基于CRISPR-Cas反式切割和gFET核酸检测

基于crispr-cas反式切割和gfet核酸检测
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于crispr-cas13a/cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法。


背景技术：

2.针对病毒感染及疾病诊断，快速灵敏的核酸检测技术十分关键。目前，rt-qpcr是核酸检测的金标准，该方法可实现高灵敏、高特异的疾病诊断。但是，rt-qpcr的检测过程需要专业人员进行多步的样品处理和控温设备进行多个周期的反应，限制了rt-qpcr在现场检测中的应用。
3.近年来，crispr-cas系统由于其多样性和cas蛋白特殊的核酸酶活性，在生物传感器的开发中展现出巨大的潜力。其中，cas12a和cas13a具有独特的反式切割活性，近年来被广泛地应用于生物传感领域。目前，基于cas12a/cas13a的高灵敏核酸检测方式主要依赖于核酸等温扩增技术，但存在反应系统复杂、检测时间长以及样品易污染等问题。因此，亟待开发一种无扩增、高灵敏的单分子检测方式。
4.石墨烯具有比表面积大、无悬挂键、载流子浓度和载流子迁移率高、能带结构易于调节等特点，使其表面易于感知微小的电荷变化。石墨烯场效应晶体管(gfet)传感器是以石墨烯为沟道材料制作的场效应晶体管器件，待检dna与固定于石墨烯表面的互补dna杂交实现核酸检测，但其检测灵敏度仍有待进一步提高。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明了提供一种基于crispr-cas13a/cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，cas13a/cas12a或游离于溶液中，或通过不同长度的peg链固定于石墨烯表面，不同长度的peg可以为cas蛋白的剪切活动提供适当的空间。当目标核酸激活cas13a/cas12a后，cas13a/cas12a可以快速切割固定于石墨烯表面的ssrna/ssdna，每秒钟发生上千次的切割，导致gfet中源极和漏极之间电流发生快速改变，转移特性曲线发生移动，实现目标核酸的超灵敏检测。其中，将cas13a/cas12a固定于石墨烯表面，免去了蛋白扩散到石墨烯表面的时间，使其更接近剪切目标，实现更快速更灵敏的核酸检测。
6.一方面，本技术提供了一种核酸检测方式，其使用场效应晶体管放大溶液中crispr-cas13a/cas12a反式切割的信号(如图1)。
7.进一步地，所述方法包括场效应晶体管的制备步骤、报告分子修饰步骤以及核酸检测步骤。
8.进一步地，所述场效应晶体管的制备步骤包括：定制商业化gfet芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液和出液管道插入腔室，用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。
9.进一步地，报告分子修饰步骤包括将pbase溶液在石墨烯通道表面孵育1-2h、将氨基修饰的ssrna或ssdna溶液在石墨烯表面孵育2-12h，以及可选的用乙醇胺进行封闭1h。
10.进一步地，pbase溶液浓度为1-3mm；和/或氨基修饰的ssrna或ssdna溶液浓度为1-5μm；和/或乙醇胺溶液浓度为100-500mm；
11.进一步地，所述ssrna或ssdna的长度为10-30nt的随机序列。
12.进一步地，所述pbase溶液溶剂为乙醇或dmf。
13.进一步地，所述核酸检测步骤包括将cas12a或cas13a与crrna形成复合物，将检测样本与复合物混合后添加到场效应晶体管中，反应后记录转移特性曲线的变化。
14.进一步地，混合cas12a或cas13a与crrna溶液以形成复合物，cas12a或cas13a与crrna溶液浓度比为1:1。
15.进一步地，所述的cas13a/cas12a的浓度为40-60nm,反应条件为25-37℃下反应30-180min。
16.进一步地，检测的对象可选sars-cov-2n基因、sars-cov-2e基因、sars-cov-2orf1ab基因、hpv-16或hpv-18。
17.进一步地，crrna序列选自seq id no.1-5。
18.另一方面，为了进一步提高检测灵敏度，本技术提供了另一种核酸检测方法，其使用场效应晶体管放大固定于石墨烯表面的crispr-cas13a/cas12a反式切割的信号(如图2)。
19.进一步地，所述方法包括场效应晶体管的制备步骤、cas13a/cas12a和报告分子修饰步骤、cas13a/cas12a-crrna复合体的构建步骤以及核酸检测步骤。
20.进一步地，所述场效应晶体管的制备步骤包括：定制商业化gfet芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液和出液管道插入腔室，用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。
21.进一步地，cas13a/cas12a和报告分子修饰步骤包括将pbase溶液在石墨烯通道表面孵育1-2h、mgcl2溶液清洗、将peg和氨基修饰的ssrna/ssdna溶液加入石墨烯表面2-12h，可选的，使用乙醇胺溶液封闭1h。
