无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用

1.本发明涉及环境污染物生物处理技术，具体涉及一种无色杆菌、含有 该菌的菌剂及它们的应用。


背景技术：

2.锰是矿山酸性废水中最主要的污染物之一，锰过量会引起中枢神经系 统、呼吸系统方面的疾病，处理矿山酸性废水中的锰是环境领域中的重要课 题。
3.去除矿山酸性废水中锰的常用处理方法有直接沉淀法、氧化法、吸附法 等物理化学处理技术，因其成本高、操作难度大、易产生二次污染等缺点， 难以适用于偏远废弃矿区的矿山酸性废水治理。生物法因其成本低廉、操作 简单、不会产生二次污染等优点而备受关注。目前对于微生物处理含锰废水， 国内外已开展大量的研究，由于筛选的微生物通常只适用于中性环境中生长 并发挥作用，因此多用于处理含铁锰的地下水；而对于锰浓度较高、ph值 较低的矿山酸性废水，使用受到严重的限制。
4.如何获得适应性强、耐受浓度高、去除效率高的耐酸菌，对于含锰矿 山酸性废水的处理具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术中微生物无法处理锰浓度较高、ph 值较低的废水的问题，提供一种无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用， 该菌株能够在酸性条件下，对mn
2+
进行氧化去除，且去除效率高。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种无色杆菌，该无色杆菌(achromobacter sp.)的保藏编号为cctcc no：m20211051。
7.本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的无色杆菌。
8.优选地，所述菌剂含有所述无色杆菌的的活菌体、死菌体和发酵产物 中的至少一种；优选为活菌体。
9.优选地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为液态菌剂。
10.本发明第三方面提供上述的无色杆菌、上述的菌剂在去除mn
2+
中的应 用。
11.优选地，所述mn
2+
为酸性废液中的mn
2+
。
12.本发明第四方面提供一种去除mn
2+
的方法，包括以下步骤：将上述的 无色杆菌和/或上述的菌剂与含有mn
2+
的样品接触。
13.优选地，所述含有mn
2+
的样品为含有mn
2+
的酸性废液，优选为含有 mn
2+
的矿山酸性废水。
14.优选地，所述含有mn
2+
的酸性废液的ph为2-6。
15.优选地，所述接触的过程包括：将所述无色杆菌和/或所述菌剂与所述 含有mn
2+
的样品混合得到混合液，将所述混合液进行震荡培养；
16.优选地，所述混合液中所述无色杆菌的浓度为10
7-109cfu/ml；
17.所述震荡培养的条件至少满足：温度为30-40℃、转速为100-150rpm。
18.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
19.本发明提供的无色杆菌对mn
2+
具有显著的去除效率，尤其是在酸性条 件下也能够发挥对mn
2+
进行氧化及去除的作用，对含锰矿山酸性废水中 mn
2+
的去除率高达95％；该无色杆菌可作为优良的锰氧化菌，应用于矿山酸 性废水中锰的生物处理方面，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广等 优点。
20.生物保藏
21.本发明提供的菌株为无色杆菌(achromobacter sp.qbm-4)，并于2021 年8月18日被保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为 cctcc，地址位于湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为 cctcc no：m20211051。
附图说明
22.图1是实施例1获得的菌株qbm-4的系统发育树图；
23.图2是在不同ph条件下实施例1获得的菌株qbm-4的处理时间与mn
2+
的浓度关系图；
24.图3是实施例1获得的菌株qbm-4的处理时间与mno2的浓度关系图；
25.图4是实施例1获得的菌株qbm-4对矿山酸性废水(分别为ue、lt、 lm)中mn
2+
的去除率。
具体实施方式
26.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值， 这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来 说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及 单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值 范围应被视为在本文中具体公开。
27.第一方面，本发明第一方面提供一种无色杆菌(achromobacter sp.)， 于2021年8月18日被保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为 cctcc，地址位于湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为 cctcc no：m20211051。
28.本发明提供的无色杆菌从湖南省长沙市浏阳市硫铁矿尾矿的渗滤液中 分离得到。所述无色杆菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的 方法。
29.示例性地，所述无色杆菌的分离过程包括以下步骤：将渗滤液样品加入 液体培养基中培养后，每次按照0.5-2％的接种量连续富集，转接3-5次，将 最后一次的培养液稀释10
6-108倍，涂布于固体培养平板上，倒置培养；待 平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线进行纯化分离。
