一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用

示的核苷酸序列，全长1626bp，共编码542个氨基酸。
8.本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因zmssp1在调节玉米籽粒淀粉含量 与结构中的应用，所述基因zmssp1对淀粉的合成起正调控作用，其过量表达植株籽粒 中总淀粉、直连淀粉、支链淀粉含量提高，而crispr/cas9敲除突变体中总淀粉、直连淀 粉、支链淀粉含量下降。
9.本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因zmssp1在调节玉米籽粒大小和千 粒重中的应用，所述基因zmssp1对籽粒的大小起正调控作用，其过量表达可提高籽粒 的厚度和千粒重，而crispr/cas9敲除突变体中籽粒的厚度和千粒重降低。
10.本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因zmssp1在在调节玉米籽粒蛋白含 量中的应用，所述基因zmssp1对籽粒的蛋白合成起负调控作用，crispr/cas9敲除突变 体中籽粒总蛋白和醇溶蛋白含量提高。
11.进一步改进在于，所述蛋白包括籽粒总蛋白和醇溶蛋白。
12.本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因zmssp1的编码蛋白，该编码蛋白 具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。
13.本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体为通过在peasy-t1载体上插入上述 玉米淀粉合成调控基因zmssp1获得。
14.本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞为含有上述重组载体的 大肠杆菌感受态trans5α细胞。
15.本发明还提供了一种过量表达载体，所述过量表达载体为通过在pzz00005质粒上 转入上述玉米淀粉合成调控基因zmssp1获得，具体为pzz00005-zmssp1过量表达载 体。
16.本发明还提供了一种敲除突变体载体，所述敲除突变体载体为将上述基因zmssp1 中敲除sgrna靶位点tggtggcaggcatattccaaggg后克隆到pzmu6-6载体上获 得，具体为pzmu6-6-zmssp1。
17.本发明提具有如下有益效果：
18.zmssp1是一个定位于质体的新基因，zmssp1蛋白定位于质体中，基因zmssp1 在胚乳和花粉中高表达，过量表达该基因可以提高玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒 重，而敲除该基因可以降低玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，说明zmssp1基因对 淀粉表达起正调控作用。该基因的发现为玉米籽粒品质和产量的交叉代谢调控提供了一 个新的功能基因，为解析玉米籽粒淀粉调控途径提供了一种新理论，对作物的遗传改良 和培育优质高产的玉米材料具有重要的理论和实践指导意义；本发明产生的材料为优质 高产的玉米育种提供新种质资源。
附图说明
19.图1为zmssp1基因不同玉米组织表达模式分析结果柱状图；横坐标1-12分别为授 粉后5天胚乳、10天胚乳、15天胚乳、20天胚乳、25天胚乳、30天胚乳、35天胚乳、 40天胚乳、三叶期根、三叶期茎、三叶期叶和花粉；
20.图2为zmssp1蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位图；
21.图3为转基因玉米植株中zmssp1基因的表达检测图；wt:玉米xiang249自交； ko-1，ko-2，ko-3为crispr/cas9敲除突变体转基因株系；oe-1，oe-2，oe-3为过表 达转基因株
出，zmssp1基因主要在不同发育胚乳和花粉中表达。
35.2.2zmssp1基因的克隆
36.选取玉米b73品种授粉后15天的籽粒胚乳，提取玉米胚乳rna并反转录成cdna， 以玉米胚乳cdna为模板，根据玉米b73基因组数据库公布的基因序列，结合克隆载体 的多克隆位点设计引物，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物。
37.引物序列为：
38.zmssp1-f：5
′‑
ggggtaccatgcccccactcgtcccct-3
′
39.zmssp1-r：5
′‑
cgggatccagtgacaagcagaaggttg-3
′
40.pcr反应程序为：98℃，预变性10min；98℃，变性20s；65℃，退火20s；72℃， 延伸2min，30个循环；72℃，复性10min；10℃保存。
41.将pcr扩增产物用质量比为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，将与目的基因长度一致的 电泳条带进行切胶回收，回收片段连接至peasy-t1载体(购于全式金生物技术有限公 司)，获得连接产物。将连接产物转化到大肠杆菌感受态trans5α细胞中，并提取质粒， 以提取的质粒做模板，以zmssp1-f和zmssp1-r引物进行pcr扩增验证，同时用kpni 和bamhi双酶切质粒进行检测，筛选阳性克隆子，将阳性克隆子送去华大生物公司进 行测序，测序结果使用mega4.0软件比对，结果与预测一致(详见基因序列)。
