基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒

基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于医学和临床生物技术领域，具体涉及诊断装置和方法，并特别涉及化学发光免疫分析技术和易于检测和/或监测水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白igg、iga和igm存在的试剂盒及方法。


背景技术：

2.水痘-带状疱疹病毒(vzv)，被称为人类疱疹病毒-3型(hhv-3)，其和单纯疱疹病毒(hsv)均属于α-疱疹病毒科亚科。vzv是一种双链dna(125kb)病毒，由直径120nm的二十面体衣壳组成，且被脂质包膜包围。此病毒可导致儿童、青少年和年轻人的水痘疾病或水痘，被治愈后病毒仍可潜伏在人体中。直到成年或老年时，潜伏病毒可复发导致带状疱疹。水痘在成年人中发病率较低，但在孕妇和免疫功能低下的成年人中很常见，这些人都是高危人群。
3.虽然vzv属于具有轻度症状的疾病，但其相关疾病致病率高，可能危及生命，这主要与长期病毒性神经毒性有关，包括智力发育障碍、水痘病例中水痘脑膜脑炎和感染后脑病以及血管炎(神经系统综合征)、带状疱疹病例中无疹性带状疱疹和带状疱疹后神经痛(难以治疗)。目前，早期的vzv诊断方法较为缺乏，导致治疗延迟，最终导致死亡，特别是在vzv感染率极高的温带地区，特别发生在新生儿、老年人、器官移植接受者和免疫功能低下的人群中。
4.如今，vzv疫苗接种使得原发性水痘-带状疱疹病毒感染(pr-vzv-in)的发病率显著下降，尤其是在实施疫苗接种计划且执行良好的国家(两剂)。这使得住院治疗减少，而实验室的常规生物诊断更重要。在这些国家中，如果有评估igg、iga和/或igm的vzv生物测试，则已经重新规定，更多地要求已经暴露于vzv的孕妇、手术或器官移植前的危重患者、免疫功能低下的人和接种前和接种后的人，包括医院从业者评估igg、iga和/或igm，以便在免疫接种计划评估的独特背景下评估其免疫力。常规的vzv诊断与疫苗评估一样重要。事实上，许多报告假设，水痘特异性疫苗的实施将伴随疫苗后水痘带状疱疹(ps-vzv)或带状疱疹的病例增加，这表明在带状疱疹疫苗接种中，在常规流行病学监测中使用抗体检测测试引起了人们极大的兴趣。在许多其他国家，例如中国和挪威，抗vzv的疫苗项目尚未实施，或vzv疫苗接种覆盖范围不均匀，快速的病例诊断至关重要。在这些国家中报道水痘感染病例，尤其是报道发生在学校、机构、医疗中心或医院等公共地区的水痘感染病例，将防止迅速传染给易感人群(孕妇、新生儿、免疫功能低下人群)，从而防止他们进展为感染并发症，更重要的是较为容易控制疫情爆发，因为诊断延迟可能是致命的。此外，鉴于实施疫苗接种计划，或扩大现有疫苗接种计划的覆盖范围的目的，对接种疫苗前免疫力的评估是疫苗接种成功实施的关键。因此，非常需要对vzv感染的免疫学诊断。
5.在已经建立和未实施抗vzv疫苗项目的国家都需要通过igg、iga和igm抗体(或免疫)评估诊断vzv感染。常规生物诊断已经变得具有挑战性，因为目前在实验室使用的诊断测试的敏感性和特异性都是有限的。目前，市场上缺乏高度灵敏的免疫诊断测试，或没有广泛使用，甚至更多未被批准用于临床使用。实际上在过去的十年里，已经开发了一些具有可
变敏感度的生物诊断检测，用于检测vzv特异性igg，以及程度较小的iga、igm或多克隆抗体，但其中大部分免疫球蛋白型抗体检测敏感性较低，包括直接荧光抗体(dfa)(60％-80％)和基于免疫荧光分析(ifa)以及酶免疫分析(eia)的tzanck涂片诊断试剂盒(42％-90％)。使用病毒培养分析的vzv检测导致高毒性和污染，影响诊断结果，假阴性较为常见(46％敏感性)。此外，这些生物诊断方法通常是劳动密集型和耗时的，需要细致的标本收集和高度训练有素的技术人员。那些具有高检测敏感性和特异性(分别约97.8％和96.8％)的检测方法，包括基于糖蛋白的酶联免疫吸附测定(gpelisa)或水痘带状疱疹糖蛋白igg酶免疫测定与参考时间分辨荧光免疫测定(vzv trfia)，vzv igg糖蛋白测定，用于检测血清vzv igg(merck gpeia)，但并不广泛或商业使用。