30.本发明提供的无色杆菌经过发酵培养能够产生大量的无色杆菌的活菌 体和/或发酵产物。本发明对发酵培养方法没有特别的限制，只要通过该发酵 培养方法可以使所述无色杆菌大量增殖即可。例如，可以将无色杆菌以接种 量为0.5-6体积％接种至液体培养基中，在温度为30-40℃、转速为100-150 rpm的条件下，进行震荡培养48-90h后得到发酵液。
31.根据本发明，无色杆菌的分离过程中及发酵培养时，采用的液体培养基 可以为本领域常规使用的培养基，固体培养平板由液体培养基内加入适量 的琼脂制成。优选情况
下，液体培养基含有k2hpo
4 0.05-0.2g/l、葡萄糖 0.2-0.4g/l、蛋白胨0.3-0.8g/l、酵母提取物0.1-0.3g/l、mgso4·
7h2o 0.1-0.3 g/l、nano
3 0.1-0.3g/l、cacl
2 0.05-0.2g/l、(nh4)2co
3 0.05-0.2g/l、柠檬酸 铁铵0.5-1g/l；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶于水后，用1m 的h2so4调节ph至4.0，121℃灭菌20min，再用0.22μm滤膜过滤添加 mnso4·
h2o，使得mnso4·
h2o浓度为0.1-0.3g/l。
32.第二方面，本发明提供一种菌剂，该菌剂含有上述的无色杆菌。
33.在本发明中，对所述菌剂中无色杆菌的浓度没有特别的限制，可以根 据具体的情况进行具体的选择。
34.根据本发明，所述菌剂含有所述无色杆菌的的活菌体、死菌体和发酵 产物中的至少一种；优选为活菌体。菌剂含有无色杆菌的的活菌体时，利用 无色杆菌的生长过程，对mn
2+
进行氧化，以有效去除mn
2+
。
35.根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途 的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的辅料(赋形剂)等成分，例 如所述菌剂可以为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为液态菌剂，例如可以为 无色杆菌的发酵液。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技 术人员所熟知，在此不再详细说明。
36.第三方面，本发明提供上述的无色杆菌、上述的菌剂在去除mn
2+
中的 应用。
37.根据本发明，上述的无色杆菌、上述的菌剂可以用于去除废液、废水或 者固废中的mn
2+
，以减小对环境的污染。优选情况下，所述mn
2+
为酸性废 液中的mn
2+
，即本发明提供的无色杆菌能够在酸性条件下存活并有效发挥 氧化去除mn
2+
的作用。
38.第四方面，本发明提供一种去除mn
2+
的方法，包括以下步骤：将上述 的无色杆菌和/或上述的菌剂与含有mn
2+
的样品接触。
39.根据本发明，所述含有mn
2+
的样品为含有mn
2+
的酸性废液，优选为含 有mn
2+
的矿山酸性废水。
40.根据本发明，所述含有mn
2+
的酸性废液的ph为2-6。
41.根据本发明，与含有mn
2+
的样品接触的无色杆菌的形式并没有特别的 限定，只要保证加入后所述无色杆菌能够对mn
2+
进行有效地氧化去除即 可，例如，可以为培养至对数期的活化菌体(发酵液或菌体沉淀)。
42.本发明对加入的无色杆菌数量也没有特别的限制，这可以根据所述含 有mn
2+
的样品中mn
2+
的含量来决定。
43.根据本发明，所述接触的过程包括：将所述无色杆菌和/或所述菌剂与 所述含有mn
2+
的样品混合得到混合液，将所述混合液进行震荡培养。含有 mn
2+
的样品为废液或者废水时，可直接与无色杆菌和/或菌剂混合；含有mn
2+
的样品为固废时，可将固废先配制为相应的溶液后，再与无色杆菌和/或菌剂 混合。
44.根据本发明，所述混合液中所述无色杆菌的浓度为10
7-109cfu/ml，具 体可以为107cfu/ml、5
×
107cfu/ml、108cfu/ml、5
×
108cfu/ml、 109cfu/ml，或者上述两个值之间的任意值。
45.根据本发明，所述震荡培养的条件至少满足：温度为30-40℃，具体可 以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃，或者上述两个值之间的任意值； 转速为100-150rpm，具体可以为100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、 150rpm，或者上述两个值之间的任意值。
46.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
47.以下实施例中，矿山酸性废水为湖南省长沙市浏阳市硫铁矿尾矿的渗滤液，节杆菌mn1405分离自锰矿样品，其他原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到；
48.活化培养基：k2hpo40.1g/l、葡萄糖0.3g/l、蛋白胨0.5g/l、酵母提取物0.2g/l、mgso4·
7h2o0.2g/l、nano30.2g/l、cacl20.1g/l、(nh4)2co30.1g/l、柠檬酸铁铵0.8g/l；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶于水后，用1m的h2so4调节ph至4.0，121℃灭菌20min；
49.液体培养基：k2hpo40.1g/l、葡萄糖0.3g/l、蛋白胨0.5g/l、酵母提取物0.2g/l、mgso4·
7h2o0.2g/l、nano30.2g/l、cacl20.1g/l、(nh4)2co30.1g/l、柠檬酸铁铵0.8g/l；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶于水后，用1m的h2so4调节ph至4.0，121℃灭菌20min，再用0.22μm滤膜过滤添加mnso4·
h2o，使得mnso4·
h2o浓度为0.2g/l；
50.固体培养平板：k2hpo40.1g/l、葡萄糖0.3g/l、蛋白胨0.5g/l、酵母提取物0.2g/l、mgso4·
