一种可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法

1.本发明涉及生物材料制备技术领域，尤其是涉及一种可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法。


背景技术：

2.目前组织工程很多采用负载vegf的方法以促进血管再生；运用微球来负载vegf可达到缓释效果，但无法模仿胞外基质结构，无法在微观结构上有效调节伤口处细胞的迁移、分化；在与纳米纤维膜相关的研究中，基本都局限于将vegf直接通过静电纺丝方法封装并负载于纳米纤维膜上，此过程中，由于静电力或者有机溶剂的作用，vegf的封装效率难以保证，还有可能会失去活性；也有将vegf包裹在单纯的水凝胶中直接作用于伤口部位，但是水凝胶的透气性、拉伸性能和降解速率又很难与正常组织相匹配。
3.静电纺丝纳米纤维有良好的吸收性、可选择性渗透、贴合性好、多功能性和利于伤口的愈合等多种优势。由于纳米纤维的直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能，定向排列的纳米纤维还可更好地指导细胞迁移、增殖、分化；人的大多数组织、器官在形式和结构上与纳米纤维类似，这为静电纺丝纳米纤维用于组织和器官的修复提供了可能。生物医用高分子pcl力学性能优异，但亲水性、生物活性差，明胶具有细胞黏附等生物活性但缺少良好的力学性能。因此，将二者结合的复合材料则既有生物活性又有良好的力学性能，且具有很好的生物相容性及可降解性，可作为载体进入人体，并容易被吸收。
4.血管再生是由内皮细胞从头再生而形成血管，血管再生是新血管形成的过程，在发育和随后的生理稳态中至关重要。鉴于目前维持生长因子治疗剂量和内皮细胞疗效的策略的局限性，在伤口愈合过程中刺激血管再生仍然是一个重大的临床挑战。组织缺损会造成血管的缺失，进而使氧气和其它营养成分无法正常运输，因此伤口的愈合也会受到一定的阻碍。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
5.目前将pcl与明胶复合，并进行生物功能化构建（如血管再生）是组织再生领域的热点之一。但主要以特异性多肽与高分子材料简单混合为主，这样无法达到长效缓释因子的作用，从而限制了组织再生效果。共价键（covalent bond）是两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构。采用共价接枝的方法所得到的材料除了能得到稳定的效果外，还可能通过控制反应的条件得到可控力学性能、可控接枝率的生物医用材料。
6.有鉴于此，本发明提出将共价键结合的血管内皮生长因子甲基丙烯酰化明胶膜与定向活性纳米纤维膜有机结合，构建具有力学柔韧性、能够主动促进血管再生的生物活性复合膜的制备方法，用于全层皮肤创伤修复领域。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对上述研究领域的不足，提供一种可促进血管再生的柔性定向纳米复合膜的制备方法，得到的复合膜兼具有可控的力学性能及良好的生物相容性，具有促进血管化的作用，在再生医学及临床治疗中应用前景良好。
8.为实现上述目的，采用以下技术方案：（1）在去离子水中加入碳酸钠，调节ph为7~10，然后按50~200g/l的比例加入明胶，加热并持续搅拌，使明胶充分溶解，加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为1:1~3:1，在40~50℃条件下，持续搅拌1~8小时，在常温下进行透析，透析完成后，冷冻干燥后可获得甲基丙烯酸酰化明胶。反应化学式如下：（2）按50~200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶加入去离子水中，混合后按丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1:1~3:1的比例加入丁二酸酐，加热并持续搅拌，待反应完全，在常温下进行透析，透析完成后冷冻干燥后得到改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。反应化学式如下：（3）按50~200g/l的比例改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于磷酸盐缓冲盐溶液（pbs）中，按0.1~0.5g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的混合物；活化并持续轻柔搅拌，然后按0.1~0.4g/l的比例加入血管内皮生长因子，混合搅拌6~24小时，在常温下进行透析，透析完成后冷冻干燥得到以共价接枝的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。反应化学式如下：
（4）按5~20g/l的比例在避光条件下将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（lap）与磷酸盐缓冲盐溶液混合，于50℃条件下磁力搅拌1~8小时，配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液，按50~200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子加入到苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液中，于50℃下磁力搅拌1~8小时，搅拌均匀得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶。
9.（5）按50~70g/l的比例将聚己内酯和明胶溶于六氟异丙醇溶液中，于40℃条件下快速搅拌，其中，聚己内酯和明胶的质量比为1:1~2:1，运用静电纺丝方法制得聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，自然干燥后备用。
10.（6）取步骤（4）得到的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶平铺至聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜上，血管内皮生长因子随着水凝胶浸入纤维孔隙中，在蓝光照射下原位光交联固化，真空干燥后即可制成具有血管内皮生长因子浓度梯度的柔性定向纳米纤维复合膜。
11.优选的，本发明步骤（1）~（3）所述透析的条件为：在常温条下透析5~10天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌。