22.进一步地，所述pbase溶液浓度为1-3mm；和/或peg一端标记氨基另一端标记羧基或生物素；和/或ssrna/ssdna溶液浓度为1-5μm；和/或乙醇胺溶液浓度为100-500mm；和/或所述pbase溶液溶剂为乙醇或dmf。
23.进一步地，所述peg的分子量为1000-10000；ssrna或ssdna的长度为10-30nt的随机序列；peg和氨基修饰的ssrna或ssdna浓度比例为1:3-1:10。
24.进一步地，所述cas13a/cas12a-crrna复合体的构建步骤包括用体积比为1:1的n-(3-二甲氨基丙基)-n
’‑
乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化peg尾端的羧基，活化时间为5-10min(仅peg尾端修饰羧基需要该活化步骤)，cas13a/cas12a溶液和crrna溶液分别先后引入石墨烯表面各孵育30min-60min，使cas13a/cas12a固定在石墨烯表面后与crrna形成cas-crrna复合体。
25.进一步地，edc和nhs的浓度分别为4mm和11mm,cas13a/cas12a为无标记cas13a/cas12a或亲和素标记cas13a/cas12a(sa-cas13a/cas12a)溶液浓度为1-3μm；和/或crrna溶
液浓度为1-9μm。
26.进一步地，核酸检测步骤包括将检测样本与复合物混合后添加到场效应晶体管中，反应后记录转移特性曲线的变化。
27.进一步地，反应条件为25-37℃下反应30-180min。
28.进一步地，检测的对象可选sars-cov-2n基因、sars-cov-2e基因、sars-cov-2orf1ab基因、hpv-16或hpv-18。
29.进一步地，crrna序列选自seq id no.1-5。
30.本技术中的：场效应晶体管和gfet、1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯和pbase、n-(3-二甲氨基丙基)-n
’‑
乙基碳二亚胺和edc、n-羟基琥珀酰亚胺和nhs可以交替使用。
31.本技术的方法可用于检测人体或动物体样本病原体等的诊断用途；也可以用于检测环境、食品样本等中病原体；检测非病原体的其他核酸等的非诊断用途。
附图说明
32.图1为基于溶液中cas13a/cas12a反式切割特性和gfet核酸检测原理图；
33.图2为基于固定在石墨烯表面的cas13a/cas12a反式切割特性和gfet核酸检测原理图；
34.图3为实例1实验结果图。
具体实施方式
35.下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
36.一、基于cas13a反式切割和gfet核酸检测方法
37.实施例1：用于sars-cov-2e基因的检测
38.1.gfet制备：定制商业化gfet芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液和出液管道插入腔室，用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。
39.2.报告分子的修饰：
40.(1)将溶于乙醇中浓度为1mm的pbase在石墨烯通道表面孵育2h，使pbase结合到石墨烯表面，随后用100％乙醇和2mm的mgcl2溶液(溶剂为无核酸的水)充分清洗；
41.(2)将1μm的r-polyn
10
(序列见表1)在石墨烯通道表面孵育6h，使r-polyn
10
报告分子与pbase连接，进而固定在石墨烯表面，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
42.(3)将100mm乙醇胺在石墨烯通道表面孵育1h，对石墨烯进行封闭，封闭结束后用2mm的mgcl2溶液充分清洗。
43.3.sars-cov-2e基因的检测：
44.(1)将cas13a与e-crrna(序列见表1)以1:1的浓度比混合，使cas13a终浓度为40nm,形成cas13a-crrna复合物；
45.(2)利用病毒核酸提取试剂盒提取sars-cov-2的核酸，并将其与cas13a-crrna复合物混合，并将混合溶液添加到gfet中，37℃下反应30min后，记录加样前后转移特性曲线变化(如图3)。
46.实施例2：用于sars-cov-2n基因的检测
47.1.gfet制备：同实施例1。
48.2.cas13a和报告分子的固定：
49.(1)将浓度为2mm的pbase溶液(溶剂为乙醇)在石墨烯表面孵育1.5小时，使pbase固定到石墨烯表面，随后用100％乙醇和2mm的mgcl2溶液(溶剂为无核酸的水)充分清洗；
50.(2)将nh2-peg-cooh(分子量为5000)和氨基修饰的r-polyn
20
(序列见表1)以浓度比为1：3的比例加入石墨烯表面孵育，r-polyn
20
浓度为2μm，孵育2h，使两者以不同密度修饰在石墨烯表面，并用200mm乙醇胺封闭，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
