一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用与流程

1.本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用。


背景技术：

2.肝脏是人体最重要的药物代谢器官，而药物的肝毒是药品下架的主要原因之一。在动物模型中，药物清除率及肝脏毒性的相关性与临床上的结果差异极大；而人原代肝细胞虽然作为药物代谢的金标准，其来源的短缺使其应用大大受限，目前亟需开发一个具备较强代谢功能的体外人源肝脏代谢模型。
3.人多能干细胞 (hpsc) 具有增殖能力与多谱系分化潜力；可于体外定向分化为各种体细胞类型。近年来随着再生医学、发育学以及组织工程学的快速发展，世界各地研究者逐步建立了hpsc来源的肠、肝、脑、肾、胃等多种类器官诱导系统；与2d单层细胞相比，这些3d类器官呈现了更复杂的结构，拥有更贴近生理原貌的成熟度与功能性。而hpsc来源的肝类器官系统，被认为具备还原人类肝脏完整功能的潜力，有望成为新一代的高精准度药筛模型。目前，构建肝脏类器官的方法相对较多，但还存在一定的缺陷，限制了肝脏类器官的应用，如体系诱导大于40天周期较长，培养体系复杂，中间阶段需挑取克隆，操作难度大，且依赖动物血清，难以实现大范围应用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明旨在提出一种多谱系肝脏类器官的构建方法，将肠管前部衍物诱导分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝前体，并将这些肝前体诱导分化为具备高药代活性的成熟肝类器官，适用于高通量药物筛选。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种多谱系肝脏类器官的构建方法，该方法包括如下步骤：s1、诱导人多能干细胞分化形成定形内胚层；s2、使用bmp抑制剂、fgf4、wnt信号激活剂诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；s3、将前肠管衍生物消化为单细胞，依次使用tgfβ抑制剂、sirt1抑制剂、vegf、fgf2、wnt信号激活剂、egf组合物与rar核受体激动剂、sirt1抑制剂、石胆酸lca组合物，使前肠管单细胞增殖、分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；s4、使用mst1/2的抑制剂、α1-肾上腺素能受体激动剂、甲萘醌4 mk4、 camp激活剂、地塞米松mk125组合物实现多谱系肝类器官的药代成熟化。
6.进一步，在步骤s2中，所述bmp抑制剂为cc、noggin或ldn193189中的任一种，所述wnt信号激活剂为chir99021或wnt3a；优选地，所述bmp抑制剂为cc，用量为0.75μm；所述fgf4的浓度为250ng/ml；所述wnt信号激活剂为chir99021，用量为3μm。
7.进一步，在步骤s2中所用的培养基中包括2% knockout血清替代物ksr、0.5%胰岛
素-转铁蛋白-硒混合液its、75%william's e和22.5% ham营养混合物f12。
8.进一步，在步骤s3中，所述tgfβ抑制剂为repsox、a83-01或sb431542中的任一种，所述sirt1抑制剂为nic，所述wnt信号激活剂为wnt3a或chir99021，所述rar核受体激动剂为全反式维甲酸atra；优选地，所述tgfβ抑制剂为repsox，用量为1μm；所述nic的用量为10mm；所述vegf的浓度为20ng/ml，fgf2的浓度为20ng/ml，egf的浓度为20ng/ml；所述wnt信号激活剂为wnt3a，浓度为50ng/ml；atra的用量为2μm，lca的用量为10μm。
9.进一步，在步骤s3中两种培养组合物所用的培养基中包括2% knockout血清替代物ksr、0.5%胰岛素-转铁蛋白-硒混合液its、75%william's e和22.5% ham营养混合物f12。
10.进一步，在步骤s4中，所述mst1/2的抑制剂为xmu-mp-1，所述α1-肾上腺素能受体激动剂为甲氧胺mx，所述camp激活剂为8-br-camp；优选地，xmu-mp-1的用量为5μm，mx的用量为1μm，mk4的用量为10μm，8-br-camp的用量为1 mm，mk125的用量为0.1μm；还包括25ng/ml rh osm。
11.进一步，在步骤s4中所用的培养基中包括2%ksr、48%william's e和50% hepatozyme。