6.尽管分子诊断(包括从囊泡液培养物和拭子样品中分离的dna病毒)和核酸检测(pcr)是在vzv诊断中最灵敏的，但仍需在vzv流行病学监测过程中进行抗体评估(因为囊泡皮疹并不会在感染的任何时间都出现，因此可能影响pcr结果)和疫苗接种控制的有效性。此外，基于临床表现的主要诊断方法并不是100％可靠的，因为有许多其他疱疹疾病，包括hsv，也同样存在相似症状。综上所述，迫切需要高敏感性和特异性的商业分布广泛的测试用于常规vzv诊断。因此，近期高敏感性的诊断技术更引人注目。
7.基于化学发光免疫测定(clia)的方法来诊断血清/血浆病毒抗原特异性免疫球蛋白，包括igg、iga和igm，已经取得了更好的诊断性能。目前，因其动态范围广、定量表达结果敏感性和特异性高、自动化、能够使用不同样品测试板等特点，化学发光技术已得到广泛应用。因此，这些特性使clia成为临床实验室中进行疾病诊断的最先进技术。有趣的是，在当前sars-cov-2的常规诊断背景下，我们和其他人员开发出了基于clia的可商用的方法，用于诊断和监测covid-19，并取得了令人满意的成绩。鉴于此，本发明对于诊断vzv感染和相关疾病非常有益。特别是，我们在本发明中开发了基于化学发光免疫测定(clia)的诊断试剂盒，能够高敏感性和特异性的从血清和/或血浆中检测vzv特异性igg、iga和igm。


技术实现要素：

8.为提供具有高敏感性、特异性的水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒，本发明提供以下技术方案：
9.一方面，本发明提供获得水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的方法，其包括：
10.(a)构建携带编码水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的基因的重组质粒，任选地所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；
11.(b)将步骤(a)获得的重组质粒转化到dh10bac细菌中获得重组杆状病毒；
12.(c)用步骤(b)获得的重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞，表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e，任选地，还包括将培养后的病毒感染草地贪夜蛾hi5细胞进行扩大培养的步骤；
13.(d)纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。
14.在一些实施方案中，纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的方法选自膜过滤、透析、第一镍柱纯化、tev蛋白酶消化、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩。
15.在一些实施方案中，通过膜过滤、透析、第一镍柱纯化、tev蛋白酶消化、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。
16.另一方面，本发明提供水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒，其包括根据上述方法获得
的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。
17.另一方面，本发明提供水痘-带状疱疹病毒特异性抗体检测试剂盒，其包括根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。
18.在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括生物素化试剂，所述生物素化试剂用于生物素化根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。
19.在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括抗人iga、igg或igm抗体。
20.在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括化学发光化合物，所述化学发光化合物选自鲁米诺衍生物、吖啶酯、胶体金和荧光微球。