51.(3)将体积比为1:1的edc(4mm)和nhs(11mm)引入石墨烯表面5min，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
52.(4)将1μm的cas13a和3μm的n-crrna分别先后引入石墨烯表面，各孵育60min，使cas13a固定在石墨烯表面后与n-crrna形成cas-crrna复合体，用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
53.3.sars-cov-2n基因的检测：利用病毒核酸提取试剂盒提取sars-cov-2的核酸，并将其添加到gfet中，37℃下反应30min后，记录加样前后转移特性曲线变化，类似图3，样品中n基因与cas13a-crrna复合体结合之后，激活cas13a切割r-polyn
20
，导致转移特性曲线向右移动。
54.实施例3：用于sars-cov-2orf1ab基因的检测
55.1.gfet制备：同实施例1。
56.2.cas13a和报告分子的固定：
57.(1)将浓度为3mm的pbase溶液(溶剂为乙醇)在石墨烯表面孵育1小时，使pbase固定到石墨烯表面，随后用100％乙醇和2mm的mgcl2溶液(溶剂为无核酸的水)充分清洗；(2)将nh2-peg-biotin(分子量为8000)和氨基修饰的r-polyn
30
(序列见表1)以浓度比为1:5的比例加入石墨烯表面，r-polyn
30
浓度为5μm，孵育6h，使两者以不同密度修饰在石墨烯表面，并用500mm乙醇胺封闭，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
58.(3)将2μm的sa-cas13a和6μm的orf1ab-crrna分别先后引入石墨烯表面，各孵育40min使cas13a固定在石墨烯表面后与orf1ab-crrna形成cas-crrna复合体，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
59.3.sars-cov-2orf1ab基因的检测：利用病毒核酸提取试剂盒提取sars-cov-2的核酸，并将其添加到gfet中，37℃下反应30min后，记录加样前后转移特性曲线变化，类似图3，样品中orf1ab基因与cas13a-crrna复合体结合之后，激活cas13a切割r-polyn
30
，导致转移特性曲线向右移动。
60.二、基于cas12a反式切割和gfet核酸检测方法
61.实施例4用于hpv-16的检测
62.1.gfet制备：同实施例1。
63.2.报告分子的修饰：
64.(1)将溶于乙醇中浓度为2mm的pbase在石墨烯通道表面孵育1.5h，使pbase结合到石墨烯表面，随后用100％乙醇和2mm的mgcl2溶液(溶剂为无核酸的水)充分清洗；
65.(2)将5μm的d-polyn
20
(序列见表1)在石墨烯通道表面孵育2h，使d-polyn报告分子
与pbase连接，进而固定在石墨烯表面，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
66.(3)将200mm乙醇胺在石墨烯通道表面孵育1h，对石墨烯进行封闭，用2mm的mgcl2溶液充分清洗。
67.2.hpv-16检测：
68.(1)将cas12a与hpv16-crrna(序列见表1)以1:1的浓度比混合，使cas12a终浓度为50nm,形成cas12a-crrna复合物；
69.(2)利用病毒核酸提取试剂盒提取hpv的核酸，并将其与cas12a-crrna复合物混合，并将混合溶液添加到gfet中，25℃下反应30min后，记录加样前后转移特性曲线变化，类似图3，转移特性曲线向右移动。
70.实施例5用于hpv-18的检测
71.1.gfet制备：同实施例1。
72.2.cas12a和报告分子的固定：
73.(1)将浓度为3mm的pbase溶液(溶剂为乙醇)在石墨烯表面孵育1小时，使pbase固定到石墨烯表面，随后用100％乙醇和2mm的mgcl2溶液(溶剂为无核酸的水)充分清洗；
74.(2)将nh2-peg-cooh(分子量为10000)和氨基修饰的d-polyn
30
(序列见表1)以浓度比为1:10的比例加入石墨烯表面，d-polyn
30
浓度为5μm，孵育12h，使两者以不同密度修饰在石墨烯表面，并用500mm乙醇胺封闭，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
75.(3)将体积比为1:1的edc(4mm)和nhs(11mm)引入石墨烯表面10min，随后用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
76.(4)将3μm的cas12a和9μm的hpv18-crrna分别先后引入石墨烯表面，各孵育30min，使cas12a固定在石墨烯表面后与hpv18-crrna形成cas-crrna复合体，用2mm的mgcl2溶液充分清洗；
77.3.hpv18的检测：利用病毒核酸提取试剂盒提取hpv的核酸，并将其添加到gfet中，37℃下反应30min后，记录加样前后转移特性曲线变化，类似图3，转移特性曲线向右移动。
78.表1本发明涉及的核酸序列
79.80.