12.进一步，步骤s1具体包括如下步骤：s11、将人多能干细胞在添加有rhacta、rhbmp4和chir99021的rpmi-1640培养基中培养1d；s12、再将s11步骤中得到的细胞在添加有rhacta、rhfgf2和ksr的rpmi-1640培养基中培养1d；s13、再将s12步骤中得到的细胞在添加有rhacta、rhfgf2和ksr的rpmi-1640培养基中培养1d；且ksr的浓度大于s12中ksr的浓度。
13.具体的，s11中添加剂的浓度为：100 ng/ml rhacta、10 ng/ml rhbmp4、2μm chir99021；s12中添加剂的浓度为：100 ng/ml rhacta、10ng/ml rhfgf2、0.2% ksr；s13中添加剂的浓度为：100 ng/ml rhacta、10ng/ml rhfgf2、2% ksr。
14.进一步，在步骤s2的培养天数为4d，在步骤s3的培养天数为9d，在步骤s4的培养天数为8d。
15.进一步，将步骤s2得到的前肠管衍生物消化为单细胞可作为肝类器官的二级种子细胞，支持冻存与复苏。
16.进一步，在步骤s3中，将前肠管衍生物消化为单细胞的方法包括以下步骤：1）使用accutase-edta消化酶溶液对前肠管衍生物进行2-5min消化；待其形成单细胞后，以2倍体积的中和培养基中和消化酶，中和培养基包括2%ksr、0.5%its、75%william's e和22.5%f12；2）中和消化反应后，在室温250g离心5min，弃去上清后，使用冰上融化的matrigel基质胶重悬，并包被于超低吸附培养板中，待基质胶凝固后，加入后续诱导培养基中进行培养。
17.本发明还提供了一种由上述任一项所述的方法构建的多谱系肝脏类器官，所述多谱系肝脏类器官具有以下特征：1）形态匀质、尺寸匀一，大小为150-200μm的球形结构；2）产
物包含肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、肝巨噬细胞；3）高表达关键药物代谢酶cyp3a4与多药耐药基因mdr1。
18.本发明还提供了一种如上述所述的多谱系肝脏类器官作为高通量药物筛选的用途。
19.本发明还提供了一种用于多谱系肝脏类器官的诱导分化组合物，包括：1）诱导分化前肠管衍生物组合物：bmp抑制剂、fgf4、wnt信号激活剂；2）肝脏多谱系特化组合物：前期分化组合物：tgfβ抑制剂、sirt1抑制剂、wnt信号激活剂、vegf、fgf2和egf；后期分化组合物：rar核受体激动剂、sirt1抑制剂、lca；3）药代成熟组合物：mst1/2的抑制剂、α1-肾上腺素能受体激动剂、mk4、camp激活剂、mk125。
20.进一步，在1）诱导分化前肠管衍生物组合物中，bmp抑制剂为cc，wnt信号激活剂为chir99021；在2）肝脏多谱系特化组合物中，前期分化组合物：tgfβ抑制剂为repsox，sirt1抑制剂为nic，wnt信号激活剂为wnt3a；后期分化组合物：rar核受体激动剂为atra，sirt1抑制剂为nic；在3）药代成熟组合物中，mst1/2的抑制剂为xmu-mp-1，α1-肾上腺素能受体激动剂为mx，camp激活剂为8-br-camp，还包括osm。
21.相对于现有技术，本发明所述的多谱系肝脏类器官的构建方法具有以下优势：本发明所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，先将hpsc分化为具备肝向分化潜力的肠管前部衍生物，在此基础上，将这些肠管前部衍物诱导分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝前体，最后将这些肝前体诱导分化为具备高药代活性的成熟肝类器官。
22.采用该方法构建多谱系肝脏类器官还具有以下优点：1）将整个诱导周期缩短，仅需24天即可获得成熟肝类器官；2）高分化效率，每个类器官来自于中间分化阶段（肠管前部）消化而来的单细胞，较传统方法大幅提高了诱导效率。3）中间阶段可以单细胞的形式（二级种子细胞）冻存复苏，方便后续分化利用；4）该方法构建的肝脏类器官具有高药代活性与可诱导性；5）该类器官形态匀质、尺寸匀一，大小为150-200μm的球形结构，且适用于高通量药物筛选；6）该类器官具有高度生理相关，产生类器官包含多种肝脏相关谱系，包括肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、肝巨噬细胞等；7）整个培养过程为无血清诱导分化体系，成分明确可控，受批次间差异影响小，被病原微生物污染的风险低。
