一株鸡葡萄球菌及其在去除水产品中挥发性胺中的应用

1.本发明属于生物及水产品加工的技术领域，具体涉及一株鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）及其在去除水产品中挥发性胺中的应用。


背景技术：

2.挥发性胺类物质是判定水产品新鲜程度的物质，具有鱼腥味和氨臭味。例如，三甲胺有鱼腥恶臭味，当它与不新鲜鱼的δ-氨基戊酸、六氢吡啶等成分共同存在时则增强了鱼腥的嗅感。二甲胺（dma）常温下为无色气体,能溶于水、乙醇,浓度极低时有腐烂鱼味,高浓度具有强烈的氨臭味。因此，去除水产品中挥发性胺类化合物对提高水产品的风味非常有必要。
3.目前水产品常用的去腥（主要为挥发性胺类物质）方法主要为基于吸附或包埋等机理的有活性炭吸附法、大孔树脂吸附法和β-环糊精包埋法。近年来，微生物发酵法得到了应用，目前已报道的去除挥发性胺类化合物的微生物有酵母菌和乳酸菌。但现有的去除挥发性胺类化合物的菌株仅仅能去腥，而不能增强水产品的风味。


技术实现要素：

[0004] 本发明的目的在于提供了一株鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum），所述的鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）的保藏编号为gdmcc no：61795。
[0005]
本发明的另一个目的在于提供了鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）在去除水产品中挥发性胺中的应用。
[0006]
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：自虾酱中筛选出一株可去除水产品中挥发性胺类化合物的细菌，通过生物形态和分子鉴定，该菌株鉴定为鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum），该菌株已于2021年7月9日送至广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为gdmcc no：61795，分类命名：staphylococcus gallinarum fela3，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0007] 菌株staphylococcus gallinarum fela3在氯化钠含量为4%的营养琼脂培养基中，于25℃培养72小时的菌落形态如图1所示。fela3菌落呈圆形，白色，边缘整齐，菌落较大，细胞形态呈圆球状。
[0008]
鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3在去除水产品中挥发性胺类化合物的应用，包括将鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3接种于水产品调味品中，使其在水产调味品中的终浓度为103～106cfu/ml或cfu/g，并于25℃～40℃发酵1～3天。
[0009]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明首次从传统发酵的虾酱中筛选出一株可用于去除水产调味品中挥发性胺类化合物的鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum），它不但能高效去除水产调味品中的挥发性胺类化合物，还可显著增加水产调味品中酮类、醇类和酯类等风味物质的含量，从而增强水产调味品的风味。
附图说明
[0010]
图1为菌株fela3的个体形态与菌落形态图。
[0011]
图2为菌株fela3的系统发育树。
[0012]
图3为温度和盐度对菌株fela3生长的影响示意图。
具体实施方式
[0013]
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0014]
实施例1：鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3的分离与鉴定：本发明的鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3自虾酱中筛选分离，fela3菌落呈圆形，白色，边缘整齐，菌落较大，细胞形态呈圆球状。
[0015]
菌株fela3的鉴定：采用16s rdna测序方法， pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格的送至生工生物工程股份有限公司测序，测序结果提交至ezbiocloud中进行同源性检索，选择相似性高的模式菌株的16s rdna序列进行比对分析。菌株fela3与标准菌株staphylococcus gallinarum dsm 20610的相似性最高，高达99.04%。选取序列相似度达 99% 的部分菌种， 采用软件 mega5.05， maximum likelihood 法制作系统发育树，菌株 fela3与staphylococcus gallinarum dsm 20610在系统发育树上属于同一支系，鉴定菌株fela3为鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）。该菌株已于2021年7月9日送至广东省微生物菌种保藏中心保藏，分类命名：staphylococcus gallinarumfela3，保藏编号为：gdmcc no：61795，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0016]
