一种测定注射用炎琥宁含量的方法与流程

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种测定注射用炎琥宁含量的方法。


背景技术：

2.炎琥宁，其化学名称为：14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯-3，19-二琥珀酸半酯钾钠盐，分子式为：c28h34knao10
·
h2o。炎琥宁能抑制早期毛细血管通透性增高与炎性渗出和水肿，能特异性地兴奋垂体-肾上腺皮质功能，促进acth释放，增加垂体前叶中acth的生物合成；体外具有灭活腺病毒、流感病毒、呼吸道病毒等多种病毒的作用。注射用炎琥宁具有良好抗菌、抗病毒、清热解毒作用，临床上主要用于治疗病毒性上呼吸道感染和病毒性肺炎。
3.注射用炎琥宁的质量标准ws-10001-(hd-0043)-2002-2019中含量测定项使用脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品，采用hplc外标法计算。脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品保存条件为在-20℃条件下保存，该对照品的运输、储存和使用存在很大的挑战。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术提供一种测定注射用炎琥宁含量的方法，测定注射用炎琥宁含量，以羟苯乙酯为替代对照品，避免现行测定方法采用脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品的运输、储存和使用问题。本发明可减少高毒性试剂造成的环境污染，降低对实验人员健康的影响，促进检验检测方法环保性发展。本发明还提高检验方法的专属性，使该方法能更普遍应用于复杂样品含量测定和杂质检查中。
5.为解决以上技术问题，本技术提供的技术方案是一种测定炎琥宁制剂中成分含量的方法，包括：
6.替代对照品溶液贮备液的制备：取羟苯乙酯为替代对照品配制得到替代对照品溶液贮备液；
7.混合对照品溶液的制备：
8.取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品和所述替代对照品溶液贮备液混合，配制得到混合对照品溶液；
9.供试品溶液的制备：
10.取注射用炎琥宁样品和所述替代对照品溶液贮备液混合，配制得到供试品溶液；
11.定量测定：分别取所述混合对照品溶液及所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用紫外光谱图定性，测定并计算供试品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的含量。
12.优选地，高效液相色谱测定的条件为：
13.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
14.流动相：磷酸二氢钾溶液-乙醇；
15.柱温：39.0～41.0℃；
16.流速：0.995～1.005ml/min；
17.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯检测波长：250～254nm；
18.羟苯乙酯检测波长：257～260nm。
19.优选地，高效液相色谱测定的条件为：
20.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
21.流动相：磷酸二氢钾溶液-乙醇；
22.柱温：40℃；
23.流速：1.0ml/min；
24.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯检测波长：252nm；
25.羟苯乙酯检测波长：258nm；
26.优选地，流动相为0.1wt％磷酸二氢钾溶液-乙醇，磷酸二氢钾溶液-乙醇体积比 60～62：38～40。
27.优选地，流动相为0.1wt％磷酸二氢钾溶液-乙醇，磷酸二氢钾溶液-乙醇体积比 61：39。
28.优选地，所述0.1wt％磷酸二氢钾溶液用磷酸调节ph值至2.5。
29.优选地，所述替代对照品溶液贮备液中羟苯乙酯的浓度为0.3～0.4mg/ml；所述混合对照品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯浓度为104.5～104.6μg/ml；所述混合对照品溶液中羟苯乙酯的浓度为16.2～16.3μg/ml。
30.优选地，所述替代对照品溶液贮备液中羟苯乙酯的浓度为0.3244mg/ml。
31.优选地，所述混合对照品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯浓度为 104.56μg/ml。
32.优选地，所述混合对照品溶液中羟苯乙酯的浓度为16.22μg/ml。
33.优选地，所述替代对照品溶液贮备液的制备过程具体包括：取羟苯乙酯为替代对照品，加入乙醇溶液溶解并稀释，配制得到替代对照品溶液贮备液。
34.优选地，所述替代对照品溶液贮备液的制备过程具体包括：精密称取羟苯乙酯对照品16.22mg，置50ml量瓶中，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
35.优选地，所述混合对照品溶液的制备过程具体包括：精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品，加入所述替代对照品溶液贮备液，用乙醇溶液溶解并稀释，配制得到混合对照品溶液。
36.优选地，所述混合对照品溶液的制备过程具体包括：精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品10.54mg，置100ml量瓶中，精密加入5ml所述替代对照品溶液贮备液，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