附图说明
23.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为诱导分化示意图；图2为hpsc形态与多能性鉴定结果图；a为hpsc明场图，b为免疫荧光鉴定结果；图3为阶段1分化结果图；a与b分别为分化前起始密度明场图与day3定形内胚层明
场图；c为day3细胞免疫荧光鉴定结果；图4为阶段2实时荧光定量pcr检测结果；图5为day7衍生物免疫荧光鉴定结果；图6 为day7衍生物消化为单细胞后，冻存6个月复苏的细胞活性检测结果；图7为消化后的单细胞冻存前与复苏后活率比较图；图8为day8单细胞3d包被后的明场图以及day16的明场图；图9为day16衍生物的尺寸分布图，生物学重复n=4；图10为day16衍生物免疫荧光鉴定结果图；图11为day24多谱系肝类器官明场图；图12为day24衍生物的尺寸分布图，生物学重复n=4；图13为成熟肝系、胆系标志物与胎儿（不成熟）肝系、胆系标志物的实时荧光定量pcr检测结果；其中，fl（fetal liver）为人胎儿肝脏；al（adult liver）为成年肝脏；ibec为人肝内胆管细胞；肝系标志物全部以人胎儿肝为对照；胆系标志物全部以人肝内胆管细胞为对照。不同诱导分化时间点的生物学重复n=4；图14为day24类器官的免疫荧光鉴定结果；图15为day24类器官谱系比例构成的流式细胞术分析结果，生物学重复n=5；图16中a-c分别为cyp3a4、cyp1a2与cyp2b6的活性与可诱导性分析结果；其中，mho (multi-lineage hepatic organoids)为day24成熟的多谱系肝类器官；ph (primary hepatocyte)为人原代肝细胞；rif (rifampicin)为利福平，是cyp3a4活性的一种诱导剂；omep (omeprazole)为奥美拉唑，是cyp1a2活性的一种诱导剂；pb (phenobarbital)为苯巴比妥，是cyp2b6活性的一种诱导剂。生物学重复n=4。*，p＜0.05；**，p＜0.01；图17为使用8种经典肝毒化合物处理后，成熟多谱系肝类器官、hepg2以及原代肝细胞的tc50（半数致死浓度）分析；图18为b为成熟多谱系肝类器官、hepg2与原代肝细胞tc50的回归分析；生物学重复n=4；mho (multi-lineage hepatic organoids)为成熟的多谱系肝类器官，ph (primary hepatocyte) 为人原代肝细胞，hepg2为一种肝癌细胞系；图19为对比例1不同定形内胚层产生方法下day7衍生物sox2表达水平图；图20为对比例1不同定形内胚层产生方法下day16衍生物产生效率图，比例尺，250μm；图21为对比例2中bmp4信号抑制剂对day7衍生物sox2与cdx2表达水平的影响图；生物学重复n=3；图22为对比例2中使用其他bmp信号抑制剂对sox2+细胞分化效率的影响图；图23为对比例3中阶段4组分对类器官效率产生的影响明场图；比例尺，250μm；图24为对比例3中阶段4组分对肝脏成熟基因alb表达水平的影响；生物学重复n=3；na，not available；因活细胞量不足而无法测定；图25为对比例4中阶段5组分对成熟肝脏标志物alb表达水平的影响；生物学重复n=4；图26为对比例4中阶段5组分对药物代谢标志物cyp3a4表达水平的影响；生物学重复n=4。
ksr的rpmi-1640培养基中继续培养1天；day3:最后再转入添加有 100 ng/ml rhacta、10ng/ml rhfgf2、2% ksr的rpmi-1640培养基中继续培养1天。
35.阶段2：诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物（day 4-7）day 4-7：将阶段1分化成功的细胞继续在添加有0.75μm cc、250ng/ml rhfgf4、3μm chir99021的诱导培养基中继续培养4天，该诱导培养基包括2%ksr、0.5%its、75%william's e、22.5%f12，期间每24h更换培养基。
36.其中，cc是bmp信号抑制剂，能选择性抑制 bmp i 型受体 alk2，alk3 和 alk6，也可以替换成其他2种其他tgfβ抑制剂，如noggin或ldn193189。
37.chir99021是wnt信号激活剂，也可以将其替换成wnt3a。
38.阶段3：将前肠管衍生物消化为单细胞（day 8）使用accutase-edta消化酶溶液对前肠管衍生物进行2-5min消化；待其形成单细胞后，以2倍体积的中和培养基中和消化酶，中和培养基包括2%ksr、0.5%its、75%william's e、22.5%f12。
