金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法

金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法。


背景技术：

2.基于dna的均相分析是指在均质溶液中进行的整个传感过程，与目标识别与耗时费力的传统非均相分析方法相比，均相分析方法简单、易于操作、快速，不需要固定和洗涤步骤。在电化学测试系统中具有很大的优势。
3.纳米酶是指具有酶样性质的纳米材料，因其突出的优点而成为研究热点，在生物传感和免疫分析领域显示出广泛的应用。其中，三维金属有机框架(mof)纳米酶在近十年来得到了迅速的发展。与3d体块mof纳米酶相比，2dmof纳米酶由于具有更大的表面积和更容易接近的活性位点以及更小的底物分子的扩散屏障，近年来受到越来越多的研究关注，二维mof纳米片的制备方法有溶剂热法、表面活性剂辅助合成和超声剥离等。与溶剂热法和表面活性剂辅助合成法对实验安全性和人员技能要求较高相比，超声法简单易行。
4.均相dna电化学试验一般在静态条件下进行，而均相电化学在动态流动条件下更有优势。流动系统能够实时更新相界面，既保证了试验的重现性，又能实现快速测定。均相电化学在流动条件下循环试验中的应用迄今尚未见报道。


技术实现要素：

5.1.要解决的技术问题
6.本发明的目的是为了解决现有技术中均相电化学在流动条件下循环试验中的应用迄今尚未见报道的问题，而提出的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法。
7.2.技术方案
8.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
9.金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，在均相溶液中采用双链特异性核酸酶辅助信号放大策略实现了信号放大，利用金属有机框架纳米酶的单链dna吸附能力对单链dna进行富集，并利用金属有机框架纳米酶的仿过氧化物酶活性实现信号的进一步放大，结合流动注射-间歇法实现了金属有机框架修饰的氧化铟锡电极的循环利用和目标物mirna的连续检测，从而实现了对mirna的连续均相检测；包括以下步骤：
10.步骤1：双链特异性核酸酶辅助信号扩增方案：亚甲基蓝标记的发卡dna序列被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温，形成发卡结构；在核酸扩增缓冲液中加入终浓度分别为0.15-0.5u和0.8-1.2μm的双链特异性核酸酶和上述发卡dna，再加入待测mirna样品，在45-60℃下孵育50-70min；然后将双链特异性核酸酶终止液加入上述溶液中终止信号扩增反应。
11.步骤2：采用流动注射-间歇法对目标物mirna进行连续检测：在流动模式下，将步
骤1中的溶液通过流动注射注入电化学分析池，并在间歇模式下孵育30-60分钟；然后通过流动注射法在电化学分析池内注入含有过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液；在间歇模式下利用三电极体系进行差分脉冲伏安法或线性伏安法或阻抗法检测，并得到电化学信号，根据电化学信号与mirna的浓度的关系求得待测物浓度。
12.步骤3：在流动模式下，以互补dna(cdna)为流动相对金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极的dna进行竞争洗脱；完成后，重复步骤1-3以进行下一轮mirna检测。
13.优选地，所述步骤1中反应体系为100μl，其中含有1
×
dsn缓冲液、0.2u dsn、0.8-1.2μm hp和不同浓度的靶标在50℃下孵育60min，然后将dsn终止液加入上述溶液中终止酶扩增反应。
14.优选地，所述1
×
dsn缓冲液包50mm tris-hcl，ph 8.0；5mm mgcl2、1mm dtt。
