研究SGO1AuroraA调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法与流程

研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法
技术领域
1.本发明涉及dna重组技术领域，尤其涉及研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法。


背景技术：

2.我国拥有世界上面积最大、海拔最高、居住人口最多的高原，高原地区不仅自然资源丰富，也是我国社会经济发展的重要地区和戍守边疆的前沿阵地。高原低氧(低张性缺氧)环境对男性生殖功能有显著负面影响，大量关于人类、羊驼、大鼠与小鼠精子(elongating spermatid/spermatozoa,也称为长形精子)鞭毛多发形态异常现象已有报道(liu x.etc.biochem biophys res commun,2020)。由高原低氧引起的精子鞭毛多发形态异常继而造成精子前向运动能力降低严重威胁着高原男性人群生殖健康，其直接后果是畸形精子症、弱畸形精子症，严重者可导致男性不育；畸形精子症的不育患者大多存在精子的表观遗传失稳，比如h3k9me3组蛋白甲基化丰度下降及富含组蛋白甲基化的基因启动子减少等(wang,s.y.etc.nat commun,2016)。因此深入研究高原低氧下精子鞭毛多发形态异常(hypoxic multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,hmmaf)的表观遗传机制，探索有效控制低氧下精子鞭毛多发形态异常发生的策略，对于设计高原男性生殖防治措施具有十分重要的意义，对于我国高原地区的经济和国防建设也有重大意义。
3.hmmaf是男性不育的常见表现之一，药物治疗效果不佳，部分患者需要实施辅助生殖技术达到生育目的，其特征是精子鞭毛表型异常(如无鞭毛、短鞭毛、卷曲鞭毛、弯曲鞭毛和/或不规则鞭毛口径等)，从而导致精子活动能力严重受损。研究提示精子鞭毛多发形态异常(mmaf)多为鞭毛超微结构异常，其病因多数与基因变异密切相关。由于人类精子结构复杂，精子鞭毛中存在1000种以上的蛋白，研究认为mmaf可能包含多种不同的超微结构病变，存在不同的病因和致病基因。目前已鉴定出20余种导致mmaf和不育的突变基因，主要包括：激酶a锚固蛋白(akap)家族基因、动力蛋白轴丝重链基因(dnah)家族基因、cfap家族基因、ttc家族基因、fsip2基因、cep135基因、spef2基因、qrich2基因、ak7基因、armc2基因等。但对于低氧下导致的精子鞭毛多发形态异常患者的遗传病因尚不明确。因此，对于hmmaf的遗传学病因和致病机理并不明确，仍需进一步探索。


技术实现要素：

4.针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其解决了现有技术中存在hmmaf的遗传学病因和致病机理不明确的问题。
5.本发明一方面，提供研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，包括以下步骤：
6.s1：制备小鼠低氧hmmaf模型并设置对照组；
7.s2：分析sgo1与aurora a的相互作用；
8.s3：干预sgo1与aurora a的相互作用，检测对低氧下小鼠精子鞭毛形态的影响；
9.s4：分析sgo1与aurora a的相互作用机制。
10.进一步地，所述步骤s1包括：将小鼠放置于低压力低氧浓度的环境中，制备低氧hmmaf模型；所述对照组为21％氧浓度暴露10周的小鼠。
11.优选地，所述压力为360mmhg，所述氧浓度为10％，所述放置的时间为10周。
12.进一步地，所述步骤s2包括：
13.1)收集小鼠低氧hmmaf模型和对照组的小鼠精子；
14.2)co-ip法检测精子中sgo1和aurora a的相互作用情况。
15.进一步地，所述步骤s3包括：
16.1)构建sgo1干扰质粒和/或aurora a干扰质粒；
17.2)将sgo1干扰质粒和/或aurora a干扰质粒转入小鼠；
18.3)检测低氧下小鼠精子鞭毛形态。
19.进一步地，步骤1)的具体方法为：合成靶向sgo1基因和/或aurora a基因的shrna，经过连接转化得到sgo1干扰质粒和/或aurora a干扰质粒。
20.优选地，所述干扰质粒为腺相关病毒颗粒。
21.进一步地，步骤3)中所述检测的方法为：通过巴氏染色观察精子鞭毛形态；通过透射电镜观察精子鞭毛轴丝中心体超微结构。
22.进一步地，所述步骤s4包括：gst pull-down分析aurora a磷酸化mcak-n端，进而破坏mcak与tip150结合。
23.进一步地，所述步骤s1之前，还包括检测低氧hmmaf模型的小鼠精子中sgo1、aurora a的表达。
24.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