37.优选地，所述供试品溶液的制备过程具体包括：取注射用炎琥宁样品，加入所述替代对照品溶液贮备液，采用乙醇溶液溶解并稀释，配制得到供试品溶液。
38.优选地，所述采用紫外光谱图定性具体包括：采用不同紫外吸收波长处吸光度比值定性羟苯乙酯色谱峰和穿心莲内酯琥珀酸半酯色谱峰。
39.优选地，所述采用紫外光谱图定性具体包括：采用最大紫外吸收波长和最小紫外吸收波长的吸光度比值定性羟苯乙酯色谱峰和穿心莲内酯琥珀酸半酯色谱峰。
40.优选地，所述供试品溶液的制备过程具体包括：精密称取注射用炎琥宁样品，置100ml量瓶中，精密加入5ml所述替代对照品溶液贮备液，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得。
41.优选地，所述定量测定具体包括：
42.a、分别取所述混合对照品溶液及所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定；
43.b、基于所述混合对照品溶液得到的高效液相色谱测定结果，计算得到相对校正因子；
44.c、根据相对校正因子和基于所述供试品溶液得到的高效液相色谱测定结果，计算得到供试品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的含量。
45.优选地，所述步骤(b)具体包括：基于不同体积相同浓度的混合对照品溶液得到高效液相色谱图，计算相对校正因子；
46.校正计算公式：f
rt
＝(c
t
×ar
)/(a
t
×cr
)；
47.其中：f
rt
为相对校正因子，a
t
为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯峰面积，c
t
为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯浓度，ar为羟苯乙酯峰面积，cr为羟苯乙酯浓度。
48.优选地，所述相对校正因子为混合对照品溶液进样体积为20μl、16μl、12μl、 8μl、4μl、2μl的相对校正因子的平均值。
49.优选地，相对校正因子为5.1938。
50.优选地，所述供试品溶液进样体积为10μl。
51.优选地，所述供试品溶液中炎琥宁含量为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯含量与 1.1466相乘。
52.优选地，所述方法还包括：以脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯紫外吸收波长定性脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯色谱峰，以羟苯乙酯的紫外吸收波长定性羟苯乙酯色谱峰。
53.优选地，所述方法还包括：脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的最大吸收波长为 252nm，最小吸收波长为232nm；羟苯乙酯的最大吸收波长为258nm，最小吸收波长为226nm。
54.优选地，所述高效液相色谱检测器为二极管阵列检测器。
55.现行注射用炎琥宁高效液相色谱法检测中采用甲醇或者乙腈为流动相有机相，甲醇和乙腈属于第二类溶剂，毒性大，对环境保护、实验人员健康均有较大影响。
56.现行hplc方法中，色谱峰的定性多采用保留时间，部分中药标准规定相对保留时间应在
±
5％范围之内，在检验过程中发现不同色谱柱性能的不同，各色谱峰的相对保留时间存在一定差异，故通过相对保留时间对待测成分进行定性的方法存在一定的不确定性。即保留时间定性色谱峰存在一定的不确定性。
57.本技术与现有技术相比，其详细说明如下：
58.本发明建立替代对照品法，并应用于检测注射用炎琥宁，解决对照品需特殊管理的问题，是药品检验方法经济性和节约性发展的需要。避免现行测定方法采用脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品的运输、储存和使用问题。
59.进一步本发明开展使用低毒性的乙醇替代高毒性的甲醇、乙腈作为c
18
、c8柱反相高效液相色谱法的有机相进行研究。揭示应用乙醇为流动相时柱温、流动相比例、柱压、色谱柱品牌和检测成分分离情况之间的变化规律，使乙醇能普遍地替代甲醇(乙腈)，应用于使用c
18
、c8柱的反相高效液相色谱法的检验项目，建立选定药品反相高效液相色谱法含量测定方法。有助于减少高毒性试剂造成的环境污染，降低对实验人员健康的影响，促进检验检测方法环保性发展。
有限公司)，磷酸[分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司]，乙醇(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)，磷酸二氢钾(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)，试验用水为纯化水。95％乙醇为体积百分比95％的乙醇，50％乙醇为体积百分比50％的乙醇。
[0077]
2方法与结果
[0078]
2.1色谱条件
[0079]
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。流动相：0.1wt％磷酸二氢钾溶液 (用磷酸调节ph值至2.5)-乙醇(磷酸二氢钾溶液和乙醇体积比61：39；检测波长： 252nm(脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯)/258nm(羟苯乙酯)；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl。
[0080]
2.2溶液的配制
[0081]
2.2.1羟苯乙酯对照品贮备液的制备
[0082]