21.在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括用于固定生物素化的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的磁珠。
22.在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括牛血清白蛋白，用于饱和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e，任选地，所述牛血清白蛋白的浓度为2％(按重量计)。
23.在一些实施方案中，所述检测试剂盒还包括硫酸，用于终止反应。
24.另一方面，本发明提供根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e在制备水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒或水痘-带状疱疹病毒特异性抗体检测试剂盒中的用途。
25.另一方面，本发明提供上述的水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒或水痘-带状疱疹病毒特异性抗体检测试剂盒在制备水痘-带状疱疹病毒中和抗体产品中的用途。
26.另一方面，本发明提供诊断水痘-带状疱疹病毒的方法，所述方法包括利用上述检测试剂盒检测受试者血液中igg、iga和igm的表达水平。
27.有益效果
28.本发明提供基于化学发光免疫分析法的水痘-带状疱疹病毒感染诊断检测试剂盒，可以对水痘-带状疱疹病毒进行高敏感性和特异性的检测，降低假阴性和假阳性的出现。在本发明中，如果不把中间数值样本计入阳性，则本发明的试剂盒检测敏感性在90％以上，特异性在97％以上，总体一致性在96％以上。
附图说明
29.图1示出构建pi-sumostat-his-ge的示意图。vzv-ge序列帽端为多面体启动子(pph)、信号肽序列(gp67)、his-sumostar-标签和tev消化位点。vzv-ge特异性引物用小粉红色三角形表示；pi-sumostar特异性引物用小橙色三角形表示。
30.图2示出vzv-ge蛋白的凝胶色谱纯化。
31.图3示出通过sec柱高度纯化的vzv-ge(≈57.6kda)的sds-page分析。
32.图4示出基于clia方法的vzv-ge特异性igg(图4a)、iga(图4b)和igm(图4c)检测。随机选择29例患者样品，并进行2倍连续稀释8次(从1/20开始)，使用自动clia评估纯化的vzv-ge蛋白检测igg和igm抗体的能力。利用graphpad prism 5对所有患者的相对光单位(rlu)进行变换和拟合。阴性对照为黑色曲线，基于elisa的可疑患者为粉紫色，阳性患者为红色。rlu：相对光单元。
33.图5示出vzv-ge特异性igg、iga和igm检测试剂盒的诊断特性。从42个elisa阳性样品中获得检测针对vzv-ge蛋白的抗igg抗体的接受者操作特征曲线(roc)分析，不管可疑患者样品如何。
34.图6示出患者队列中vzv-ge特异性igg、iga和igm检测结果和抗体水平。高阳性(来自21个患者的42个样品)和可疑(来自8个患者的20个样品)患者中特异性vzv血清抗体水平分析显示不同水平的igg(a)、iga(b)和igm(c)抗体滴度，由相对光单位(rlu)定义。每个分布中的黑条表示平均值，分别与平均值的标准误差(sem)相关。虚线表示截止值(igg[a]》23450，iga[b]》78662和igm[b]》89634)。rlu：相对光单元。
具体实施方式
[0035]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0036]
实施例1样品选取及处理
[0037]
1.样品选取
[0038]
为实现本发明的目的，需要两种类型的样品，包括实验组样品与对照样品。实验组样品是指疑似感染vzv的患者的样品，最好是呈现vzv感染明显症状的患者，更优选是基于elisa或pcr分析确诊阳性诊断结果的患者的样品。对照样品是指未感染vzv的患者的样品，优选是未接种任何vzv疫苗的健康人群。采样需有每个患者的同意协议，并应根据伦理惯例进行研究。
[0039]
2.样品处理
[0040]