15.优选地，所述步骤2中ito电极使用前用丙酮、无水乙醇和大量去离子水依次洗涤ito电极，然后用n2吹干，将ito浸没在mof乙醇分散液(1mg/ml)中，取出然后自然干燥得到mof/ito，然后将dsn辅助信号放大反应后的溶液通过流动注射转移到mof/ito上，在37℃孵育40-50分钟，孵育后在流动模式下以磷酸盐缓冲溶液为流动相，冲洗mof/ito电极。然后通过流动模式在分析单元内引入含有过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液，在间歇模式下采用三电极体系记录生物传感器的dpv响应。
16.优选地，所述步骤2中dpv信号检测采用差分脉冲伏安法(dpv)测试在含有1-2mmh2o2的ph＝7.4的pbs缓冲溶液中进行扫描，生物传感器在5mmk3[fe(cn)6]
3-/4-溶液中与100mmkcl测定，采用cv和eis进行表征，在pbs缓冲溶液中扫描电位范围为0～-0.4v，扫描速率为100mv/s(vsag/agcl)。
[0017]
优选地，所述步骤2中在5mmk3[fe(cn)6]
3-/4-溶液中扫描电位cv范围为-0.2v～0.6v，扫描速率为100mv，eis的频率范围为0.1hz,10000hz，交流电压为5mv。
[0018]
优选地，所述步骤2中注射泵流速为20μl/min，持续20min。
[0019]
3.有益效果
[0020]
相比于现有技术，本发明的优点在于：
[0021]
(1)本发明通过超声法简单合成具有仿酶活性二维mof纳米酶，并将纳米酶应用于生物传感器，无需复杂的电极修饰过程，构建了高选择性，高灵敏度的电化学生传感器。
[0022]
(2)本发明设计了dsn酶辅助循环信号扩增方案，实现了目标物的循环，从而使得电化学信号得到放大，增加了灵敏度和选择性。
[0023]
(3)本发明创造性的将电化学生物传感器与流动检测相结合，采用流动间歇法实现了对mirna的流动检测，并实现了对电极的重复利用以及循环检测。
[0024]
(4)本发明构建的电化学生物传感器稳定性高，电极修饰近一个月后，仍能稳定检测目标物。
附图说明
[0025]
图1为本发明提出的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法中流动注射装置的结构示意图；
[0026]
图2为本发明提出的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法中合成的纳米酶的结构示意图；
[0027]
图3为本发明中co-mof纳米材料在原子力显微镜(afm)下的剖面显示图；
[0028]
图4为本发明中mof纳米酶的xrd谱图；
[0029]
图5为本发明中mof纳米酶活性验证图；
[0030]
图6为本发明中循环伏安图(cv)和电阻抗谱(eis)；
[0031]
图7为本发明中扩增产物在紫外光下拍照图；
[0032]
图8为本发明中生物传感器的dpv响应信号图；
[0033]
图9为本发明中一系列不同浓度目标物经过dsn酶循环后进行dpv信号检测的标准曲线图。
具体实施方式
[0034]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0035]
实施例1：
[0036]
金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，包括以下步骤：
[0037]
步骤1：dsn酶辅助信号扩增方案：为了形成发夹结构，将5’修饰亚甲基蓝的序列为5’—agtaggaaggcgaactatacaacctactacctca-3’的发卡dna被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温；在含有1
×
dsn缓冲液(50mm tris-hcl,ph 8.0；5mm mgcl2、1mm dtt)的100μl反应体系中，加入0.3-0.4u dsn、0.8-1.2μm hp和不同浓度的靶标在50℃下孵育60min，然后将dsn终止液加入上述溶液中终止酶扩增反应。
[0038]
实施例2：
[0039]
合成二维mof纳米酶。采用超声波法制备复合材料。首先将对苯二甲酸(0.75mmol)和cocl