精密称取羟苯乙酯对照品(100847-201203，含量100％，中检院)16.22mg，置 50ml量瓶中，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(羟苯乙酯的浓度为0.3244mg/ml)。
[0083]
2.2.2混合对照品溶液的制备
[0084]
精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品(111598-201815，含量为99.2％，中检院)10.54mg，置100ml量瓶中，精密加入5ml羟苯乙酯对照品贮备液，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯浓度为104.56μg/ml，羟苯乙酯的浓度为16.22μg/ml)。
[0085]
2.2.3供试品溶液的制备
[0086]
精密称取装量差异项下的内容物适量(相当于脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯 10mg)，置100ml量瓶中，精密加入5ml羟苯乙酯对照品贮备液，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0087]
2.2.4阴性溶液的配制：取甘露醇，照处方比例(炎琥宁80mg：甘露醇40mg) 配制阴性溶液。
[0088]
2.3测定波长的选择
[0089]
根据羟苯乙酯和脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯紫外光谱图，羟苯乙酯在258nm波长处有最大吸收，在226nm波长处有最小吸收，峰形较尖锐；脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在252nm波长处有最大吸收，在232nm波长处有最小吸收，见图1(羟苯乙酯和脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯紫外光谱图)。
[0090]
经过考察，确定测定波长为252nm(脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯)/258nm(羟苯乙酯)。
[0091]
2.4柱温的考察
[0092]
乙醇粘度大，作为流动相时柱压高。在2.1色谱条件下，考察乙醇为流动相时柱温、乙醇比例、不同品牌色谱柱与柱压之间的关系。当柱温40℃时，流动相中乙醇体积比为40％、30％、20％、10％时，柱压分别为215bar、193bar、159bar、127 bar，降低40％；当柱温30℃时，乙醇体积比为20％、10％时，柱压分别为196bar、 152bar，说明升高柱温可以降低柱压。
[0093]
乙醇极性强于甲醇(乙腈)，洗脱能力强于甲醇(乙腈)，提示在现行法定方法中，采用乙醇替代甲醇(乙腈)时，乙醇的使用比例小于甲醇(乙腈)，系统压力可以耐受，增加了替
代的普遍性和适用性。
[0094]
在2.1项下色谱条件，采用6个不同品牌色谱柱，柱压范围220bar～180bar，说明各品牌色谱柱在此条件下均适用，该方法可以推广于各品牌的c
18
色谱柱。
[0095]
2.5专属性试验
[0096]
分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，见图2混合对照品溶液色谱图，图3供试品溶液色谱图，图4阴性溶液色谱图，图2～图3中1.羟苯乙酯，2.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯。
[0097]
脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯峰与羟苯乙酯峰保留时间比值为1.5286。采用二极管阵列检测器采集的紫外光谱进行定性：
[0098]
一、紫外光谱图特征吸收波长，混合对照品溶液和供试品溶液中，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯紫外光谱图均在252nm波长处有最大吸收，在232nm波长处有最小吸收，羟苯乙酯紫外光谱图均在258nm波长处有最大吸收，在226nm波长处有最小吸收，紫外光谱图特征吸收波长一致；
[0099]
二、选定波长处吸光度比值，混合对照品溶液中，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在252nm波长处与232nm的波长处吸光度比值为1.3979，羟苯乙酯在258nm波长处与226nm的波长处吸光度比值分别为6.8821；供试品溶液中，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在252nm波长处与232nm的波长处吸光度比值为1.3993，羟苯乙酯在 258nm波长处与226nm的波长处吸光度比值分别为6.9242，选定波长处吸光度比值较稳定。
[0100]
2.6相对校正因子(f)值的测定
[0101]
精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品(111598-201815，含量为99.2％，中检院)10.12mg和10.45mg，按2.2.2配制混合对照品溶液，加上2.2.2项下混合对照品溶液，共计3份混合对照品溶液，分别精密量取各混合对照品溶液20μl、16μl、 12μl、8μl、4μl、2μl，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图，按f
rt
＝(c
t
×ar
)/(a
t
×cr
) 计算，再求得算术平均值，即得相对校正因子(f)，其中c
t
和a
t