39.此后，可使用stem-cellbanker (dmso-free) 冻存培养基对单细胞进行冻存，冻存复苏后仍具有活性，可继续进行分化。
40.本实施例中直接将消化后的单细胞进入3d包被，继续分化：中和消化反应后，在室温250g离心5min，弃去上清后，使用冰上融化的matrigel基质胶重悬，并包被于超低吸附培养板中，待基质胶凝固后，加入下一阶段的诱导培养基。
41.阶段4：肝脏相关的多谱系特化（day 8-16）该阶段分为2个步骤：1）day8-13：将上述的消化的单细胞置于添加有10mm nic、1μm repsox、20ng/ml rhfgf2、20ng/ml rhvegf、20ng/ml rhegf、50ng/ml rhwnt3a的诱导培养基中培养6天，该诱导培养基包括2%ksr、0.5%its、75%william's e、22.5%f12，期间每72h更换1次培养基。
42.其中，repsox为tgfβr-1/alk5抑制剂，可替换为2种其他tgfβ抑制剂，如a83-01、sb431542。
43.wnt3a为wnt信号激活剂，可替换为另一种wnt信号激活剂chir99021。
44.2）day14-16：将上述细胞转入添加有2μm atra、10mm nic、10μm lca的诱导培养基中培养3天，该诱导培养基包括2%ksr、0.5%its、75%william's e、22.5%f12，期间每72h更换1次培养基。
45.阶段5：肝脏类器官的药代成熟（day 17-24）day17-24：使用recovery solution回收包被于matrigel基质胶的第16天肝前体球，并使用含有10% matrigel基质胶的阶段5诱导培养基，将其接种于超低吸附培养板。
46.阶段5诱导培养基中添加25ng/ml rh osm、5μm xmu-mp-1、1μm mx、10μm mk4、1 mm 8-br-camp、0.1μm mk125，该诱导培养基包括2%ksr、48%william's e、50% hepatozyme，期间每72h更换1次培养基。
47.其中，mx是α1-肾上腺素能受体激动剂，可替换为mx盐的形式。8-br-camp为环形amp类似物的盐形式，可替换为camp。
48.截至第24天，多谱系肝类器官实现成熟化。
49.结果分析：1、各个阶段结果验证1）定形内胚层验证阶段1的3天培养结束后，细胞群呈现内胚层典型特点，如图3中b图；图3中c图中，左图是将sox17与dapi染色结果堆叠，中间图是将foxa2与dapi染色结果堆叠，右图是sox17+ foxa2+dapi的染色堆叠，双阳性率＞90%，说明细胞表达定形内胚层标志物sox17与foxa2，证明阶段1分化成功。
50.2）前肠管衍生物验证为了验证该阶段成功分化前肠管衍生物，进行了实时荧光定量pcr检测和免疫荧光鉴定。
51.通过图4实时荧光定量pcr检测结果可以看出，相比于day3定形内胚层，肠管前部标志物sox2表达水平显著上调的同时，肠管后部标志物cdx2表达未上调。通过图5的免疫荧光鉴定结果证实，其sox2阳性率≥85%。这些结果提示该阶段产生了前肠衍生物。
52.3）单细胞冻存复苏的可行性与有效性为了验证冻存后的单细胞仍具有活性，对其进行复活率检测。
53.使用stem-cellbanker (dmso-free)将消化的单细胞冻存6个月，后复苏，如图6为冻存前与复苏后活率比较，冻存前是93.1%
±
9.6% ，复苏后是87.5%
±
5.3%，活率接近。图7是采用流式细胞术对冻存前与复苏后的单细胞肠管前部标志物sox2阳性率进行检测的结果，冻存前是93.1%
±
9.6%，复苏后是87.5%
±
5.3%，无明显变化，证明冻存复苏的单细胞是可行且有效的。
54.4）多谱系特化验证培养结束后，单细胞增殖、分化为匀质的球状结构，如图8所示，其大小约50-100μm，如图9所示。图10为免疫荧光结果，结果表明，其具备肝细胞（afp+）、胆管细胞（sox9+）、肝星状细胞（vim+）、肝巨噬细胞（cd68+）；证明了多谱系肝前体球的形成。
55.5）肝脏类器官验证图11为分化至第24天的组织结构，图12为组织细胞的尺寸比例，从图11和图12可以看出，这些类器官的体积增加至100-200μm。
56.图13中a为成熟肝系标志物alb、hnf4α的表达情况，c为成熟胆系标志物cftr、sstr2的表达情况，b为胎儿（不成熟）肝系标志物afp的表达情况，d为胎儿（不成熟）胆系标志物sox9的表达情况，从图中可以看出，肝脏成熟标志物表达显著上调，胎儿肝脏标志物下调。