12.优选的，本发明步骤（1）~（3）所述冷冻干燥温度为：-80℃。
13.优选的，本发明步骤（3）中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1~1:3。
14.优选的，本发明步骤（5）中静电纺丝的条件为：溶液流速为0.5~2ml/h，电压为10~20kv，高速滚筒收集器转速为2000~3000rpm使纤维定向排列，将环境湿度控制在30%左右，收集器与喷丝头之间的距离为15~20cm。
15.优选的，本发明步骤（6）中蓝光的波长为405~465nm。
16.与现有技术相比，本发明的优点在于：（1）复合膜生物相容性好，具有生物活性并以pcl-明胶纳米纤维膜为基底膜，在膜上进一步交联，得到的高力学强度的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶与纳米纤维膜的复合膜。
17.（2）本发明采用光响应方式对天然高分子水凝胶产生交联网络，生产效率高，可批量制备。
18.（3）复合膜的分层结构模仿了天然皮肤的生理结构—表皮层、真皮层，复合膜的微
观结构则与细胞外基质结构相似，具有生物仿生特点。
19.（4）现有的通过静电纺丝方法负载vegf的策略，只能得到在膜上分布均匀的vegf，而本发明可通过控制vegf在水凝胶中的接枝率，再将水凝胶层与静电纺丝膜结合，以获取具有vegf浓度梯度的复合膜。
20.（５）本发明为双层复合膜，将vegf通过共价键进行接枝，解决了短时间爆发式释放vegf的问题，可达到稳定长效缓释vegf和促进血管、皮肤再生的目的，为组织工程中多层生物支架的制备和生物因子的有效缓释提供一种新的思路及方法。
附图说明
21.图1为实施例1 中明胶改性修饰反应式；图2为实施例1中明胶未改性的氢谱核磁共振图h-nmr；图3为实施例1中甲基丙烯酰化明胶氢谱核磁共振图h-nmr；图4为实施例1中柔性定向纳米纤维基底膜微观结构sem图；图5为实施例1中柔性定向纳米纤维复合膜整体形貌实物图；图6为实施例1中柔性定向纳米纤维复合膜复合膜(a)正面、(b)侧边微观结构sem图。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
23.实施例1一种可促进血管再生的柔性定向纳米复合膜的制备方法，具体包括以下步骤：（1）在去离子水中加入碳酸钠，调节ph为7.0，然后按100g/l的比例加入明胶，加热并持续搅拌，使明胶充分溶解，加入甲基丙烯酸酐（其反应式，如图1所示），甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为2:1，在50℃条件下，持续搅拌8小时，在常温条下透析5天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥36h后可获得甲基丙烯酸酰化明胶，其改性前后的核磁共振谱，如图2、图3所示。
24.（2）按100g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶加入去离子水中，混合后按丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1.6:1的比例加入丁二酸酐，然后在50℃下搅拌反应24h，待反应完全，在常温条下透析5天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥后得到改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。
25.（3）按50g/l的比例改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.1g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，按0.1g/l的比例加入n-羟基琥珀酰亚胺；活化并持续轻柔搅拌，然后按0.1g/l的比例加入血管内皮生长因子，混合搅拌8小时，在常温条下透析5天，每12小时换一次去离子水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥得到以共价接枝的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。
26.（4）按5g/l的比例在避光条件下将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂与磷酸盐缓冲盐溶液混合，于50℃条件下磁力搅拌2小时，配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚
磷酸锂溶液，按50g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子加入到苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液中，于50℃下磁力搅拌8小时，搅拌均匀得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶。
27.（5）按60g/l的比例将聚己内酯（pcl）和明胶溶于六氟异丙醇溶液中，于40℃条件下快速搅拌，其中，聚己内酯和明胶的质量比为1:1，运用静电纺丝方法（静电纺丝的条件为：溶液流速为2ml/h，电压为15kv，高速滚筒收集器转速为2000rpm使纤维定向排列，将环境湿度控制在30%左右，收集器与喷丝头之间的距离为20cm）制得聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，自然干燥后，得到pcl-明胶静电纺丝柔性定向纳米纤维膜。其表面形态如图4所示，可观察到纳米纤维膜呈现定向排列的特征，所示纤维为纳米级（300-500纳米）。
28.（6）取步骤（4）得到的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶平铺至聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜上，vegf随着水凝胶浸入纤维的孔隙中，在405nm的蓝光照射下原位光交联固化，真空干燥后即可制成具有vegf浓度梯度的柔性定向纳米纤维复合膜。其整体形貌和柔韧性展示，如图5所示，可观察到复合膜整体柔韧性良好；其表面形态如图6所示，可观察到水凝胶层均匀覆盖于纳米纤维膜上，并浸入到纤维孔隙中，形成双层复合膜结构。
