同浓度低聚果糖溶液对肠道有害菌的抑制效果。
[0065]
分别采用0.5％、1.5％、3％、4.5％、5.5％以及8％的低聚果糖溶液，其他条件同实施例一。
[0066]
经测试发现，随低聚果糖溶液浓度升高，用量增加，本发明菌液对于上述肠道菌群的抑制作用逐渐增强，在5％时达到最高；当浓度低于4.5％时，抑制作用不是很明显，同时需要的培养时间长；当浓度高于5.5％时，其对有益菌也产生抑制作用；因此，本发明中适合有益菌生长同时对有害菌有抑制作用的低聚果糖溶液浓度为4.5～5.5％，能保证供体菌群在合适的溶液环境中进行培养。
[0067]
实施例三
[0068]
考察不同肠道微生物溶液的质量浓度对所得菌液的影响。
[0069]
分别采用5％、7％、13％以及15％的肠道微生物溶液，其他条件同实施例一。
[0070]
经测试发现，随肠道微生物溶液浓度升高，即肠道微生物含量增加，在超过11％之后，所得菌液对于上述肠道菌群的抑制作用不明显，当浓度低于5％时，菌群中有益菌数量不够高，不利于后续制备药物。
[0071]
改变肠道微生物溶液的添加体积，也是改变肠道微生物总的添加量，影响与改变质量浓度相同。
[0072]
实施例四
[0073]
分别采用ph值为7.0、7.2、7.6、7.9、8.5以及9.0的pbs缓冲液，发现其ph值在7.4时所得菌液的抑制作用最强；除了7.4之外，在7.2～7.9之间的抑制作用相差不大；在7.0和8.5以及9.0时，对于肠道微生物的生长不利，所有菌群种类及数量都明显降低。
[0074]
在健康供体的肠道菌群中仍然存在一定种类和数量的有害菌，对fmt受体来说仍然是一个风险因素。本发明通过体外定向培养后的细菌，不仅可以降低疾病风险，而且对于个性化精准化fmt更有重要意义。
[0075]
本发明经厌氧培养后制得的含有多种低丰度菌的fmt供体菌液，即发酵培养所得的混合物，通过离心去除其中的培养成分，离心条件如在4500xg、4℃离心30分钟；按现有药品的相关标准，用生理盐水重悬，定容后直接用于fmt，或制备成胶囊后-80℃保藏备用；重悬浓度如10
11
cfu/50ml～10
12
cfu/50ml。
[0076]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液，其特征在于：包括gam培养基、低聚果糖溶液、pbs缓冲液和肠道微生物溶液，其中，gam培养基、低聚果糖、pbs缓冲液和肠道微生物之间的比例为2ml：(0.09～0.11)g：1ml：(0.045～0.165)g。2.根据权利要求1所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液，其特征在于：gam培养基的浓度为50～70g/l；低聚果糖溶液的质量浓度为4.5～5.5％，肠道微生物溶液的质量浓度为9～11％。3.一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：取gam培养基置于容器中，然后取低聚果糖溶液加入gam培养基中，再加入pbs缓冲液，得到混合液；步骤二：混合液经过置换处理，得到低聚果糖-gam培养基；步骤三：将肠道微生物溶液接种至步骤二得到的低聚果糖-gam培养基中，培养得到fmt供体菌液；其中gam培养基、低聚果糖、pbs缓冲液和肠道微生物之间的比例为2ml：(0.09～0.11)g：1ml：(0.045～0.165)g。4.根据权利要求3所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液的制备方法，其特征在于：gam培养基的浓度为50～70g/l；低聚果糖溶液的质量浓度为4.5～5.5％；肠道微生物溶液的质量浓度为9～11％；pbs缓冲液的ph值为7.2～7.9。5.根据权利要求3所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液的制备方法，其特征在于：pbs缓冲液和低聚果糖溶液使用前均经过灭菌处理；置换处理是将装有混合液的容器放入厌氧箱中，置换氧气11～13h。6.根据权利要求3所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液的制备方法，其特征在于：肠道微生物溶液的制备步骤包括：先取粪便样品加入pbs缓冲液混匀形成悬浊液，然后过滤，将得到的滤液进行离心处理，获得沉淀物；将沉淀物用pbs溶液配成质量浓度为9～11％的肠道微生物溶液。7.根据权利要求3所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液的制备方法，其特征在于：步骤三中培养72～96h；还包括以下步骤：步骤四：将步骤三所得的fmt供体菌液，在4500xg、4℃离心30分钟，去除上清液；步骤五：用生理盐水将离心沉淀重悬后直接用于fmt，或制备成胶囊后-80℃保藏备用。8.如权利要求1所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液在粪菌移植中的应用。9.如权利要求1所述的一种含有多种低丰度菌的fmt供体菌液在制备粪菌移植药物中的应用，其特征在于：所述药物包括所述fmt供体菌液经离心处理和生理盐水重悬后制得的菌液型或胶囊型。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：低丰度菌包括大肠埃氏菌属-志贺氏菌属、考拉杆菌属、毛螺菌属、大肠杆菌、副沙门氏菌、别样杆菌属、嗜胆菌属、巨球型菌、巨单胞菌属、罗氏菌属和多尔氏菌属。

技术总结
本发明涉及一种含有多种低丰度菌的FMT供体菌液及其制备方法和应用，本发明包括由GAM培养基、低聚果糖溶液、PBS缓冲液和肠道微生物溶液定向发酵培养后产生的FMT供体菌液，其中，GAM培养基、低聚果糖、PBS缓冲液和肠道微生物之间的比例为2mL：(0.09～0.11)g：1mL：(0.045～0.165)g。本发明通过体外模拟肠道环境，并以健康人体粪便中收集的肠道菌群作为样本，将低聚果糖应用到抑制其中有害菌的增殖发酵，同时，对于其他菌群无抑制作用，为临床应用提供科学依据，达到高效制备益生菌剂；有效避免直接服用低聚果糖可能导致腹泻的不良症状。接服用低聚果糖可能导致腹泻的不良症状。接服用低聚果糖可能导致腹泻的不良症状。


技术研发人员：刘庆军 沈鹤霄 李国龙 刘慧敏 张帆 周先锋 王峰
受保护的技术使用者：美益添生物医药（武汉）有限公司
技术研发日：2021.12.07
技术公布日：2022/3/8