本发明使用人临床样品，优选人血液样品进行，且已经获得了伦理委员会的批准。血液样品从患者和对照人群的前臂穿刺获得，放入edta或肝素盐(或肝素)真空管中。采用ficoll(密度：1.077)的密度梯度分离法通过离心处理血液样品分离血清和血浆。在采集的总血液沉淀至少1小时后，可通过沉淀法获得血清和血浆分离物。分离的血清和血浆可以长期保存在-20℃下，但优选储存在-80℃。
[0041]
实施例2表达重组his-sumostar-vzv-ge蛋白的杆状病毒表达系统的构建
[0042]
1.构建携带vzv-ge序列的重组转化载体
[0043]
为实现本发明的目的，获得编码vzv的vzv-ge成熟细胞外区域的基因序列，使用以下正向和反向引物获得登陆号mh709377.1(seq id no:1)的vzv-ge细胞外结构域；5
’‑
atttccaaggttcttccgtcttgcgatacgatgattttcacatc-3’(seq id no:2)和5
’‑
gacaagcttggtacttaatatcgtagaagtggtgacgttccggg-3’(seq id no:3)。同时，组氨酸标签修饰的转化载体pi-sumosec-star-his通过以下引物线性化(正向:5’cttctacgatattaagtaccaagcttgtcgagaagtactagagg3’(seq id no:4)和反向:5’tatcgcaagacggaagaaccttggaaataaagattctcgctgcc3’(seq id no:5))，所述引物包含重叠vzv-ge 5’和3’端序列的序列。每个pcr混合物都含有0.5mm的每种引物和0.2mm的每种dntp(脱氧核苷酸三磷酸)。对于pcr扩增，模板最初在98℃变性5min，然后扩增30个循环，变性(98℃15秒)、退火(68℃15秒)和延长(72℃1.5或5分钟)，之后72℃延长10分钟。根据gibson组装方法，纯化的目标基因pcr产物和线性载体pcr产物在50℃下连接1小时后，转化dh5α。紧接着通过pcr和dna测序证实pi-sumo-star-his-ge已成功构建。图1示出了pi-sumo-star-his-ge构建体的图谱。
[0044]
2.获得重组杆粒
[0045]
将上述转化载体经dh10bac大肠杆菌转入重组vzv-ge杆粒，纯化后转染sf9昆虫细胞，根据invitrogen公司的bac-to-bac方法(杆状病毒表达载体系统-bevs)转化sf9昆虫细
胞。对于本发明，使用1-2ng纯化的重组转化载体构建体(pi-sumo-star-his-ge)转化100μl的dh10bac细胞。37℃孵育48小时后，用含有卡那霉素(50μg/ml)、四环素(10μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、x-gal(100μg/ml)和iptg(40μg/ml)的蓝-白培养皿筛选阳性菌落(白色菌落)。挑选单个较大的白色菌落并在新蓝白选择培养皿上重新划线培养，并在37℃孵育48小时。一旦在选择板上确认了白色菌落，就用如下制备的缓冲液1、2、3分离纯化vzv-ge重组杆粒：缓冲液1(15mm tris(8.0)、10mm edta、100μg/ml rnase a)；缓冲液2(0.2n naoh，1％sds)和缓冲液3(3m醋酸钾，ph 5.5)。分离纯化重组杆粒后，使用克隆引物seq id no:2-3或m13引物，或两者进行pcr和dna测序验证。对于每次pcr验证，配制50μl的反应溶液，其中包含0.2mm dntp，0.25mm的正向和反向引物和1
×
pcr缓冲液中的1个单位dna聚合酶。使用的m13的正向和反向引物序列如下：5
’‑
cccagtcacgacgttgtaaaacg-3’(seq id no:6)和5
’‑
agcggataacaatttcacacagg-3’(seq id no:7)。对于在pcr验证程序，模板最初在94℃变性约5分钟，然后扩增25个循环变性，(94℃45秒)、退火(55℃45秒)和延长(68℃90秒)，最终68℃延长10分钟。
[0046]
3.产生重组杆状病毒
[0047]