29.实施例2（1）在去离子水中加入碳酸钠，调节ph为10，然后按50g/l的比例加入明胶，加热并持续搅拌，使明胶充分溶解，加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为1:1，在40℃条件下，持续搅拌4小时，在常温条下透析8天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥后可获得甲基丙烯酸酰化明胶。
30.（2）按200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶加入去离子水中，混合后按丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1:1的比例加入丁二酸酐，加热并持续搅拌，待反应完全，在常温条下透析8天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥后得到改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。
31.（3）按100g/l的比例改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.3g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，按0.3g/l的比例加入n-羟基琥珀酰亚胺；活化并持续轻柔搅拌，然后按0.4g/l的比例加入血管内皮生长因子，混合搅拌16小时，在常温条下透析5天，每12小时换一次去离子水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥得到以共价接枝的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。
32.（4）按10g/l的比例在避光条件下将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂与磷酸盐缓冲盐溶液混合，于50℃条件下磁力搅拌6小时，配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液，按100g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子加入到苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液中，于50℃下磁力搅拌6小时，搅拌均匀得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶。
33.（5）按50g/l的比例将聚己内酯（pcl）和明胶溶于六氟异丙醇溶液中，于40℃条件下快速搅拌，其中，聚己内酯和明胶的质量比为1: 2，运用静电纺丝方法（静电纺丝的条件为：溶液流速为0.5ml/h，电压为20kv，高速滚筒收集器转速为2300rpm使纤维定向排列，将
环境湿度控制在30%左右，收集器与喷丝头之间的距离为15cm）制得聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，自然干燥后，得到pcl-明胶静电纺丝柔性定向纳米纤维膜。其表面形态与实施例1相似，纤维为纳米级（300-500纳米）。
34.（6）取步骤（4）得到的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶平铺至聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜上，vegf随着水凝胶浸入纤维的孔隙中，在405nm的蓝光照射下原位光交联固化，真空干燥后即可制成具有vegf浓度梯度的柔性定向纳米纤维复合膜，可观察到水凝胶层均匀覆盖于纳米纤维膜上，并浸入到纤维孔隙中，形成双层复合膜结构。
35.实施例3一种可促进血管再生的柔性定向纳米复合膜的制备方法，具体包括以下步骤：（1）在去离子水中加入碳酸钠，调节ph为9，然后按200g/l的比例加入明胶，加热并持续搅拌，使明胶充分溶解，加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为3:1，在45℃条件下，持续搅拌8小时，在常温条下透析10天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥后可获得甲基丙烯酸酰化明胶。
36.（2）按50g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶加入去离子水中，混合后按丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为3:1的比例加入丁二酸酐，加热并持续搅拌，待反应完全，在常温条下透析8天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥后得到改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。
37.（3）按200g/l的比例改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.5g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的混合物；活化并持续轻柔搅拌，然后按0.4g/l的比例加入血管内皮生长因子，混合搅拌24小时，在常温条下透析10天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌，透析完成后，-80℃冷冻干燥得到以共价接枝的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。
38.（4）按20g/l的比例在避光条件下将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂与磷酸盐缓冲盐溶液混合，于50℃条件下磁力搅拌6小时，配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液，按200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子加入到苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液中，于50℃下磁力搅拌8小时，搅拌均匀得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶。