技术特征：
1.一种核酸检测方法，其特征在于，其使用场效应晶体管放大溶液中cas13a/cas12a反式切割的检测信号。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括场效应晶体管的制备步骤、报告分子修饰步骤以及核酸检测步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述场效应晶体管的制备步骤包括：定制商业化gfet芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液和出液管道插入腔室，用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。4.根据权利要求2所述的方法，其中报告分子修饰步骤包括将pbase溶液在石墨烯通道表面孵育1-2h、将氨基修饰的ssrna或ssdna溶液在石墨烯表面孵育2-12h，以及可选的用乙醇胺进行封闭1h。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述pbase溶液浓度为1-3mm；和/或氨基修饰的ssrna或ssdna溶液浓度为1-5μm；和/或乙醇胺溶液浓度为100-500mm；6.根据权利要求4所述的方法，所述ssrna或ssdna的长度为10-30nt的随机序列。7.根据权利要求4所述的方法，所述pbase溶液溶剂为乙醇或dmf。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述的核酸检测步骤包括将cas12a或cas13a与crrna形成复合物，将检测样本与复合物混合后添加到场效应晶体管中，反应后记录转移特性曲线的变化。9.根据权利要求8所述的方法，所述cas13a/cas12a的浓度为40-60nm,反应条件为25-37℃下反应30-180min。10.根据权利要求8所述的方法，其中检测的对象可选sars-cov-2n基因、sars-cov-2e基因、sars-cov-2orf1ab基因、hpv-16或hpv-18；优选地，crrna序列选自seq id no.1-5。11.一种核酸检测方法，其特征在于，其使用场效应晶体管放大固定于石墨烯表面cas13a/cas12a反式切割的检测信号。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括cas13a/cas12a和报告分子修饰步骤、cas13a/cas12a-crrna复合体的构建步骤以及核酸检测步骤。13.根据权利要求12所述的方法，其中cas13a/cas12a和报告分子修饰步骤包括将pbase溶液在石墨烯通道表面孵育1-2h、mgcl2溶液清洗、将peg和氨基修饰的ssrna/ssdna溶液加入石墨烯表面2-12h，可选的，使用乙醇胺溶液封闭1h。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述pbase溶液浓度为1-3mm；和/或peg一端标记氨基另一端标记羧基或生物素；和/或ssrna/ssdna溶液浓度为1-5μm；和/或乙醇胺溶液浓度为100-500mm；和/或所述pbase溶液溶剂为乙醇或dmf。15.根据权利要求13所述的方法，所述peg的分子量为1000-10000；ssrna或ssdna的长度为10-30nt的随机序列；peg和氨基修饰的ssrna或ssdna浓度比例为1:3-1:10。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述cas13a/cas12a-crrna复合体的构建步骤包括用体积比为1:1的n-(3-二甲氨基丙基)-n
’‑
乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化peg尾端的羧基，活化时间为5-10min(仅peg尾端修饰羧基需要该活化步骤)，cas13a/cas12a溶液和crrna溶液分别先后引入石墨烯表面各孵育30min-60min，使cas13a/cas12a固定在石墨烯表面后与crrna形成cas-crrna复合体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中edc和nhs的浓度分别为4mm和11mm,cas13a/cas12a为无标记cas13a/cas12a或亲和素标记cas13a/cas12a(sa-cas13a/cas12a)浓度为1-3μm；和/或crrna溶液浓度为1-9μm。18.根据权利要求12所述的方法，其中核酸检测步骤包括将检测样本与复合物混合后添加到场效应晶体管中，反应后记录转移特性曲线的变化；优选地，反应条件为25-37℃下反应30-180min。19.根据权利要求18所述的方法，其中检测的对象可选sars-cov-2n基因、sars-cov-2e基因、sars-cov-2orf1ab基因、hpv-16或hpv-18；优选地，crrna序列选自seq id no.1-5。

技术总结
本发明公开了一种基于CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，将Cas13a/Cas12a固定在石墨烯表面后或者在溶液中与靶向不同病毒核酸的crRNA结合，构建Cas13a/Cas12a-crRNA复合物，用于快速切割修饰在gFET上的ssRNA/ssDNA，进而引发转移特性曲线的变化，实现对多种病毒核酸的响应。应。应。


技术研发人员：符汪洋 秦怡 经求是 王乾龙 张晓艳
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2022/3/8