57.图14的免疫荧光证实，其高表达关键药物代谢酶cyp3a4与多药耐药基因mdr1，且几乎检测不到胎肝细胞标志物afp的表达，这些结果证明肝类器官成功实现成熟化。
58.图15的流式检测结果表明，该阶段产物包含的肝细胞（alb+）、胆管细胞（ck19+）、肝星状细胞（vim+）、肝巨噬细胞（cd68+），比例分别为82%
±
9%、7%
±
2%、3%
±
0.4%、与1%
±
0.9%。
59.图16的荧光报告基因分析表明，这些肝类器官具备与原代肝细胞类似的cyp3a4、cyp2d6、cyp1a2的活性。分别使用相应诱导剂与不同剂量进行酶活诱导，其活性呈现不同倍数的上调。
60.图16中a图中，cyp3a4：1.25μm rif，2.2倍；12.5μm rif，6.4倍；50μm rif，9.1倍；图16中b图中，cyp1a2：10μm omep，3.6倍；50μm omep，5.2倍；100μm omep，6.3倍；图16中c图中，cyp2b6：100μm pb，2.4倍；500μm pb，7.2倍；1000μm pb，12.2倍）。
61.与dmso组相比，大部分呈现显著与极显著差异，这些结果证实了该多谱系类器官具备强药代活性与可诱导性，适用于药物筛选应用。
62.6）高通量药物筛选将每8-10个成熟肝类器官接种于超低吸附384培养板中，使用自动化设备tecan d300e微量分样器对8种经典肝毒化合物进行梯度稀释与加样，培养箱孵育72-96h，即可使用celltiter-glo
®ꢀ
3d cell viability reagent通过高通量酶标仪读取细胞活性数据，分析毒性应答谱，如图17，与肝癌细胞系hepg2相比，成熟多谱系肝类器官呈现了更接近原代肝细胞的tc50值（半数致死浓度）。
63.图18拟合分析结果表明，hepg2与原代肝细胞tc50值拟合度r2仅为0.71；而成熟肝类器官r2值高达0.95；表明本方法产生的成熟多谱系肝类器官极具高通量药物筛选的应用前景。
64.对比例1 阶段1的对比在无血清体系前提下，对于阶段1，如使用其他几种经典的定型内胚层分化方案a-e，会导致阶段2形成sox2+肠管前部细胞群效率低下，如图19所示。说明虽然实现定形内胚层分化的方法很多，但并不都适用于本技术，并不能提高阶段2的效率。图20是取自图19几种方法中sox2表达量相对更高的3种方法，即方案a、e、f，除本专利方法f外，a与e发生了球状结构的崩解。
65.表1 不同内胚层分化方案对比例2 阶段2的对比1）不使用bmp信号抑制剂，仅使用fgf4与chir99021，无法有效促使肠管前部标志物sox2表达量上调，如图21所示；相反将提升肠管中后部标志物cdx2表达量的上调。
66.2）将cc换为靶点相同的其他bmp信号抑制剂，如ldn193189；会降低sox2+细胞占
比，如图22所示，进而降低肝类器官分化效率。
67.对比例3 阶段4的对比去除该阶段的培养基中任何一种组分，如表2所示，将降低类器官产生效率，如图23所示组分对类器官效率产生的影响明场图，很明显看到i方案效率最高。
68.图24是组分对肝脏成熟基因alb表达水平的影响，可见只有采用本发明的培养基alb表达水平最高，缺少任一组分，将降低肝脏标志物表达水平。
69.表2 不同阶段4培养方案组分abcdefghiwntinhibitor(iwp2)+
‑‑‑‑‑‑‑‑
bmpinhibitor(cc)-++++++++tgfβinhibitor（repsox）
‑‑
+++++++wnt3a
‑‑‑
++++++egf
‑‑‑‑
+++++fgf2
‑‑‑‑
+++++vegf
‑‑‑‑‑
++++nic
‑‑‑‑‑‑
+++atra
‑‑‑‑‑‑‑
++lca
‑‑‑‑‑‑‑‑
+对比4 阶段5的对比去除该阶段的培养基中任何一种组分，如表3所示，图25是组分对成熟肝脏标志物alb表达水平的影响，可见只有方案a采用本发明的培养基alb表达水平最高，缺少任一组分或者选用其他的诱导试剂，将降低肝脏标志物表达水平。
70.图26是组分对药物代谢标志物cyp3a4表达水平的影响，也只有方案a采用本发明的培养基cyp3a4表达水平最高，缺少任一组分或者选用其他的诱导试剂，将降低药物代谢标志物表达水平。
71.表3 不同阶段5培养方案组分abcdefghinotchinhibitor(dapt)
‑‑‑‑‑‑‑‑
+bmp7
‑‑‑‑‑‑‑
+-fgf19
‑‑‑‑‑‑
+
‑‑
hgf
‑‑‑‑‑
+
‑‑‑
osm+++++
‑‑‑‑
xmu-mp-1++++
‑‑‑‑‑
α1-adrenoceptoragonist(mx)+++