2-6h20(0.375mmol)溶于含有二甲基甲酰胺(dmf，32ml)、乙醇(2ml)和水(2ml)的50ml试管中，超声处理。随后，将0.8ml三乙胺快速注入上述溶液中，搅拌5min，得到胶体悬浮液。超声处理8h(40khz)，离心，乙醇洗涤3次，真空干燥。最后，获得粉色的钴金属有机框架(co-mof)粉末，并在4℃下存储。将纳米酶材料稀释一定倍数，滴到铜网上，室温晾干后进行透射电镜扫描，对其形貌进行表征：如图2所示，合成的纳米酶为二维片状；原子力显微镜表征:如图3原子力显微镜(afm)剖面显示，co-mof纳米材料的表面厚度约为1nm，超薄，且表面光滑；通过xrd对合成co-mof进行表征：如图4所得产物的xrd图谱与文献报道一致(nature energy,2016,1(12))，表明co-mof合成成功。
[0040]
实施例3:
[0041]
mof纳米酶活性验证：将含有h
202
(1mm)、tetramethylbenzidine(tmb 0.5mm)和co-mof(1mg/ml)的磷酸盐缓冲液(10mm,ph 7.4)在室温下反应30min，然后记录蓝色氧化产物tmb
*+
(tmb氧化物)在652nm下的特征吸光度。如图4所示，只在h2o2存在下，co-mof可以催化tmb氧化为蓝色tmb
*+
，并在652nm处产生强吸收峰，表明了只有过氧化氢存在下从才能有催化效果。
[0042]
实施例4：
[0043]
co-mof/ito电极的构建及表征：用丙酮、无水乙醇和大量去离子水依次洗涤ito电极，然后用n2吹干。将纳米酶按照1mg/ml的浓度分散在乙醇中，将ito电极浸没在分散液中，通过琅勃缪尔吸附法将mof纳米酶修饰到ito电极上，构建co-mof/ito电极，将修饰好的电
极作为工作电极，以[fe(cn)6]
4-/3-为电活性探针，采用循环伏安图(cv)和电阻抗谱(eis)表征了ito电极的修饰过程。如图5所示分别为a)the bare ito,b)the mof/ito,c)the mof/ito+0.8-1.2μmhp+0.8-1.2μmlet-7a,d)the mof/ito+0.8-1.2μmhp+0.8-1.2μmlet-7a+dsn，随着电流的减小和阻抗的增大，表明电极逐渐修饰成功；
[0044]
实施例5：
[0045]
dsn酶辅助信号扩增方案验证：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证循环方案的可行性。为分析扩增产物，制备12％聚丙烯酰胺凝胶，在110v恒压下进行45min聚丙烯酰胺凝胶电泳，用凝胶红核酸染料染色30min，然后在紫外光下拍照。所有dna/mirna链的浓度为0.8-1.2μm。从图6中我们可以清楚地看到从左到右为0.8-1.2μm hp+0.8-1.2μm let-7a+dsn(1)；0.8-1.2μm hp+0.8-1.2μmlet-7a(2)；0.8-1.2μm let-7a(3)；0.8-1.2μmhp+dsn(4)；0.8-1.2μm hp(5)；marker(m)，由于dsn只切割互补碱基对大于8-10个碱基对的双链dna或者dna和rna杂交链中的dna，可以发现发夹并没有被dsn切割(第4列)，只有当发夹被mirna打开形成双链(第2列)时，双链中的dna会被水解，产生一个短的修饰有亚甲基蓝的单链dna(第1列)。而mirna又会和另外的发卡dna结合，开启下一次循环。
[0046]
实施例6：
[0047]
流动分析：
[0048]
步骤1：如图1所示，将易于通过超声波制备2d co-mof纳米酶，通过琅勃缪尔吸附法修饰在ito电极表面，构建co-mof/ito，以构建的电极为工作电极，并搭建如图1所示均相流动电化学检测体系：流动体系由注射泵(sp)、六通阀(sv)、电化学分析池、电化学工作站(sw)以及电脑(pc)组成，连接管道均为聚四氟乙烯管道；检测用的三电极体系是由修饰完成的ito电极为工作电极(we)，饱和因氯化银为参比电极(re)，铂丝为对电极(ce)组成；信号检测和记录装置为普林斯顿电化学工作站(we)和电脑(pc)组成；r1-r2是待检测样品溶液，r3-r5分别为pbs、含1.5mmd的h2o2的pbs以及cdna溶液。
[0049]
步骤2：实验前用ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs，10mm,ph＝7.4)填充固定线圈和连接0端口和流池入口的软管。背景信号稳定后，将液体储存罐r1或r2中经过dsn循环后的溶液通过流动模式引入分析单元液，且在与ito电极孵育后，通过流动模式注入含有1.5mm的h2o2的pbs，并在间歇模式下由电化学工作站检测由电脑记录dpv响应，差分脉冲伏安(dpv)测试在ph＝7.4的pbs(1.5mm h