42.2.3zmssp1基因的亚细胞定位分析
43.为了进一步了解玉米zmssp1基因亚细胞定位特征，我们构建了亚细胞融合载体， 将zmssp1基因连接到改造后的pcambia1305载体的gfp上游；
44.命名为p1305-35s-zmssp1-gfp：
45.上下游引物如下：f:gctctagaatgcccccactcgtcccctcgct(下划线标记为 xbai酶切位点)和r:cgggatccagtgacaagcagaaggttgttttc(下划线标记为 bamhi酶切位点)。
46.构建正确的载体转化玉米原生质体，原生质体转化步骤如下：玉米培养至第二片叶 高于第一片叶10-15cm时，截取距离叶尖6-8cm的部分，切成0.5mm左右，浸在酶解 液(1％(w/v)纤维素酶、0.05％果胶酶和0.2％driselase)中，用锡箔纸包住放在40rpm/min 的水平摇床上酶解5-6h。用100目的筛子将原生质体的酶解液过滤至圆底50ml的离心 管中，除去未溶解的叶片，吸取等量的w5(0.4m蔗糖，2.4g/lhepes，6g/lkcl， 600mg/lcacl2·
2h2o，)溶解含有原生质体的酶解液。100g，4℃离心2min，尽量除去 上清，用5ml预冷的w5轻柔重悬，冰上放置30min。100g，4℃离心2min，使原生质 体沉淀在管底，除去w5溶液，用适量的mmg(4.3g/lms盐，0.4m蔗糖，500mg/lmes 盐，750mg/lcacl2·
2h2o，250mg/lnh4no330ml)重悬原生质体，在显微镜下观察溶解 液中的原生质体的数目。加入10μlp1305-35s-zmssp1-gfp质粒于2ml离心管中，然后 加入100μl的原生质体轻柔混匀，最后加入110μl的peg溶液，轻柔拍打离心管，使 它们完全混合，黑暗条件下诱导转化混合物1h。室温条件下，吸取440μlw5溶解混合 液，轻柔颠倒摇动离心管，混合均匀，从而终止反应。100g，2min离心，去掉上清。 向离心管中加入200μl的w5溶液，缓慢轻柔重悬原生质体，然后吸取到多孔培养皿中。 用锡箔纸将多空培养皿包裹，在黑暗条件下诱导原生质体18h，在激光共聚焦显微镜下 观察定位情况。
47.结果如图2所示，zmssp1基因定位于质体中，说明其可能参与到淀粉的调控过程。
48.2.4农杆菌介导的转zmssp1基因玉米株系的获得及鉴定
49.原位转化液的配制：1/4ms培养基中加2％质量浓度的蔗糖，0.05％质量浓度的表面 活性剂silwet-77，2mg/l6-ba，1ng/l2，4-d以及10mg/l乙酰丁香酮。每100ml培养基 中加4ml农杆菌ag10菌液，于28℃，250rpm培养24小时。
50.将玉米须剪去，用5ml的注射器将菌液从玉米的下部1/3处直接注入玉米棒(材料 为xiang249)中，注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜。经过两个月的生长，收获玉米 粒。
51.将玉米粒晒干，播种，待幼苗长到3-4叶期时用配制的0.01％(质量)除草剂basta 和quickstixpat/bar蛋白检测试纸条(as013ls)检测过表达载体和敲除载体上所含的 bar基因蛋白，筛选阳性转基因植株。
52.具体方法如下：
53.1)过表达载体构建：根据玉米b73的cdna的基因序列设计引物、pcr扩增、胶 回收获得zmssp1基因；将zmssp1基因转入到pzz00005质粒中，构建pzz00005-zmssp1 过量表达载体；
54.2)crispr/cas9敲除突变体载体构建：根据zmssp1基因序列特异性设计敲除sgrna 靶位点tggtggcaggcatattccaaggg，测序正确后克隆到pzmu6-6载体上，产 生敲除载体pzmu6-6-zmssp1；
55.3)载体导入细胞：采用冻融法将步骤1)2)中pzz00005-zmssp1过量表达载体和 pzmu6-6-zmssp1敲除载体导入农杆菌ag10感受态细胞中，形成农杆菌ag10菌液；
56.4)原位转化液配制：将农杆菌ag10菌液加入到培养基中，培养基为1/4ms培养 基中加2％质量浓度的蔗糖、0.05％质量浓度的表面活性剂silwet-77、2mg/l6-ba、1ng/l2， 4-d以及10mg/l乙酰丁香酮，在28℃，250rpm培养24小时，得转化菌液；
57.5)转化：将玉米须剪去，用注射器将转化菌液从玉米的下部1/3处直接注入玉米棒 中，注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜，经过两个月的生长，收获玉米粒；
58.6)筛选：将玉米粒晒干，播种，检测玉米中表达载体和敲除载体上所含的bar基 因蛋白，然后筛选阳性转基因植株。
59.7)独立转化事件的玉米苗成熟后，以其叶片总dna为模板，使用quickstixpat/bar 蛋白检测试纸条(as013ls)检测载体上所含的bar基因蛋白，同时使用zmssp1目 的基因进行pcr检测，鉴定转基因植株，鉴定时，以野生型目的玉米植株为阴性对照。
60.pcr检测的反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延 伸1min，34个循环；72℃总延伸10min。