一旦产生杆粒，就用于感染昆虫细胞以产生表达蛋白的病毒。在本发明中，纯化的vzv-ge重组杆粒用于昆虫细胞培养基中(感染草地贪夜蛾(sf9)昆虫细胞。重组杆粒转染sf9细胞根据invitrogen公司的bac-to-bac bevs方法进行。转染后的细胞需要在27℃无菌培养箱中孵育3-5天，通过离心(1500rpm 20分钟)收集重组vzv-ge杆状病毒并保持在4℃。第一批病毒会从p0扩增到p4，然后对p4病毒原液进行滴定实现大规模最佳蛋白表达。
[0048]
实施例3vzv-ge蛋白的表达和纯化
[0049]
1.重组his-sumostar-vzv-ge蛋白表达
[0050]
当处于最佳表达条件时，用滴度为1/500的p4病毒原液感染每毫升2
×
106草地贪夜蛾(trichoplusia ni)(high five，hi5)细胞，并在27℃的自旋摇床中孵育。培养基中不含有血清，只含青霉素和链霉素(ps)作为抗生素。大约3至4天后停止细胞培养，通过离心培养物(高速运转30分钟)(转速是5000g)收集表达的重组蛋白，从而进行之后的蛋白纯化。
[0051]
2.纯化重组vzv-ge蛋白
[0052]
重组vzv-ge蛋白的纯化步骤包括膜过滤、透析、第一镍柱纯化、tev蛋白酶消化结合透析、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩。
[0053]
a.膜过滤和透析
[0054]
感染后三到四天，在5000g下离心细胞培养物20分钟，收集含有表达蛋白的上清液，加入蛋白酶抑制剂。然后通过0.2μm滤膜过滤，并使用透滤膜(vivaflow 50/200，5kda)浓缩滤液。过滤过程需要在冰上进行。然后使用14kda透析膜在冷凝胶过滤缓冲液(gfb：250mm氯化钠，20mm tris-hcl，ph8.0)中且在4℃透析过夜。
[0055]
b.第一镍离子(ni
2+
)-螯合柱纯化
[0056]
透析后，透析液被加入预处理的镍离子(ni
2+
)-螯合物柱。加入前，先用3倍柱体积(cv)无菌去离子蒸馏水(ddh2o)清洗螯合柱，并用5倍柱体积的低离子强度ni
2+
柱结合缓冲液(缓冲液nb：250mm氯化钠，14mm咪唑，20mmtris-hcl，ph 8.0)平衡螯合柱。在将透析液加入柱后，用50ml缓冲液nb洗涤柱，再在fplc快速液相色谱仪(ge生命科学akta fplc)上用一个100ml从0-100％的高离子强度ni
2+
柱洗脱缓冲液(缓冲液eb：250mm nacl，400mm咪唑，
20mm tris-hcl，ph 8.0)，流速为2.5ml/min进行洗脱。每个峰值对应的洗脱组分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(如图2和图3所示)。
[0057]
c.tev蛋白酶消化和第二次透析
[0058]
收集重组vzv-ge蛋白对应的洗脱组分并汇集在一起，进行tev蛋白酶消化去除sumostar标记。在2mm dtt、1mm edta和2mg/ml tev蛋白酶存在下进行重组蛋白消化反应。消化反应与透析在4℃同时进行，并加入gfb缓冲液，以交换缓冲液并去除dtt和edta。然后透析液进行第二个洗脱镍柱，从而将vzv-ge与sumostar标签分离。
[0059]
d.第二镍离子(ni
2+
)-螯合柱纯化
[0060]
根据体积将透析液加入特定回路(50-150ml)，用缓冲液nb注入预处理后的ni
2+
螯合柱中。vzv-ge蛋白会被收集在含有10％的缓冲液eb的洗涤床中。收集纯化的vzv-ge蛋白对应的洗脱组分，汇集在一起，并用30kda浓缩管，例如超离心过滤器(millipore,billerica,ma)浓缩。
[0061]
e.凝胶过滤层析和超离心浓缩
[0062]
用30kda浓缩管，例如ultra离心过滤装置(millipore，billerica，ma)将上述从第二ni
2+
螯合柱获得的vzv-ge蛋白的eb缓冲液交换为hbs缓冲液(250mm nacl，20mm hepes，ph 8.0)。用三倍管体积的eb缓冲液通过浓缩柱来交换缓冲液。将5ml浓缩的vzv-ge蛋白加入预处理的superdex-200 75
tm
柱(ge healthcare)上。在层析之前，用2倍柱体积的ddh2o洗涤superdex-200 75
tm
柱，并且用2倍柱体积的hbs缓冲液平衡预处理superdex-200 75
tm
柱。用hbs以1ml/min的流速洗脱vzv-ge蛋白。收集紫外峰值对应的洗脱体积，汇集在一起，使用ultra离心过滤装置(millipore,billerica,ma)浓缩。然后用scandrop(德国耶拿)对浓缩蛋白进行如下定量：