实施例2：温度和盐度对菌株fela3生长的影响1）取一环鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3纯培养物至100 ml营养肉汤中，37℃振荡培养24 h后，接种10 ul至1 ml新鲜培养基中，混匀后取200 μl至96孔板中，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃培养14 h，每间隔1 h测定其od
600nm
值，每个样品重复六次试验。结果如图3中a，由图3中a结果可知，鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3在温度低于30℃时生长速度较慢，14 h仍未进入稳定期，在达到35 ℃后，温度升高，生长速度变化不明显，但生长量降低，生长量在35 ℃时达到最大。
[0017] 2）取一环鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3纯培养物至100 ml营养肉汤中，37℃振荡培养24 h后，接种10 ul至1 ml不同含盐量（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%）新鲜营养肉汤培养基中，混匀后取200 μl至96孔板中，37 ℃培养24 h，测定其od
600nm
值，每个实验重复三次。结果如图3中b，有图3中b结果可知，营养肉汤不添加nacl时，鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）生长量最好，加盐后，生长量明显降低。当盐含量大于15%，鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3生长微弱，当盐含量大于18%，该菌株几乎不生长。
[0018]
实施例3：鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3去除三甲胺的研究将鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3接种到营养肉汤中，37℃恒温振荡培养24h，吸取1 ml菌液再次接种新的营养肉汤，37℃恒温振荡培养24h后，得到初始菌液，8000r/min离心10 min收集菌体，并用无菌水清洗2次，收集菌体备用。往灭菌后的营养
肉汤培养基中加入三甲胺溶液，使其终浓度分别为20、40、60、80和100 mg/ l，将收集的鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3菌体接入到含三甲胺的营养肉汤培养基中，使其终浓度为106cfu/ml, 35℃恒温培养1天。
[0019]
测定发酵结束后溶液中三甲胺的含量。三甲胺测定采用自动顶空-气相色谱法。顶空条件：顶空盘温度40℃，进样针温度40℃，平衡时间40 min。色谱条件：石英毛细管色谱柱db
‑ꢀ
waxetr( 美国agilent，30 m
×ꢀ
0. 32 mm
×ꢀ
0. 5 μm)； 载气：高纯氮气；流量2. 5 ml/min；进样口温度220 ℃；升温程序： 40 ℃保持3 min，以30℃ /min 速率升至220 ℃，保持1 min； 检测器温度：220℃；尾吹气( 氮气) 流量： 35 ml/ /min；氢气流量： 40ml /min；空气流量：400 ml /min。不同溶液是三甲胺测定如表1所示。由表1结果可知，鸡葡萄球菌fela3对三甲胺有良好的去除效果。
[0020]
实施例4：菌株fela3在虾头酶解液中去除挥发性胺类化合物的应用1）虾头酶解液制备 经清洗晾干的虾头搅碎，按料液比1：0.6，加入烧杯中，搅拌均匀，ph调至7.5，木瓜蛋白酶添加量为775u/g，保鲜膜封口于42℃水浴锅中保温3h，每间隔一段时间进行搅拌，酶解结束后，100℃灭酶10 min后备用。
[0021]
2）虾头酶解液的发酵 将鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3接种到营养肉汤中，37℃恒温振荡培养24h，吸取1 ml菌液再次接种新的营养肉汤，37℃恒温振荡培养24h后，得到初始菌液，8000r/min离心10 min收集菌体，并用无菌水清洗2次，收集菌体。并将收集的菌体加入到虾头酶解液中，使得鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3终浓度为105cfu/ml，以不接菌的酶解液为空白对照(ck)，30℃恒温培养2天。
[0022]
3）hs-spme-gc-ms分析发酵液的挥发性风味成分准确吸取5 ml样品于20ml顶空瓶中，加入1μl内标物2-甲基-3-庚酮（0.8160g/ml），磁力搅拌60℃水浴平衡10 min，相同条件下萃取30min，后将萃取头插入气质联用仪进样口解析5 min。
[0023]
气相色谱条件：色谱柱为inertcap pure-wax；载气为氦气，流速为1.0ml/min，进样口温度250℃，不分流进样；升温程序：起始柱温40℃，保持1 min，以3℃/min的速率升至
100℃，保持5min，以5℃/min的速率升至230℃，保持10min。
[0024]