39.（5）按70g/l的比例将聚己内酯（pcl）和明胶溶于六氟异丙醇溶液中，于40℃条件下快速搅拌，其中，聚己内酯和明胶的质量比为2:1，运用静电纺丝方法（静电纺丝的条件为：溶液流速为1.5ml/h，电压为10kv，高速滚筒收集器转速为2500rpm使纤维定向排列，将环境湿度控制在30%左右，收集器与喷丝头之间的距离为18cm）制得聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，自然干燥后，得到pcl-明胶静电纺丝柔性定向纳米纤维膜；其表面形态与实施例1相似，所示纤维为纳米级（300-500纳米）。
40.（6）取步骤（4）得到的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶平铺至聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜上，vegf随着水凝胶浸入纤维的孔隙中，在465nm的蓝光照射下原位光交联固化，真空干燥后即可制成具有vegf浓度梯度的柔性定向纳米纤维复合膜。可观察到水凝胶层均匀覆盖于纳米纤维膜上，并浸入纤维孔隙中，形成双层复合膜结构。

技术特征：
1.一种可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）在去离子水中加入碳酸钠，调节ph为7~10，然后按50~200g/l的比例加入明胶，加热并持续搅拌，使明胶充分溶解，加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为1:1~3:1，在40~50℃条件下，持续搅拌1~8小时，在常温下进行透析，透析完成后，冷冻干燥后可获得甲基丙烯酸酰化明胶；（2）按50~200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶加入去离子水中，混合后按丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1:1~3:1的比例加入丁二酸酐，加热并持续搅拌，待反应完全，在常温下进行透析，透析完成后冷冻干燥后得到改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh；（3）按50~200g/l的比例改性甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.1~0.5g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的混合物；活化并持续轻柔搅拌，然后按0.1~0.4g/l的比例加入血管内皮生长因子，混合搅拌6~24小时，在常温下进行透析，透析完成后冷冻干燥得到以共价接枝的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子；（4）按0.05~0.2g/l的比例在避光条件下将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂与磷酸盐缓冲盐溶液混合，于50℃条件下磁力搅拌1~8小时，配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液，按50~200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子加入到苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂溶液中，于50℃下磁力搅拌1~8小时，搅拌均匀得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶；（5）按50~70g/l的比例将聚己内酯和明胶溶于六氟异丙醇溶液中，于40℃条件下快速搅拌，其中，聚己内酯和明胶的质量比为1:1~2:1，运用静电纺丝方法制得聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，自然干燥后备用；（6）取步骤（4）得到的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶平铺至聚己内酯-明胶柔性定向纳米纤维膜上，在蓝光照射下原位光交联固化，真空干燥后即可制成柔性定向纳米纤维复合膜。2.根据权利要求1所述可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，其特征在于：步骤（1）~（3）所述透析的条件为：在常温条下透析5~10天，每12小时换一次去离子水，透析期间缓慢轻柔搅拌。3.根据权利要求1所述可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，其特征在于：步骤（1）~（3）所述冷冻干燥温度为：-80℃。4.根据权利要求1所述可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，其特征在于：步骤（3）中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1~1:3。5.根据权利要求1所述可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，其特征在于：步骤（5）中静电纺丝的条件为：溶液流速为0.5~2ml/h，电压为10~20kv，高速滚筒收集器转速为2000~3000rpm使纤维定向排列，将环境湿度控制在30%左右，收集器与喷丝头之间的距离为15~20cm。6.根据权利要求1所述可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，其特征在于：步骤（6）中蓝光的波长为405~465nm。

技术总结
本发明公开一种可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法，属于生物复合材料制备领域。该复合膜具有促进细胞黏附、血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，同时结合多孔透气、强韧性的特点，可作为伤口敷料应用于组织缺损部位，通过促进缺损部位的血管再生以增强伤口组织愈合能力，可批量制备。该复合膜是双层结构：以合成高分子材料聚己内酯（PCL）和天然高分子材料明胶的静电纺丝柔性定向纳米纤维膜为基底；膜上原位光固化一层甲基丙烯酸酐改性并共价接枝血管内皮生长因子（VEGF）的明胶分子骨架。所述纳米复合膜具有良好的生物相容性和力学柔韧性，在再生医学及临床治疗中应用前景良好。生医学及临床治疗中应用前景良好。


技术研发人员：张磊 徐茂芽 李勇 李天晴 司维 季维智
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2021.10.09
技术公布日：2022/3/8