61.结果如图3所示，分别获得了过表达和敲除突变体株系，wt:玉米xiang249自交； ko-1，ko-2，ko-3为crispr/cas9敲除突变体转基因株系；oe-1，oe-2，oe-3为过表达 转基因株系。
62.2.5zmssp1转基因玉米籽粒的厚度和千粒重测定
63.我们选取两株独立转化事件的转基因株的t3代籽粒进行玉米籽粒的厚和千粒重测 定。千粒重使用电子天平，每千粒计数称重，两个独立转化株其t3代籽粒分别选取1000 粒计重，每次三个重复。
64.实验结果见图4，过表达植株籽粒厚度和千粒重大于野生型，而敲除突变体植株籽 粒厚度和千粒重小于野生型。
65.2.6zmssp1转基因玉米淀粉含量与结构的分析
量，醇溶蛋白以及非醇溶蛋白含量测定。
97.测定方法如下：
98.(1)将10颗玉米籽粒去种皮和去胚，用液氮研磨至粉末并装入ep管中，真空抽 干；
99.(2)称取50mg抽干的粉末于ep管中，加入1ml石油醚，涡旋混匀，4℃摇床孵 育1h去脂；
100.(3)13200rpm，离心15min后弃上清，真空抽干；
101.(4)加入1ml硼酸钠溶液，20μlβ-巯基乙醇，37℃摇床孵育过夜；
102.(5)13200rpm离心15min，吸取上清液转入新的ep管，上清液则为总蛋白；
103.(6)从总蛋白中取出300μl，加700无水乙醇，涡旋混匀，室温摇床孵育2h；
104.(7)13200rpm离心15min，吸取上清于新的ep管，用70％乙醇洗涤沉淀两次， 13200rpm离心5min，沉淀风干至边缘透明后加入200μlipg溶解，即为非醇溶蛋白；
105.(8)将总蛋白和醇溶蛋白的上清液进行真空抽干后，加入200μlipg溶解，即为总 蛋白和醇溶蛋白；
106.(9)完成提取的蛋白利用bradford法进行浓度的测定，并计算其含量；
107.(10)将抽提的醇溶蛋白和非醇溶蛋白各取40μl加入10μl的蛋白buffer混匀后， 99℃煮沸10min加样跑胶，过夜染色，然后脱色拍照观察。
108.测定结果如图7所示，敲除突变体中总蛋白和醇溶蛋白含量明显高于野生型，说明 zmssp1基因对蛋白特别是醇溶蛋白的合成具有负调控作用。
109.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不 能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明 的保护范围。

技术特征：
1.一种玉米淀粉合成调控基因zmssp1，其特征在于，该基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。2.一种如权利要求1所述的玉米淀粉合成调控基因zmssp1在调节玉米籽粒淀粉含量与结构中的应用。3.一种如权利要求1所述的玉米淀粉合成调控基因zmssp1在调节玉米籽粒大小和千粒重中的应用。4.一种如权利要求1所述的玉米淀粉合成调控基因zmssp1在调节玉米籽粒蛋白含量中的应用，其特征在于，所述基因zmssp1表达对籽粒的蛋白合成起负调控作用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白包括籽粒总蛋白和醇溶蛋白。6.一种如权利要求1所述的玉米淀粉合成调控基因zmssp1的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为通过在peasy-t1载体上插入如权利要求1所述的玉米淀粉合成调控基因zmssp1获得。8.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞为含有如权利要求7所述重组载体的大肠杆菌感受态trans5α细胞。9.一种过量表达载体，其特征在于，所述过量表达载体为通过在pzz00005质粒上转入如权利要求1所述的玉米淀粉合成调控基因zmssp1获得，具体为pzz00005-zmssp1过量表达载体。10.一种敲除突变体载体，其特征在于，所述敲除突变体载体为将如权利要求1所述的基因zmssp1中敲除sgrna靶位点tggtggcaggcatattccaaggg后克隆到pzmu6-6载体上获得，具体为pzmu6-6-zmssp1。

技术总结
本发明公开了一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用，涉及基因工程技术领域，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。ZmSSP1是一个定位于质体的新基因，过量表达该基因可以提高玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，而敲除该基因可以降低玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，说明ZmSSP1基因对淀粉表达起正调控作用。该基因的发现为玉米籽粒品质和产量的交叉代谢调控提供了一个新的功能基因，为解析玉米籽粒淀粉调控途径提供了一种新理论，对作物的遗传改良和培育优质高产的玉米材料具有重要的理论和实践指导意义；本发明产生的材料为优质高产的玉米育种提供新种质资源。的材料为优质高产的玉米育种提供新种质资源。的材料为优质高产的玉米育种提供新种质资源。


技术研发人员：武健东 于伟 陈逸蓉 陈龙 杜明 王龙
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2022/3/8