[0063]
蛋白质浓度＝od
280
×
10/蛋白质吸光度；abs＝1.474
[0064]
所有层析步骤均使用fplc系统在4℃下进行，该系统可以是或prime plus(ge healthcare)设备。洗脱曲线的数据点以ascii文件的形式从连接计算机的设备中导出，并使用graphpad prism 5重新绘制。
[0065]
f.sds-page vzv-ge蛋白表征
[0066]
在每个纯化步骤中，样品等分，与1
×
sds染料缓冲液混合(50mm tris-hcl，2％sds，0.1％溴酚蓝，10％甘油，1％巯基乙醇)，煮沸2～5分钟。通过电泳凝胶(10％聚丙烯酰胺)迁移后，考马斯蓝染色，并通过煮沸去除染色后，用灯箱显示蛋白条带，用集成相机拍照保存(图3)。纯化后的vzv-ge蛋白在液氮中快速冷冻，并在-80℃保存，用于后续实验。具体来说，纯化的蛋白被用于开发基于化学发光免疫分析法(clia)的诊断试剂盒。
[0067]
实施例4酶联免疫吸附试验(elisa)
[0068]
1.在本研究中，使用改良过的elisa(abcam ab108781、ab108782和ab108783)用于检测vzv感染，并对本研究中的所有患者样品进行检测。这个测试将作为确认这些患者是否呈vzv阳性的标准。具体来说，用纯化的100μl磷酸盐缓冲液(pbs)中的0.2μg/ml ge蛋白在4℃包被96孔微升酶联免疫吸附试验板过夜(≥15h)。每孔用260μl pbs稀释的5％脱脂牛奶(pbsm)室温封闭2小时，用260μl补充有0.1％吐温-20的pbs(pbst)洗涤3次后，在每个样品中加入4倍连续稀释的血浆和血清，并在温和(≤100转/分钟)自旋轨道摇床中室温下孵育1
小时。用pbst洗涤3次后，向每个孔中加入100μl 1：5000稀释的hrp抗人igg抗体，在定轨摇床上室温孵育1小时。最终，用pbst洗涤4次后，加入100μl tmb(beyotime)进行显色反应，室温下避光保持5-8分钟，用50μl的h2so4(1m)终止显色反应。用酶标仪在od450读取荧光值。每个elisa样品重复3次，用graphpad prism 5软件作图。通过测定稀释1/100的od450来评估患者的结果。当od450≥1时为阳性，当od450在0.1和0.2之间时为可疑，当od450《0.1时为阴性。考虑到背景，从每个样品结果的od值中扣除未加血清的空白样品的od值。
[0069]
实施例5vzv诊断试剂盒开发
[0070]
1.生物素化
[0071]
利用vzv-ge蛋白开发vzv特异性igg、iga、igm免疫诊断试剂盒。在本发明中，使用ez-link sulfo-nhs-lc-lc-biotin，no-weigh format kit(thermo fisher)按照制造商的说明书对纯化的vzv-ge蛋白进行生物素化。简单地说，使用稀释到2ml hbs缓冲液中的1至10mg vzv-ge纯化蛋白。任选地，在纯化后使用ultra离心过滤装置(millipore，billerica，ma)将缓冲液hbs更换为缓冲液pbs。无论是缓冲液hbs还是pbs，生物素化蛋白的方案/方法都是相同的。对于每个生物素化反应，在室温下，向预热的小管中加入150μl的ddh2o制备10mm的生物素试剂溶液。每管试剂一次需用完。从制造商提供的配方中得到准确的10mm生物素试剂溶液与所需量的vzv-ge蛋白混合。生物素化反应在4℃下过夜进行。之后，使用30kda浓缩管，例如ultra离心过滤装置(millipore，billerica，ma)除去多余的生物素。使用缓冲液pbs或hbs清洗过量的未反应生物素得到最终体积约0.5-1ml的生物素化的vzv-ge蛋白。通过常规酶联免疫吸附分析(elisa)的初步测试来评估生物素蛋白标记是否成功。
[0072]
2.生物素化评估(elisa)
[0073]
进行elisa，评估生物素标记vzv-ge蛋白是否成功。用生物素化的vzv-ge蛋白包被96孔微升的elisa板。将100微升1:5000稀释后的hrp缀合的链霉亲和素加入预先用pbst清洗过的封闭标记蛋白中，在温和的定轨摇床中孵育1小时。之后，当用pbst洗涤4次后，加入100μl的tmb(beyotime)进行显色反应，并室温下避光保持5-8分钟。最后加入50μl的h2so4(1m)从而终止反应，再用酶标仪在od450读取荧光值。