25.本发明首次发现并鉴定了sgo1/aurora a/mcak/tip150信号通路在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用，研究发现，sgo1蛋白可招募aurora a蛋白，使aurora a蛋白磷酸化mcak，阻断了mcak和tip150的结合，导致微管正端动态失控，从而影响精子鞭毛的正常形态，使精子活动能力受限，从而导致男性不育。该信号通路为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中小鼠精子细胞中sgo1和aurora a的表达效果图；
27.图2为本发明实施例1中小鼠精子中sgo1和aurora a的表达效果图；
28.图3为本发明实施例2中小鼠精子细胞中sgo1与aurora a的相互作用效果图；
29.图4为本发明实施例3中aav-u6-msgo1-shrna-cmv-zsgreen的载体图谱；
30.图5为本发明实施例5中小鼠精子细胞中sgo1表达的western blot效果；
31.图6为本发明实施例6中巴氏染色观察的精子畸形图；
32.图7为本发明实施例6中透射电镜观察精子中鞭毛中心体结构图；
33.图8为本发明实施例7中aurora a磷酸化mcak的效果图；其中，8a为tip150域的示
意图；8b为mcak域的示意图；8c为wt验证aurora a对mcak 5s的磷酸化。
具体实施方式
34.下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
35.研究内容：分析sgo1与aurora a的相互作用及其机制，明确在低氧下精子鞭毛多发形态异常中，sgo1招募并激活aurora a，从而使aurora a磷酸化mcak，破坏mcak与tip150结合，影响微管正端动态失控，从而影响精子鞭毛的正常形态。
36.(1)验证低氧条件下及常氧条件下小鼠精子中sgo1、aurora a的表达，分析两者表达的相关性；
37.(2)在低氧条件下和常氧条件下小鼠精子中验证并分析sgo1与aurora a的相互作用；
38.(3)在低氧条件下，干预sgo1或aurora a表达或sgo1与aurora a的相互作用，分析sgo1与aurora a的相互作用对精子鞭毛形态的影响；
39.(4)分析sgo1与aurora a的相互作用机制。
40.步骤(3)中，干预sgo1与aurora a的结合的方法包括但不限于利用sgo1干扰质粒或aurora a干扰质粒或同时利用sgo1和aurora a干扰质粒，或者可抑制sgo1与aurora a相互作用的化合物。本发明的一个实施例中，采用sgo1干扰质粒来干预sgo1与aurora a的结合，但并不限于此，采用上述其他方法同样可达到本发明的实施例中的目的和效果。
41.其中，sgo1蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，sgo1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，aurora a蛋白的氨基酸序列如seq id no.3，aurora a基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
42.实施例1低氧下小鼠精子中sgo1、aurora a的表达
43.1、制备小鼠低氧hmmaf模型：将小鼠置于模拟海拔5800m高原低压氧舱内(压力：约360mmhg，氧含量10％)，连续低压低氧处理10w来复制小鼠低氧hmmaf模型。经鉴定低氧hmmaf模型复制成功。并设置21％氧浓度暴露10周组小鼠为对照组。
44.2、精子采集：打开腹腔，取出附睾组织，摘取双侧附睾尾进行液化与裂解后，得到精子细胞(圆形精细胞)和精子(长形精子)。western blot检测附睾尾精子细胞和精子中sgo1、aurora a的表达。具体方法如下：
45.(1)蛋白准备
46.1)用37℃温浴的pbs漂洗待处理的细胞，加入预冷的裂解液(现加pmsf，使终浓度为1mm)，在冰上用细胞刮刮下贴壁细胞，转入冰上静置裂解20min；
47.2)4℃低温10000g离心5min；
48.3)吸取上清进行蛋白定量。
49.(2)制胶
50.1)配制10％分离胶，上层用ddh2o密封，静置约60min；
51.2)弃掉上层水并用滤纸吸干，配制5％的积层胶，装配好梳子，静置凝固约40min；sds-page分离胶与积层胶配置体系如表1所示：
52.表1 sds-page分离胶与积层胶配置体系
[0053][0054]
3)每孔加入约5μl蛋白样品，每板胶的两侧的泳道各加蛋白分子量marker 3μl，其余泳道加入相同体积的1
×
上样缓冲液，补足电泳缓冲液，60v恒压预电泳，等样品进入分离胶后换成90v恒压电泳，待溴酚蓝染料电泳至底部时结束电泳。
[0055]
(3)转模
[0056]
取出凝胶，根据凝胶大小剪切大小一致的pvdf膜，将pvdf膜、滤纸放置电泳缓冲液中平衡20min，按照负极-海绵垫-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫顺序制备三明治夹心，100v稳压转印1h。