202
)中进行，扫描电位范围为0～0.4v，扫描速率为100mv/s(vs ag/agcl)。如图9所示，随着目标mirna浓度增加电化学信号不断增加，且在一定范围内电化学信号与mirna的浓度对的数成线性关系并得到标准工作曲线，标准工作曲线为i＝0.6627+0.3135logc(r2＝0.9969),线性范围为1-1
×
106pm,根据3σ原则得出检测限为0.12pm；
[0050]
步骤3：电极的可重复性验证:在流动模式下，在mof/ito电极上进行竞争洗脱。以液体储存罐r5中的序列为5
’‑
tcatccttccgc-3’的cdna(10μm)为流动相，对步骤7的mof/ito电极进行洗脱，注射泵流速为20μl/min，持续20min,然后用液体储存罐r3中的pbs缓冲溶液对洗脱后的mof/ito电极进行冲洗。之后通过流动模式将液体储存罐r4中含有过氧化氢的pbs(1.5mmh2o2,ph＝7.4)缓冲溶液引入分析单元，在间歇模式下记录生物传感器的dpv信号，信号稳定后重复步骤3-4进入下一次循环。如图8所示，经过六次循环后，信号基本不变。
[0051]
步骤4：实际样品检测：采用标准添加法检测了该检测系统对复杂基质中rna的检
测能力。将人血清样本稀释十倍，后将一系列浓度的目标rna样本添加人血清中,按照步骤2的过程进行检测。测得加样回收率在99.51％-102.3％之间，表明该检测系统具有良好的选择性和抗干扰能力，即使在复杂的基质中，也具有一定的应用价值；
[0052]
步骤5：选择性验证:将不同干扰rna经过如实步骤2一样的通过循环后，检测得到的dpv信号基本可以忽略不记，证明了在干扰rna存在的情况下，本发明对目标物具有很好的选择性；
[0053]
实施例7：
[0054]
储存稳定性验证:将构建好的电极经过室温和4℃下长时间储存，最长经过三十天后，仍能够保持良好的检测效果。
[0055]
本发明中，通过超声法简单合成具有仿酶活性二维mof纳米酶，并将纳米酶应用于生物传感器，无需复杂的电极修饰过程，构建了高选择性，高灵敏度的电化学生传感器。
[0056]
本发明中，设计了dsn酶辅助循环信号扩增方案，实现了目标物的循环，从而使得电化学信号得到放大，增加了灵敏度和选择性。
[0057]
本发明中，创造性的将电化学生物传感器与流动检测相结合，采用流动间歇法实现了对mirna的流动检测，并实现了对电极的重复利用以及循环检测。
[0058]
本发明中，构建的电化学生物传感器稳定性高，电极修饰近一个月后，仍能稳定检测目标物。
[0059]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，其特征在于，在均相溶液中采用双链特异性核酸酶辅助信号放大策略实现了信号放大，利用金属有机框架纳米酶的单链dna吸附能力对单链dna进行富集，并利用金属有机框架纳米酶的仿过氧化物酶活性实现信号的进一步放大，结合流动注射-间歇法实现了金属有机框架修饰的氧化铟锡电极的循环利用和目标物mirna的连续检测，从而实现了对mirna的连续均相检测；包括以下步骤：步骤1：双链特异性核酸酶辅助信号扩增方案：亚甲基蓝标记的发卡dna序列被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温，形成发卡结构；在核酸扩增缓冲液中加入终浓度分别为0.15-0.5u和0.8-1.2μm的双链特异性核酸酶和上述发卡dna，再加入待测mirna样品，在45-60℃下孵育50-70min；然后将双链特异性核酸酶终止液加入上述溶液中终止信号扩增反应。步骤2：采用流动注射-间歇法对目标物mirna进行连续检测：在流动模式下，将步骤1中的溶液通过流动注射注入电化学分析池，并在间歇模式下孵育30-60分钟；然后通过流动注射法在电化学分析池内注入含有过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液；在间歇模式下利用三电极体系进行差分脉冲伏安法或线性伏安法或阻抗法检测，并得到电化学信号，根据电化学信号与mirna的浓度的关系求得待测物浓度。