[0074]
3.磁珠固定
[0075]
根据制造商的说明书，使用invitrogen dynabeadstm myonetms streptavidin c1试剂盒(thermo fisher)将生物素标记的vzv-ge蛋白固定在磁珠上。固定方案之后略有修改以优化效果。简单地说，将40μg的生物素化蛋白固定在1mg的磁珠上，而不是根据制造商所提供的每mg磁珠固定20μg蛋白。反应在4℃下过夜或在室温下振荡至少1小时，然后用pbs稀释10-20次。
[0076]
为了避免与非特异性免疫复合物形成相关的背景噪音，我们使用了多种封闭缓冲液。但当没有特异性免疫复合物形成时，在本发明中，优选使用牛血清白蛋白(bsa)来饱和抗原底物和游离金属珠。在本发明中，使用2％的bsa开发检测试剂盒。
[0077]
4.抗人抗体免疫球蛋白(ig)同种型g、a和m
[0078]
为了对抗vzv-ge抗体和vzv-ge蛋白形成的免疫复合物进行特异性检测和定量，每个开发的试剂盒分别使用抗人抗体igg、iga和igm。这些第二抗体与吖啶酯(一种化学发光发色团)结合，当形成免疫复合物时，特别是当vzv-ge特异性igg、iga或igm被vzv-ge蛋白捕
获时，吖啶酯可以发光。本试剂盒包含了vzv-ge特异性igg、iga和igm用于clia的所有组成部分，且被称为vzv-ge-igg、vzv-ge-iga和vzv-ge-igm诊断试剂盒。
[0079]
5.化学发光信号收集和数据分析(图4和图5)
[0080]
检测到的在背景信号上的化学发光信号计算为相对光单位(rlu)。rlu的测量采用全自动化学发光免疫分析仪kaeser 1000(康润生物科技，中国广州)进行。
[0081]
首先，对所有阳性患者和健康患者的血清/血浆进行两倍连续稀释(从1:400开始稀释)，以评估vzv-ge-igg、vzv-ge-iga和vzv-ge-igm诊断试剂盒的准确度和适当的稀释度。其次，进一步进行clia检测，确定vzv-ge-igg、vzv-ge-iga、vzv-ge-igm诊断试剂盒的检测特性。
[0082]
6.统计分析(图4、5、6和表1)
[0083]
采用medcalc软件进行受试者工作特征(roc)的分析，从而确定vzv-ge-igg、vzv-ge-iga、vzv-ge-igm检测试剂盒的最佳截止值(诊断标准)并评价其诊断特征，在本发明中，igg的截止值为23450，敏感性为95.2％，特异性为100％；iga的截止值为78662，敏感性为95.2％，特异性为98.0％；igm的截止值为89634，敏感性为97.6％，特异性为98.9％。因此，vzv-ge特异性igg、iga、igm检测试剂盒的特异性和敏感性根据以下公式确定。
[0084]-特异性(％)＝100
×
[真阴性数/(真阴性数+假阳性数)]；
[0085]-敏感性(％)＝100
×
[真阳性数/(真阳性数+假阴性数)]。
[0086]-总体一致性(％)＝(真阴性数+真阳性数)/总测试数。
[0087]
使用mann-whitney检验评估原发性水痘和带状疱疹感染之间vzv ge特异性igg、iga或igm水平的任何显著变化。采用kruskal-wallis方法进行方差分析(anova)检验，以评估阳性、可疑和阴性三个独立组之间的抗体水平的差异。p值小于0.05表示具有统计学显著性差异。所有上述分析都集成到graphpad prism5软件中，并通过graphpad prism5软件进行计算。
[0088]
图6说明几乎所有可疑患者的igg水平相关rlu值都低于确定的截止值(《23450)，尽管与阴性对照显著不同(p《0.001)(图6a)，而可疑患者rlu-相关iga水平为阴性，低于确定的截止值(图6b)。然而，vzv ge特异性igm检测试剂盒显示，与来自elisa的最可疑结果相反，几乎所有可疑样品都被归类为igm检测的真阳性(图6c)。总的来说，与elisa相比，这些诊断试剂盒可以检测较低的免疫球蛋白浓度。这些结果表明，基于clia的诊断试剂盒在诊断水痘-带状疱疹方面优于elisa诊断测试，尤其是组合使用时。
[0089]
表1每种vzv-ge特异性igm、iga和igg试剂及其组合对诊断水痘-带状疱疹病毒感染的敏感性、特异性和总体一致性。
[0090]
表1.