质谱条件：离子源ei，离子源温度230℃，接口温度250℃，电子能量70 ev，质量扫描范围30~480 m/z，无溶剂切除时间。
[0025]
4）数据处理挥发性风味物质定性和定量分析：利用nist17数据库进行比对，当化合物相似大于80予以报道，根据化合物峰面积与内标物2-甲基-3-庚酮的峰面积之比计算各化合物的含量（内标法），每次试验重复三次，结果以平均值表示。计算公式：数据采用microsoftexcel 2019，origin2019b处理，结果用平均值（）表示，并绘制曲线图。
[0026]
由表2和表3的结果可知，通过鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3的发酵，虾头酶解液挥发性胺类化合物的种类由10种减少到1种，且含量由17.502 ng/ml减少到1.059 ng/ml，挥发性胺类化合物的去除率高达93.79%，可见鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3在虾头酶解液中有良好的去除挥发性胺类化合物的效果。并且，通过鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3的发酵，虾头酶解液中酮类、醇类和醛类等风味性成分的含量都显著增加，可见，通过菌株fela3的发酵还能增强虾头酶解液的风味。
[0027]
注：fela3为添加菌株fela3发酵的虾头酶解液；ck为未添加菌株fela3发酵的虾头酶解液。
[0028]
表3虾头酶解液中挥发性成分明细表
注：fela3为添加菌株fela3发酵的虾头酶解液；ck为未添加菌株fela3发酵的虾头酶解液实施例5：菌株fela3发酵液的毒理学评价实验1）发酵液的制备。将鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3接种到营养肉汤中，37℃、150r/min恒温振荡培养24h，得到鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）fela3的发酵液，发酵液直接饲喂小鼠。
[0029]
2）急性毒性试验。 取健康的小鼠40 只（雌雄各半），按照随机分组原则分为2 组，每组20 只，雌雄各半。实验组按0.4ml/20g（以体质量计），分两次（间隔4h）将鸡葡萄球菌fela3的发酵液经口灌胃小白鼠；空白对照组给予相同剂量无菌营养肉汤培养液。实验前禁食过夜，禁食期间正常给水。灌胃2h 后恢复正常饮食。实验期限为15d。每天观察记录小白鼠饮水、进食、活动及死亡情况。在实验期间各实验组小白鼠饮食和活动正常，生长发育良好，体质量增加，未见有任何明显的中毒表现，也无死亡。小白鼠喂养1 5 d 后解剖，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器，与空白对照组相比，皆未发现病变和差异。这表明菌株发酵液的饲喂剂量达20.0g/kg 体质量时不会引起小白鼠的死亡。按急性毒性剂量评价分级标准属无毒级物质。
[0030]
3）30d 喂养实验。按照gb 15193.13
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2003《30 天和90 天喂养试验》方法进行30天的喂养实验。取健康小鼠80 只（雌雄各半），按照随机分组原则分为4 组，鸡葡萄球菌fela3发酵液各设为2.5、5.0、10.0g/kg（以体质量计）3 个剂量组，并设蒸馏水为空白对照组。30天喂养结束后，测定血液中红细胞、白细胞、血小板以及血红蛋白数，结果表明各饲喂剂量组的小鼠血液的红细胞、白细胞、血小板以及血红蛋白数结果与空白对照组之间无显著差异；测定各组小鼠血液中血清白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、胆固醇、肌酐、血糖、甘油三酯和总蛋白的含量等血液生化学指标，结果表明，各剂量组中小鼠血液各生化
指标与对照组之间无明显差异；并对小鼠进行解剖，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器，结果显示，各饲喂剂量组的小白鼠各脏器颜色、形状、大小等均未见病变。以上结果表明，各实验组小白鼠脏体、血液指标和生化指标与空白对照组之间无显著差异，可初步判定该菌株是安全无毒的。

技术特征：
1.一株分离的鸡葡萄球菌（staphylococcus gallinarum），所述的鸡葡萄球菌的保藏编号为gdmcc no：61795。2.权利要求1所述的鸡葡萄球菌在去除水产品中挥发性胺中的应用。

技术总结
本发明属于生物及水产品加工的技术领域，具体涉及一株鸡葡萄球菌及其在去除水产品中挥发性胺中的应用，所述的鸡葡萄球菌的保藏编号为GDMCC NO：61795。本发明首次从传统发酵的虾酱中筛选出一株可用于去除水产品中挥发性胺类化合物的鸡葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum），它不但能高效去除水产品中的挥发性胺类化合物，还可显著增加水产品中酮类、醇类和酯类等风味物质的含量，从而增强水产品的风味。的风味。的风味。


技术研发人员：刘唤明 罗美燕 蒋嘉惠 赖崇熙 黄雅萍 唐金燕 洪鹏志 周春霞 邓楚津
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：2022.02.09
技术公布日：2022/3/8