[0057]
(4)封闭
[0058]
取出pvdf膜，将膜浸入5％bsa中孵育1h。
[0059]
(5)一抗孵育
[0060]
用一抗稀释液分别配制一抗工作液(sgo1为1:1000，65kda，ab225948，abcam；aurora a为1:1000，46kda，ab115883，abcam；gapdh为1:1000，38kda，ab77109，abcam)，将pvdf膜浸入装有一抗工作液的抗体孵育盒中，4℃过夜。取出pvdf膜，用1
×
tbst洗膜3次，10min/次。
[0061]
(6)二抗孵育
[0062]
加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)标记的二抗工作液(1:1000)，室温孵育1h，1
×
tbst洗膜3次，10min/次。
[0063]
(7)beyoecl plus显色
[0064]
等体积混合适量beyoecl plus a液和b液(碧云天)，均匀滴加到pvdf膜上，室温避光作用1min后放置凝胶成像分析仪显色观察，拍照保存。结果如图1、图2所示。
[0065]
由结果可知，与21％氧浓度暴露10周组小鼠精子相较，10％氧浓度暴露10周组小鼠精子细胞和精子中sgo1蛋白和aurora a蛋白的表达均升高。
[0066]
实施例2低氧下小鼠精子中sgo1与aurora a的相互作用
[0067]
1、制备小鼠低氧hmmaf模型：采用实施例1的方法制备小鼠低氧hmmaf模型，并设置21％氧浓度暴露10周组小鼠为对照组。
[0068]
2、精子采集：打开腹腔，取出附睾组织，摘取双侧附睾尾进行液化与裂解后，得到精子细胞。co-ip法检测睾丸精子细胞中sgo1与aurora a的相互作用情况。结果如图3所示。
[0069]
由结果可知：在常氧和低氧条件下，sgo1与aurora a均可相互结合。
[0070]
实施例3构建sgo1干扰质粒
[0071]
1、sgo1干扰质粒的构建
[0072]
(1)shrna序列的设计
[0073]
检索genbank数据库，小鼠sgo1基因所在基因组序列是genbank accession no.nm_028232(update date 2021-10-14)，根据小鼠sgo1基因的mrna序列，设计能抑制小鼠sgo1基因表达的shrna序列。
[0074]
shrna序列由上海生工生物工程有限公司合成，具体如下：sirna序列(seq id no.5)：cacaggatgtcatcctgcaactgag
[0075]
shrna正义链(seq id no.6)：
[0076]
aattcgcacaggatgtcatcctgcaactgagctcgagctcagttgcaggatgacatcctgtgttttttg
[0077]
shrna反义链(seq id no.7)：
[0078]
gatccaaaaaacacaggatgtcatcctgcaactgagctcgagctcagttgcaggatgacatcctgtgcg
[0079]
(2)退火
[0080]
将合成的shrna序列用ddh2o溶解，浓度为100μm，按照如下体系在pcr仪上进行退火程序。
[0081]
退火体系如表2所示：
[0082]
表2退火体系
[0083][0084]
反应条件如表3所示：
[0085]
表3反应条件
[0086][0087]
单链序列退火形成带粘性末端的双链序列，即为shrna模板。将退火后所得shrna模板采用rnase-freewater(neb)稀释，使其终浓度为200nm，用于连接反应。
[0088]
(3)载体酶切
[0089]
以aav-u6-mcs-cmv-egfp(购自汉恒生物)为骨架载体，按照表4中顺序依次加入试剂，轻轻吸打混匀，置于37℃水浴锅中反应1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段；
[0090]
载体酶切体系如表4所示：
[0091]
表4酶切体系
[0092][0093]
(4)干扰片段与载体连接
[0094]
将步骤2制备的shrna模板和步骤3制备的酶切片段用t4连接酶连接，16℃连接过夜，连接体系如表5所示：
[0095]
表5连接体系
[0096][0097]
本步骤最终得到抑制sgo1表达的载体，命名为aav-u6-msgo1-shrna-cmv-zsgreen，载体图谱如图4所示。
[0098]
(5)转化与鉴定
[0099]
将dh5α感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；待感受态融化后，以每管50μl的体积分装，加5μl aav-u6-msgo1-shrna-cmv-zsgreen，冰上放置20-30min；42℃热激90s，热激完之后冰育2-3min；加入500μllb培养基(无抗)，上下颠倒3-5次；37℃、230rpm震荡培养45-60min；将菌液涂到ampicillin抗性的lb平板上，涂布均匀，倒置，37℃恒温箱培养12-16h。