步骤3：在流动模式下，以互补dna(cdna)为流动相对金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极的dna进行竞争洗脱；完成后，重复步骤1-3以进行下一轮mirna检测。2.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述核酸扩增缓冲液包括ph＝8.0的50mm的tris-hcl、5mm的氯化镁(mgcl2)、1mm的二硫苏糖醇(dtt)，所述dsn终止溶液为10mm的乙二胺四乙酸(edta)。3.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2中氧化铟锡(ito)电极使用前先用丙酮、无水乙醇和大量去离子水依次洗涤，然后用n2吹干，然后将清洗的氧化铟锡电极浸没在金属有机框架纳米酶乙醇分散液(1mg/ml)中，重复浸没数次后取出后自然干燥以得到金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极.4.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2中电化学分析池为聚四氟乙烯池或者聚丙烯池或者玻璃池；所述步骤2中三电极体系是由铂丝作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，金属有机框架纳米酶修饰的氧化铟锡电极作工作电极组成。5.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤2中差分脉冲伏安法(dpv)在间歇模式下的检测条件为：在含有1.5mm h2o2的ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)中进行扫描，其扫描范围为0v～-0.4v，扫描速率为100mv；线性伏安法在间歇模式下的检测条件为：在含有1.5mm h2o2的ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行扫描，扫描范围为0v～-0.4v,扫描速率为100mv；阻抗法检测条件为：在铁氰化钾溶液中进行，扫描范围为0.1hz～10000hz,振幅为5mv。6.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，其特征在于，所述步骤1-3中注射泵流速独立为10-40μl/min，持续时间独立为25-60min。7.根据权利要求1所述的金属有机框架纳米酶应用于mirna连续检测的均相检测方法，
其特征在于，所述步骤2和3中，二维金属有机框架纳米酶的合成采用超声波法制备复合材料，首先将对苯二甲酸(0.75mmol)和金属离子盐(六水合氯化钴、氯化锰或氯化铁，0.375mmol)溶于含有二甲基甲酰胺(32ml)、乙醇(2ml)和水(2ml)的50ml试管中，超声处理，随后，将0.8ml三乙胺快速注入上述溶液中，搅拌5min，得到胶体悬浮液，超声处理8h(40khz)，离心，乙醇洗涤3次，真空干燥，最后，获得金属有机框架纳米酶粉末，并在4摄氏度下存储。

技术总结
本发明公开了金属有机框架纳米酶应用于miRNA连续检测的均相检测方法，包括以下步骤：步骤1：DSN酶辅助信号扩增方案：为了形成发夹结构，发卡DNA被加热到95摄氏度5分钟，然后慢慢冷却到室温；步骤2：流动分析:采用流动-间歇法对目标物进行流动分析，以间歇模式记录生物传感器的DPV响应，在流动模式下，用将DSN辅助信号放大的产品引入分析单元，并在30-40℃下孵育，在流动模式下，在MOF/ITO电极上进行竞争洗脱，以cDNA为流动相，洗脱后，MOF/ITO电极作为工作电极在PBS缓冲液中进行电化学测量。本发明通过超声法简单合成具有仿酶活性二维MOF纳米酶，并将纳米酶应用于生物传感器，无需复杂的电极修饰过程，构建了高选择性，高灵敏度的电化学生传感器。的电化学生传感器。的电化学生传感器。


技术研发人员：韩磊 王震 王修中 张玉翠
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：2021.10.09
技术公布日：2022/3/8