‑‑‑‑‑‑
mk4++
‑‑‑‑‑‑‑
pkaagonist(camp)+
‑‑‑‑‑‑‑‑
mk125+
‑‑‑‑‑‑‑‑
表4 试剂列表
试剂耗材名称公司（货号）mtesr1stemcell(85850)y-27632sigma(scm075)rpmi1640gibco(31870082)f12gibco(11765062)william’segibco(22551022)accutase-edtainnovativecelltechnologies(12605010)stem-cellbanker(dmso-free)amsbio(11890f)hepatozymegibco(17705021)ksrgibco(10828010)itsgibco(41400045)glutamaxsupplementgibco(35050061)hepesgibco(15630080)rhactar&d(338-ac)rhfgf2r&d(233-fb)rhfgf4r&d(235-f4)rhegfr&d(236-eg)rhvegfr&d(dve00)rhwnt3ar&d(5036-wn)rhosmr&d(295-om)ccsigma(171261)chir99021sigma(sml1046)nicsigma(n0636)atrasigma(r2625)lcasigma(l6250)repsoxsigma(r0158)8-br-campsigma(b5386)xmu-mp-1sigma(sml2233)mk4sigma(v9378)mk125sigma(s1322)mxsigma(m6524)matrigel(gfr)biocoat(356231)quantichrom
™
ureaassaykitbioassaysystems(diur-100)humanalbuminelisakitbethyllaboratories(e88-129)rifsigma(r3501)omepsigma(19329)pbcayman(9001494)dmsosigma(d2650)p450-glo
™
cyp3a4assaypromega(v8801)p450-glo
™
cyp2b6assaypromega(v8321)p450-glo
™
cyp1a2assaypromega(v8771)celltiter-glo
®
3dcellviabilityassaypromega(g9683)humanprimaryhepatocytelonza(hucpi)aflatoxinb1sigma(32754)chlorpromazinesigma(1125006)amiodaronesigma(1027302)
gapdhforward:acatcgctcagacaccatgseqidno:1 reverse:tgtagttgaggtcaatgaagggseqidno:2afpforward:ctgcaattgagaaacccactgseqidno:3 reverse:ttccctcttcactttggctgseqidno:4albforward:cctgattactctgtcgtgctgseqidno:5 reverse:attctgaggctcttccacaagseqidno:6ck18forward:aaagcctgagtcctgtcctttcseqidno:7 reverse:gaccggtagttggtggagaagseqidno:8sox9forward:aggaagtcggtgaagaacggseqidno:9 reverse:aagtcgatagggggctgtctseqidno:10cftrforward:actggagcaggcaagacttcseqidno:11 reverse:cttgctcgttgacctccactseqidno:12sstr2forward:tgagcagggaaacgtaatttggseqidno:13 reverse:gcttggcttgccagctattgseqidno:14表7 抗体列表