[0100]
挑取若干单克隆菌落，接种于ampicillin抗性的培养液中，37℃恒温摇床培养过夜。然后用小量质粒提取试剂盒(invitrogen)提取质粒进行测序，测序结果与目的序列一致，目的质粒构建成功。
[0101]
实施例4制备腺相关病毒颗粒
[0102]
利用lipofiter
tm
转染试剂(hanbio biotechnology)将穿梭质粒aav-u6-msgo1-shrna-cmv-zsgreen、包装质粒paav-rc(stratagene公司)和辅助质粒phelper(stratagene公司)共同转染细胞密度达到约80～90％的汇合率的aav-293细胞，所需转染复合物成分如表6所示：
[0103]
表6转染复合物
[0104][0105]
转染后6h更换含10％胎牛血清fbs的新鲜完全培养基。细胞收集和破碎，去除细胞碎片，收集含aav颗粒的裂解上清。经纯化得到约1ml aav-sgo1。
[0106]
同时以aav-u6-mcs-cmv-egfp空质粒按同样方法转染aav-293细胞得到空病毒，作为阴性对照aav-ctl。对病毒进行热源检测、微生物检测，同时用pcr法检测是否有野生病毒复制(rcl)，确保无热源，无细菌、真菌、病毒等微生物污染，无野生病毒复制。经检测，aav-sgo1的滴度为1.3
×
10
12
μg/ml。
[0107]
实施例5sgo1敲除小鼠精子中sgo1的变化
[0108]
分别将小鼠精子细胞系(63423，atcc，manassas,virginia，usa)与小鼠睾丸支持细胞系(crl-1715，atcc)共培养于改良dmem培养基(补加1μm睾酮、500miu/ml重组fsh、5μg/ml肾上腺素、10％胎牛血清)中，在32℃、5％co2培养箱中6h得到成熟精子。在培养基中加入实施例4制备的重组腺相关病毒aav-sgo1，培养12小时后，去除原有培养基，并加入新鲜的egm-2完全培养基继续培养72小时。western blot检测附睾尾精子中sgo1的表达，具体步骤参照实施例1，结果如图5所示。
[0109]
结果表明，转入aav-sgo1的精子细胞的sgo1的表达量明显低于转入aav-ctl的精子细胞的sgo1的表达量。
[0110]
实施例6sgo1敲除小鼠精子鞭毛形态的检测
[0111]
将制备的重组腺相关病毒aav-sgo1以8
×
107tu/只剂量感染小鼠，并设立空病毒对照组，10％氧浓度暴露小鼠10周，液化并收集附睾尾精子。
[0112]
1、巴氏染色法观察精子形态
[0113]
(1)长形精子分离：附睾尾投入37℃预热的0.5％bsa的f12，剪碎，液化10min。40μm细胞筛过滤，冲洗数次确保足够细胞滤过，转移细胞悬液至15ml离心管。1500rpm离心10min。弃上清，沉淀用红细胞裂解液裂解，大鼠加入裂解液为4ml/只，重悬2min。1500rpm离心10min。用pbs稀释后均匀涂抹于载玻片上，自然干燥。
[0114]
(2)巴氏染色：将玻片置于等量的95％乙醇和乙醚混合成的溶液中，固定5min，将玻片依次浸入80％、70％、50％乙醇溶液各1min，最后放入蒸馏水中1min；把玻片放入苏木精染液中染色3min，蒸馏水冲洗1min；放入0.5％盐酸乙醇中分色，约2min，蒸馏水冲洗1min；将玻片依次浸入50％、70％、80％乙醇溶液各1min；在橘黄g6染液中染色2min，然后将玻片浸入95％乙醇溶液中两次，每次2min；将玻片放入ea36中染色5min，然后浸入95％乙醇中3次，每次1min，再入无水乙醇中浸2min；将玻片放入二甲苯溶液中透明3次，每次1min；干燥后立即显微镜观察。结果如图6所示。
[0115]
(2)透射电镜(transmission electron microscopy,tem)观察精子鞭毛轴丝中心体超微结构
[0116]
睾丸切除后，立即将组织切片成小样本(1mm3)，并在4℃下在3％缓冲戊二醛中固定4h；然后将组织样本在1％四氧化锇(oso4)中后固定90min；固定的组织用乙醇脱水，然后组织通过环氧丙烷转移到树脂中。在用纯树脂组织浸渍后，将样品嵌入相同的树脂混合物中。使用配备金刚石刀的超显微切片机(leica,uct)切割样品为60
–
70nm的超薄切片；将切片放置在铜网格上，用醋酸铀酰染色20min，以及采用柠檬酸铅染色5min。用透射电子显微镜(jem-1011,jeol,tokyo,japan)在80kv下观察染色切片。结果如图7所示。
[0117]
结果表明：与对照组相比，sgo1敲除小鼠中精子形态明显改善，精子畸形数量明显减少，精子中鞭毛中心体结构明显改善，正常中心体结构明显增多。
[0118]
实施例7sgo1/aurora a的作用机制研究
[0119]
1、通过pcr分别扩增编码mcak wt(野生型)/5a(任意突变型)的第1-586位氨基酸的cdna，并将其插入到pet-22b-gfp载体中，获得h6-gfp-mcak-n wt质粒与h6-gfp-mcak-n 5a质粒。
[0120]
2、将纯化的6
×