7h2o0.2g/l、nano30.2g/l、cacl20.1g/l、(nh4)2co30.1g/l、柠檬酸铁铵0.8g/l、琼脂2g/l；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶于水后，用1m的h2so4调节ph至7.0，121℃灭菌20min，再用0.22μm滤膜过滤添加mnso4·
h2o，使得mnso4·
h2o浓度为0.2g/l。
51.实施例1
52.(1)将矿山酸性废水于4℃保存运输到实验室，作为目标菌的筛选材料；将5ml矿山酸性废水加入到100ml液体培养基中，在温度为35℃、转速为120rpm的条件下培养7天后，每次按照1体积％的接种量接种至液体培养基中进行连续富集，转接4次；
53.(2)将第4次富集的培养液稀释10
6-108倍涂布于固体培养平板上，35℃倒置培养1-3天；
54.(3)待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得qbm-4纯菌落。
55.将qbm-4纯菌落接种于液体培养基中，放入恒温震荡培养箱中在温度为35℃、转速为120rpm的条件下培养，进行分子生物学鉴定。
56.菌株qbm-4的分子生物学鉴定：采用sds方法或ste方法提取菌株qbm-4的总dna，将总dna稀释到约50ng/ul为模板，进行16srdna基因扩增，以通用引物27f(核苷酸序列如seqidno.1所示)和1492r(核苷酸序列如seqidno.2所示)为引物，进行pcr扩增，测定其全序列，获得的菌株qbm-4的16srdna核苷酸序列如seqidno.3所示。
57.seqidno.1(27f)：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；
58.seqidno.2(1492r)：5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’。
59.将菌株qbm-4的16srdna基因序列提交至genbank数据库，与genbank数据库中的序列进行网上同源性比较，初步鉴定出菌株qbm-4属于achromobactersp.，相似度为99％，菌株qbm-4的系统发育树图如图1所示。
60.实施例2
61.将实施例1得到的菌株qbm-4接入到活化培养基中，经过夜活化得到活化液，将活化液按1体积％的接种量接种至ph分别为4.0、5.0和6.0、mn
2+
浓度为60mg/l的液体培养基中得到混合液(混合液中无色杆菌的浓度为10
7-109cfu/ml)，并设置空白对照，将混合液在
19753的浓度为10
7-109cfu/ml)，将混合液在 温度为35℃、转速为120rpm的恒温培养箱中震荡培养，监测震荡培养前后 矿山酸性废水中的mn
2+
浓度，结果见表2。
74.表2
[0075][0076]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。 在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变 型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和 组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种无色杆菌，其特征在于，该无色杆菌(achromobacter sp.)的保藏编号为cctcc no：m20211051。2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有根据权利要求1所述的无色杆菌。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有所述无色杆菌的的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种；优选为活菌体。4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为液态菌剂。5.权利要求1所述的无色杆菌、权利要求2至4中任意一项所述的菌剂在去除mn
2+
中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述mn
2+
为酸性废液中的mn
2+
。7.一种去除mn
2+
的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的无色杆菌和/或权利要求2至4中任意一项所述的菌剂与含有mn
2+
的样品接触。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有mn
2+
的样品为含有mn
2+
的酸性废液，优选为含有mn
2+
的矿山酸性废水。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有mn
2+
的酸性废液的ph为2-6。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述接触的过程包括：将所述无色杆菌和/或所述菌剂与所述含有mn
2+
的样品混合得到混合液，将所述混合液进行震荡培养；优选地，所述混合液中所述无色杆菌的浓度为10
7-109cfu/ml；所述震荡培养的条件至少满足：温度为30-40℃、转速为100-150rpm。

技术总结
本发明涉及环境污染物生物处理技术，公开了一种无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用。所述无色杆菌(Achromobacter sp.)的保藏编号为CCTCC NO：M20211051。本发明还提供含有该无色杆菌的菌剂，以及该无色杆菌和菌剂在去除Mn


技术研发人员：罗琳 毛启明 周耀渝 罗子瑞 颜丙花 张嘉超 罗双 杨远
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：2021.10.08
技术公布日：2022/3/8