为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的浓度和峰面积，cr和ar为羟苯乙酯的浓度和峰面积。三份溶液的相对校正因子(f)分别为5.2084，5.2229，5.1500，均值5.1938，rsd为0.74％，以均值作为最终相对校正因子(f)。
[0102]
2.7相对校正因子(f)耐受性考察
[0103]
取2.2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在使用3台不同液相色谱仪、6个不同品牌c
18
色谱柱、3根相同品牌不同批号c
18
色谱柱和改变测定波长(250/256，251/257，252/258，253/259，254/260nm)、柱温(39.0，39.5，40.0，40.5， 41.0℃)、流动相{乙醇-0.1％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph值至2.5)}比例(38： 62，38.5：61.5，39：61，39.5：60.5，40：60)、流动相ph值(2.4、2.45、2.5、2.55 和2.6)、流速(0.995，0.998，1.000，1.002，1.005ml.min-1
)的条件下进行测定，计算相对校正因子(f)。
[0104]
结果见表1
[0105]
表1相对校正因子(f)耐受性考察和紫外光谱稳定性考察结果
[0106][0107][0108]
表1结果表明上述不同液相色谱仪、不同品牌c
18
色谱柱、相同品牌不同批号 c
18
色谱柱、波长、流动相ph值、柱温、流动相比例、流速对相对校正因子(f)没有显著影响。
[0109]
2.8紫外光谱稳定性和相对保留时间考察
[0110]
提取2.7项下各测定条件下脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯的紫外光谱图，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在252
±
2nm波长处有最大吸收，在232
±
2nm波长处有最小吸收，羟苯乙酯在258
±
2nm波长处有最大吸收，在226
±
2nm波长处有最小吸收，说明在各考察条件下两组分特征吸收波长稳定。
[0111]
在各条件下，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯紫外光谱吸光度比值(252nm/232nm) 为1.3961～1.3998，rsd为0.04％～1.80％，均值1.3980，rsd为0.08％，比值稳定；羟苯乙酯紫外光谱图吸光度比值(258nm/226nm)为6.8163～6.9277，rsd为 0.09％～2.34％，均值6.9019，rsd0.54％，比值稳定。
[0112]
在各考察条件下，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯的相对保留时间波动较大，rsd为0.34％～9.80％，均值1.5188，rsd为4.71％，具有不确定性，对相对保留时间变动影响较大的是不同品牌c
18
色谱柱、不同液相色谱仪、流动相比例，影响较小的是柱温、流速、相同品牌c
18
色谱柱、流动相ph值、测定波长。色谱峰紫外光谱不同波长处吸光度比值较稳定，适合做为色谱峰定性的依据。
[0113]
2.9线性和范围考察
[0114]
分别精密量取2.2.2项下混合对照品溶液20μl、16μl、12μl、8μl、4μl、2μl，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积(a)与浓度(c，μg
·
ml-1
)进行线性回归，绘制标准曲线，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯分别在20.91～209.12 μg
·
ml-1
(r＝1.0000)和3.24～32.44μg
·
ml-1
(r＝1.0000)浓度范围内与峰面积有较好的线性关系，回归方程分别为a＝10.3467c-1.9449，a＝53.7465c-0.7737。
[0115]
2.10精密度试验
[0116]
精密量取2.2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，重复进样 6次，记录峰面积。结果脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯峰面积的rsd分别为0.06％和0.10％，仪器进样精密度好。
[0117]
2.11重复性试验
[0118]
取注射用炎琥宁(批号210219011)，照2.2.3平行制备6份供试品溶液，照2.1 项下色谱条件进样分析，记录峰面积，以相对校正因子(f)计算含量。结果脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯含量为96.20％，rsd为1.10％，表明方法重复性好。
[0119]
2.12稳定性试验
[0120]
取2.2.3项下供试品溶液，分别于室温放置0、4、8、12、24、36、48h，按 2.1项下色谱条件测定，记录峰面积。结果脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯峰面积的rsd分别为1.01％和0.86％，样品溶液在室温条件下48h内稳定。
[0121]
2.13回收率试验
[0122]
羟苯乙酯对照品贮备液的制备：精密称取羟苯乙酯对照品(100847-201203，含量100％，中检院)16.25mg，置50ml量瓶中，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0123]