his(h6)-gfp-mcak-n和5s突变体h6-gfp-mcak-n 5a(各1mg)分别与50mm atp孵育，含或不含aurora a激酶(50ng)。wt分析aurora a是否磷酸化mcak。结果如图8所示。8a为tip150域的示意图，全长tip150分为tip150-n(第1
–
800位氨基酸)和tip150-c(第801-1368位氨基酸)；8b为mcak域的示意图，全长mcak分为mcak-n(第1-586位氨基酸)和mcak-c(第587-725位氨基酸)，aurora a激酶的磷酸化位点(s95/109/111/115/192，简称5s)位于mcak的球状结构域(globular)；8c为wt验证aurora a对mcak 5s的磷酸化。anti-ps(也称为p-mcak)购自invitrogen。由结果可知，aurora a磷酸化mcak-n末端5s位点。
[0121]
由此推测：sgo1/aurora a抑制剂的作用机制为sgo1招募并激活aurora a，aurora a磷酸化mcak，进而破坏mcak-tip150复合物(维持微管正端组装与解聚的平衡)关联，导致微管正端动态失控，从而影响精子鞭毛的正常形态，使精子活动能力受限，从而导致男性不育。
[0122]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：制备小鼠低氧hmmaf模型并设置对照组；s2：分析sgo1与aurora a的相互作用；s3：干预sgo1与aurora a的相互作用，检测对低氧下小鼠精子鞭毛形态的影响；s4：分析sgo1与aurora a的相互作用机制。2.如权利要求1所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述步骤s1包括：将小鼠放置于低压力低氧浓度的环境中，制备低氧hmmaf模型；所述对照组为21％氧浓度暴露10周的小鼠。3.如权利要求2所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述压力为360mmhg，所述氧浓度为10％，所述放置的时间为10周。4.如权利要求1所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述步骤s2包括：1)收集小鼠低氧hmmaf模型和对照组的小鼠精子；2)co-ip法检测精子中sgo1和aurora a的相互作用情况。5.如权利要求1所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述步骤s3包括：1)构建sgo1干扰质粒和/或aurora a干扰质粒；2)将sgo1干扰质粒和/或aurora a干扰质粒转入小鼠；3)检测低氧下小鼠精子鞭毛形态。6.如权利要求5所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，步骤1)的具体方法为：合成靶向sgo1基因和/或aurora a基因的shrna，经过连接转化得到sgo1干扰质粒和/或aurora a干扰质粒。7.如权利要求6所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述干扰质粒为腺相关病毒颗粒。8.如权利要求5所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，步骤3)中所述检测的方法为：通过巴氏染色观察精子鞭毛形态；通过透射电镜观察精子鞭毛轴丝中心体超微结构。9.如权利要求1所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述步骤s4包括：gst pull-down分析aurora a磷酸化mcak-n端，进而破坏mcak与tip150结合。10.如权利要求1所述的研究sgo1/aurora a调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述步骤s1之前，还包括检测低氧hmmaf模型的小鼠精子中sgo1、aurora a的表达。

技术总结
本发明提供了一种研究SGO1/Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法。包括以下步骤：S1：低氧下分析SGO1与Aurora A的相互作用；S2：低氧下干预SGO1与Aurora A的相互作用，分析对小鼠精子鞭毛形态的影响；S3：分析低氧下SGO1与Aurora A的相互作用机制。本发明首次发现并鉴定了SGO1/Aurora A/MCAK/TIP150信号通路在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用，为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。供了新的治疗途径。


技术研发人员：殷骏 倪兵 张梦洁
受保护的技术使用者：重庆艾令达生物医学研究有限公司
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/3/8