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：s1、诱导人多能干细胞分化形成定形内胚层；s2、使用bmp抑制剂、fgf4、wnt信号激活剂诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；s3、将前肠管衍生物消化为单细胞，依次使用tgfβ抑制剂、sirt1抑制剂、vegf、fgf2、wnt信号激活剂、egf组合物与rar核受体激动剂、sirt1抑制剂、石胆酸lca组合物，使前肠管单细胞增殖、分化为匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；s4、使用 mst1/2的抑制剂、α1-肾上腺素能受体激动剂、甲萘醌4 mk4、 camp激活剂、地塞米松mk125组合物实现多谱系肝类器官的药代成熟化。2.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤s2中，所述bmp抑制剂为cc、noggin或ldn193189中的任一种，所述wnt信号激活剂为chir99021或wnt3a。3.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤s3中，所述tgfβ抑制剂为repsox、a83-01或sb431542中的任一种，所述sirt1抑制剂为nic，所述wnt信号激活剂为wnt3a或chir99021，所述rar核受体激动剂为全反式维甲酸atra。4.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤s4中，所述mst1/2的抑制剂为xmu-mp-1，所述α1-肾上腺素能受体激动剂为甲氧胺mx，所述camp激活剂为8-br-camp。5.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：步骤s1具体包括如下步骤：s11、将人多能干细胞在添加有rhacta、rhbmp4和chir99021的rpmi-1640培养基中培养1d；s12、再将s11步骤中得到的细胞在添加有rhacta、rhfgf2和ksr的rpmi-1640培养基中培养1d；s13、再将s12步骤中得到的细胞在添加有rhacta、rhfgf2和ksr的rpmi-1640培养基中培养1d；且ksr的浓度大于s12中ksr的浓度。6.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：在步骤s2的培养天数为4d，在步骤s3的培养天数为9d，在步骤s4的培养天数为8d。7.根据权利要求1所述的多谱系肝脏类器官的构建方法，其特征在于：将步骤s2得到的前肠管衍生物消化为单细胞可作为肝类器官的二级种子细胞，支持冻存与复苏。8.一种由权利要求1-7任一项所述的方法构建的多谱系肝脏类器官，其特征在于：所述多谱系肝脏类器官具有以下特征：1）形态匀质、尺寸匀一，大小为150-200μm的球形结构；2）产物包含肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、肝巨噬细胞；3）高表达关键药物代谢酶cyp3a4与多药耐药基因mdr1。9.一种如权利要求8所述的多谱系肝脏类器官作为高通量药物筛选的用途。10.一种用于多谱系肝脏类器官的诱导分化组合物，其特征在于：包括：1）诱导分化前肠管衍生物组合物：bmp抑制剂、fgf4、wnt信号激活剂；2）肝脏多谱系特化组合物：前期分化组合物：tgfβ抑制剂、sirt1抑制剂、wnt信号激活剂、vegf、fgf2和egf；
后期分化组合物：rar核受体激动剂、sirt1抑制剂、lca；3）药代成熟组合物：mst1/2的抑制剂、α1-肾上腺素能受体激动剂、mk4、camp激活剂、mk125。11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于：在1）诱导分化前肠管衍生物组合物中，bmp抑制剂为cc，wnt信号激活剂为chir99021；在2）肝脏多谱系特化组合物中，前期分化组合物：tgfβ抑制剂为repsox，sirt1抑制剂为nic，wnt信号激活剂为wnt3a；后期分化组合物：rar核受体激动剂为atra，sirt1抑制剂为nic；在3）药代成熟组合物中，mst1/2的抑制剂为xmu-mp-1，α1-肾上腺素能受体激动剂为mx，camp激活剂为8-br-camp，还包括osm。

技术总结
本发明提供了一种多谱系肝脏类器官及其构建方法和应用，该方法采用特定的培养基，实现内胚层分化到前肠管衍生物，再到肝脏多谱系特化，最后实现肝脏类器官的药代成熟。通过该方法构建肝脏类器官诱导周期短、培养体系相对简单，操作难度比较小，且采用无血清诱导分化体系，被病原微生物污染的风险低。另外，该方法得到的多谱系肝脏类器官可作为高精准度药筛模型。模型。模型。


技术研发人员：吴迪 葛啸虎 曹宁 王莉莉 徐迎 王思思 李慧芳 罗晓琴
受保护的技术使用者：天九再生医学（天津）科技有限公司
技术研发日：2022.02.09
技术公布日：2022/3/8