供试品溶液的制备：精密称取炎琥宁原料适量(约相当于脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯10mg)和甘露醇5mg，置100ml量瓶中，精密加入5ml羟苯乙酯对照品贮备液，用50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0124]
平行制备6份供试品溶液，照2.1项下色谱条件进样分析，按c
t
＝f
×at
×cr
/ar计算，c
t
和a
t
为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的浓度和峰面积，cr和ar为羟苯乙酯的浓度和峰面积，供试品中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的含量与1.1466相乘，即得炎琥宁的含量。
[0125]
结果见表2
[0126]
表2回收率结果(n＝6)
[0127][0128]
表2结果表明方法准确度高。
[0129]
2.14样品含量测定
[0130]
取装量差异项下的内容物，精密称定，混匀，精密称取适量(约相当于脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯10mg)，照2.2.3方法制备供试品溶液，取供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按2.12项下方法计算样品中炎琥宁的含量，并将结果与外标法测定结果采用配对t检验统计学分析，sig.＞p(0.05)，两者结果无显著性差异，见表3。
[0131]
表3样品含量测定结果(n＝3)
[0132][0133]
3讨论(只要前后没有矛盾，这部分对前面的结果进行了更详细论述可以保留，例如：“当采用35％时，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯出峰时间21min，出峰太慢，当采用39％时，两成分出峰时间合适，与相邻杂质峰的分离度符合要求”)
[0134]
3.1样品溶剂和流动相的选择
[0135]
考察了无水乙醇、95％乙醇、50％乙醇对样品的影响，采用无水乙醇、95％乙醇时，样品溶解较差，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯峰展宽，前拖尾；采用50％乙醇时，溶解好，峰形好。调整流动相乙醇体积比35％、39％和40％，当采用35％时，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯出峰时间21约min，出峰太慢，当采用39％时，两成分出峰时间合适，与相邻杂质峰的分离度符合要求。
[0136]
3.2采用乙醇为流动相时柱温、乙醇比例、不同品牌色谱柱与柱压之间的关系
[0137]
以本方法色谱条件为例，当采用柱温40℃时，流动相b体积比从39％调整到 10％，柱压从215bar降到127bar，降低40％；当采用柱温30℃时，流动相b体积比为20％，柱压为196bar，与柱温40℃相比，增高约20％。
[0138]
结果显示，升高柱温可以降低系统压力，乙醇极性强于甲醇(乙腈)，洗脱能力强于甲醇(乙腈)，提示在现行法定方法中，采用乙醇替代甲醇(乙腈)时，乙醇的使用比例小于甲醇(乙腈)，系统压力可以耐受，增加了替代的普遍性和适用性。
[0139]
采用2.6项下不同品牌色谱柱，按2.1项下色谱条件采集数据时，系统压力220 bar～180bar，说明各色谱柱在此条件下均适用，该方法可以推广于各品牌的c
18
色谱柱。
[0140]
3.3紫外光谱不同波长处吸光度比值定性色谱峰
[0141]
考察不同液相色谱仪、不同品牌c
18
色谱柱、相同品牌不同批号c
18
色谱柱、波长、流动相ph值、柱温、流动相比例、流速对脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯相对保留时间的影响，显示相对保留时间波动较大，具有不确定性，尤其是不同品牌c
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色谱柱、不同液相色谱仪、流动相比例、柱温与流速的影响较大，rsd 为9.80％～2.27％。
[0142]
根据脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和羟苯乙酯的紫外光谱图，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在252nm波长处有最大吸收，在232nm波长处有最小吸收；羟苯乙酯在 258nm波长处有最大吸收，在226nm波长处有最小吸收，峰形较尖锐，在212nm 波长处有一较平缓的肩峰，各特征吸收波长在2.6各考察条件下稳定，可以作为定性的依据。根据特征吸收波长，选取
特征吸收波长吸光度比值，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯(252nm/232nm)和羟苯乙酯(258nm/226nm)定性两色谱峰，结果显示对照品溶液和供试品溶液中两成分的特征吸收波长和选定波长处吸光度比值较稳定。
[0143]
考察不同液相色谱仪、不同品牌c
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色谱柱、相同品牌不同批号c
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色谱柱、波长、流动相ph值、柱温、流动相比例、流速对两成分特征吸收波长和选定波长处吸光度比值的影响，结果显示，两物质特征吸收波长稳定。在各考察条件下，脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯选定波长处吸光度(252nm/232nm)比值稳定，rsd均小于 2％，羟苯乙酯(258nm/226nm)比值稳定，rsd均小于2％除不同液相色谱仪(2.34％) 外，主要原因是羟苯乙酯在226nm波长处峰形较尖锐，不同仪器的紫外光谱采集参数(如采样速率、分离度)有一定的影响。