[0091][0092][0093]
如果把那些中间数值的样本当成阳性样本用*表示，如果不把这些中间数值样本计入阳性用
#
表示。真阴性就是发明人找的阴性对照，真阳性就是发明人依据临床指标收集到的患者样本，假阳性就是阴性对照中测出来的阳性，假阴性是在患者样本中测出来的阴性。
[0094]
序列表
[0095]
seq id no：1vzv糖蛋白e的核苷酸序列
[0096]
tccgtcttgcgatacgatgattttcacatcgatgaagacaaactggatacaaactccgtatatgagccttactaccattcagatcatgcggagtcttcatgggtaaatcggggagagtcttcgcgaaaagcgtacgatcataactc
accttatatatggccacgtaatgattatgatggatttttagagaacgcacacgaacaccatggggtgtataatcagggccgtggtatcgatagcggggaacggttaatgcaacccacacaaatgtctgcacaggaggatcttggggacgatacgggcatccacgttatccctacgttaaacggcgatgacagacataaaattgtaaatgtggaccaacgtcaatacggtgacgtgtttaaaggagatcttaatccaaaaccccaaggccaaagactcattgaggtgtcagtggaagaaaatcacccgtttactttacgcgcaccgattcagcggatttatggagtccggtacaccgagacttggagctttttgccgtcattaacctgtacgggagacgcagcgcccgccatccagcatatatgtttaaaacatacaacatgctttcaagacgtggtggtggatgtggattgcgcggaaaatactaaagaggatcagttggccgaaatcagttaccgttttcaaggtaagaaggaagcggaccaaccgtggattgttgtaaacacgagcacactgtttgatgaactcgaattagacccccccgagattgaaccgggtgtcttgaaagtacttcggacagaaaaacaatacttgggtgtgtacatttggaacatgcgcggctccgatggtacgtctacctacgccacgtttttggtcacctggaaaggggatgaaaaaacaagaaaccctacgcccgcagtaactcctcaaccaagaggggctgagtttcatatgtggaattaccactcgcatgtattttcagttggtgatacgtttagcttggcaatgcatcttcagtataagatacatgaagcgccatttgatttgctgttagagtggttgtatgtccccatcgatcctacatgtcaaccaatgcggttatattctacgtgtttgtatcatcccaacgcaccccaatgcctctctcatatgaattccggttgtacatttacctcgccacatttagcccagcgtgttgcaagcacagtgtatcaaaattgtgaacatgcagataactacaccgcatattgtctgggaatatctcatatggagcctagctttggtctaatcttacacgacgggggcaccacgttaaagtttgtagatacacccgagagtttgtcgggattatacgtttttgtggtgtattttaacgggcatgttgaagccgtagcatacactgttgtatccacagtagatcattttgtaaacgcaattgaagagcgtggatttccgccaacggccggtcagccaccggcgactactaaacccaaggaaattacccccgtaaaccccggaacgtcaccacttctacgatat
[0097]
seq id no:2 vzv-ge细胞外结构域正向引物
[0098]5’‑
atttccaaggttcttccgtcttgcgatacgatgattttcacatc-3’[0099]
seq id no:3 vzv-ge细胞外结构域反向引物
[0100]5’‑
gacaagcttggtacttaatatcgtagaagtggtgacgttccggg-3’[0101]
seq id no:4组氨酸标签修饰的转化载体pi-sumosec-star-his正向引物
[0102]5’
cttctacgatattaagtaccaagcttgtcgagaagtactagagg3’[0103]
seq id no:5组氨酸标签修饰的转化载体pi-sumosec-star-his反向引物
[0104]5’
[0105]
tatcgcaagacggaagaaccttggaaataaagattctcgctgcc3’[0106]
seq id no:6m13的正向引物
[0107]5’‑
cccagtcacgacgttgtaaaacg-3’[0108]
seq id no:7m13的反向引物
[0109]5’‑
agcggataacaatttcacacagg-3’[0110]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e，获得水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的方法包括：(a)构建携带编码水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的基因的重组质粒，任选地所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；(b)将步骤(a)获得的重组质粒转化到dh10bac细菌中获得重组杆状病毒；(c)用步骤(b)获得的重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞，表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e，任选地，还包括将培养后的病毒感染草地贪夜蛾hi5细胞进行扩大培养的步骤；(d)通过膜过滤、透析、第一镍柱纯化、tev蛋白酶消化、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。2.根据权利要求1所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其包括生物素化试剂，所述生物素化试剂用于生物素化所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e。3.根据权利要求1或2所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其还包括抗人iga、igg或igm抗体。4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其还包括化学发光化合物，所述化学发光化合物选自鲁米诺衍生物、吖啶酯、胶体金和荧光微球。5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其还包括用于固定生物素化的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的磁珠。6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其还包括牛血清白蛋白，用于饱和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e，任选地，所述牛血清白蛋白的浓度为2％(按重量计)。7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒，其还包括硫酸，用于终止反应。8.水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e在制备基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒中的用途。9.根据权利要求1-7中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒在制备水痘-带状疱疹病毒中和抗体产品中的用途。

技术总结
本发明涉及基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒。自动化化学发光免疫检测技术可以检测水痘-带状疱疹病毒特定抗体，例如免疫球蛋白同种型G、A和M(IgG、IgA和IgM)，从而诊断与水痘-带状疱疹病毒感染相关的疾病。本发明的试剂盒同样适用于筛选各种疑似与VZV感染相关的疾病或症状的受试者。感染相关的疾病或症状的受试者。


技术研发人员：金腾川 阿诺德
受保护的技术使用者：中国科学技术大学
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2022/3/8