[0144]
说明相对保留时间波动较大，具有不确定性。各物质紫外特性吸收波长和选定波长处吸光度比值较稳定，适用于物质峰定性。适宜选取各物质紫外光谱图中较平缓的特征吸收波长。
[0145]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种测定注射用炎琥宁含量的方法，其特征在于，包括：替代对照品溶液贮备液的制备：取羟苯乙酯为替代对照品配制得到替代对照品溶液贮备液；混合对照品溶液的制备：取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品和所述替代对照品溶液贮备液混合，配制得到混合对照品溶液；供试品溶液的制备：取注射用炎琥宁样品和所述替代对照品溶液贮备液混合，配制得到供试品溶液；定量测定：分别取所述混合对照品溶液及所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用紫外光谱图定性，测定并计算供试品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高效液相色谱测定的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：磷酸二氢钾溶液-乙醇；柱温：39.0～41.0℃；流速：0.995～1.005ml/min；脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯检测波长：250～254nm；羟苯乙酯检测波长：257～260nm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述替代对照品溶液贮备液的制备过程具体包括：取羟苯乙酯为替代对照品，加入乙醇溶液溶解并稀释，配制得到替代对照品溶液贮备液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合对照品溶液的制备过程具体包括：精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品，加入所述替代对照品溶液贮备液，用乙醇溶液溶解并稀释，配制得到混合对照品溶液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备过程具体包括：取注射用炎琥宁样品，加入所述替代对照品溶液贮备液，采用乙醇溶液溶解并稀释，配制得到供试品溶液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用紫外光谱图定性具体包括：采用不同紫外吸收波长处吸光度比值定性羟苯乙酯色谱峰和穿心莲内酯琥珀酸半酯色谱峰。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用紫外光谱图定性具体包括：采用最大紫外吸收波长和最小紫外吸收波长的吸光度比值定性羟苯乙酯色谱峰和穿心莲内酯琥珀酸半酯色谱峰。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量测定具体包括：a、分别取所述混合对照品溶液及所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定；b、基于所述混合对照品溶液得到的高效液相色谱测定结果，计算得到相对校正因子；c、根据相对校正因子和基于所述供试品溶液得到的高效液相色谱测定结果，计算得到供试品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的含量。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括：基于不同体积相同浓度的混合对照品溶液得到高效液相色谱图，计算相对校正因子；校正计算公式：f
rt
＝(c
t
×
a
r
)/(a
t
×
c
r
)；
其中：f
rt
为相对校正因子，a
t
为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯峰面积，c
t
为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯浓度，a
r
为羟苯乙酯峰面积，c
r
为羟苯乙酯浓度。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中炎琥宁含量为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯含量与1.1466相乘。

技术总结
本发明公开一种测定注射用炎琥宁含量的方法，包括：替代对照品溶液贮备液的制备：取羟苯乙酯为替代对照品配制得到替代对照品溶液贮备液；混合对照品溶液的制备：取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品和所述替代对照品溶液贮备液混合，配制得到混合对照品溶液；供试品溶液的制备：取注射用炎琥宁样品和所述替代对照品溶液贮备液混合，配制得到供试品溶液；定量测定：分别取所述混合对照品溶液及所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯含量，进而得到炎琥宁的含量；所述方法避免了现行测定方法采用脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品的运输、储存和使用问题。储存和使用问题。储存和使用问题。


技术研发人员：王丽琼 魏长勇 方艺霖 袁波 周筠 余敏灵 唐婷婷 吴丽
受保护的技术使用者：乐山市食品药品检验检测中心（乐山市药品不良反应监测中心）
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2022/3/8