一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用

1.本发明属于基因检测领域，具体涉及一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sars-cov-2)是一种危害性极强的rna病毒，其变异能力强。全球多个国家和地区普遍监测到sars-cov-2的s蛋白容易发生氨基酸突变，特别是受体结合区或单克隆抗体结合位点氨基酸突变引起病毒的传播力和致病力改变以及部分免疫逃逸等。以新冠病毒德尔塔变异株为例，其传染性和传播能力有明显增强，自首次发现以来，蔓延迅速。因此，为了降低传播风险，为病毒的变异做好预警，实现sars-cov-2基因的实时突变检测，对疫情防控，流行病学调查等具有重要意义。
3.目前，sars-cov-2基因突变检测主要依赖于基因测序技术。该技术对sars-cov-2全长基因组进行分析，获取全基因组的基因突变信息，并用于疾病治疗、流行病学分析等。目前的测序技术虽然具有高度的准确性和敏感性，能够全面反映病原体的遗传信息，但往往需要依托精密且价值昂贵的仪器，检测耗时长，测序结果依赖于专业人员分析解读，检测样品量相对较少，较难运用于大规模临床检测和现场快检，无法实现大范围推广、快速诊断的目的，对于监控流行性病毒(如sars-cov-2)的新型变异和突变存在滞后性。
4.实时荧光定量pcr技术是目前who最推荐的sars-cov-2检测方法之一，也是目前sars-cov-2检测的金标准。但实时荧光定量pcr并不能直接检测sars-cov-2突变位点，而仅仅只能够用于sars-cov-2的定性诊断或定量检测，在此基础上结合基因测序技术检测受试者的sars-cov-2突变位点。环介导等温扩增技术也是常用于检测sars-cov-2的技术之一，其也存在着无法直接确定基因突变位点，需要辅以测序技术的问题。
5.因此，为了能够更加有效的监控病毒发展趋势，了解病毒变异情况，开发一种操作简便、检测灵敏的可用于检测基因中单碱基突变的检测方法对于流行病学监控以及人群健康监控具有极为重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用，本发明中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法能够快速高效的检测出sars-cov-2基因单碱基突变，检测灵敏，特异性好，对于新冠病毒的变异株的筛查和监控具有极为重要的推动作用。
7.本发明的第一个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测发夹探针，该发夹探针包括ps-hp1和hp2。
8.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述ps-hp1依次含有发夹互补序列、新冠病毒靶向序列和新冠病毒单碱基突变识别位点。所述hp2依次含有发夹互
补序列和新冠病毒靶向序列。
9.其中，所述发夹互补序列中含有发夹互补序列，以形成茎环结构；所述新冠病毒单碱基突变识别位点用于区分野生型新冠病毒和单碱基突变型新冠病毒。
10.在本发明的一些实施方式中，所述ps-hp1的核苷酸序列为：ps-hp1：hp1：
11.其中，对ps-hp1的5’端第1～20位碱基(tagaattctaatgaattcta)进行硫代磷酸化修饰。
12.在本发明实施例中，ps-hp1的硫代磷酸化修饰服务由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
13.所述hp2的核苷酸序列为：hp2：所述hp2的核苷酸序列为：hp2：其5’端为磷酸化(po4)修饰。
14.其中，ps-hp1和hp2中仅加粗的部分为靶向sars-cov-2基因的新冠病毒靶向序列。
15.ps-hp1和hp2中的标有下划线的部分为发夹互补序列，以形成茎环结构。
16.ps-hp1的3’端的最后一个碱基c则是新冠病毒单碱基突变识别位点。
17.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变株包括sars-cov-2d614g。
18.在本发明的一些实施方式中，所述sars-cov-2d614g优选为含有如seq id no.3所示特征序列的sars-cov-2d614g。
19.本发明的第二个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测试剂，该检测试剂中含有本发明第一个方面所述的发夹探针。
20.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变株包括sars-cov-2d614g。
21.在本发明的一些实施方式中，所述sars-cov-2d614g优选为含有如seq id no.3所示特征序列的sars-cov-2d614g。
22.本发明的第三个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有本发明第二个方面所述的检测试剂、聚乙二醇和高保真dna连接酶。
23.根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂盒中还含有高保真dna连接酶缓冲液、信号扩增体系缓冲液。
24.在本发明的一些实施方式中，所述信号扩增体系缓冲液中优选包括dna聚合酶和双链dna染料。
25.在本发明的一些优选实施方式中，所述信号扩增体系缓冲液为：
26.组分含量7～8u/μl dna聚合酶0.45～0.5μl；25～30mm dntps0.45～0.5μl；10
×
sybr green i2～2.5μl；500～550μm甜菜碱0.8～1μl；10
×
等温扩增缓冲液2～2.5μl；水补至10μl
27.在本发明的一些更优选实施方式中，所述信号扩增体系缓冲液如说明书表2所示。
28.根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变株包括sars-cov-2d614g。
29.在本发明的一些实施方式中，所述sars-cov-2d614g优选为含有如seq id no.3所示特征序列的sars-cov-2d614g。
30.本发明的第四个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测方法，包括如下步骤：
31.将本发明第一个方面所述的发夹探针、聚乙二醇、高保真dna连接酶、高保真dna连接酶缓冲液混合，94～96℃孵育4～6分钟，然后63～67℃孵育19～21分钟，加入信号扩增体系缓冲液，63～67℃孵育55～65分钟，检测荧光强度，判断检测样品中是否含有新冠病毒单碱基突变株。
32.在本发明的一些优选实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变检测方法，包括如下步骤：
33.将本发明第一个方面所述的发夹探针、聚乙二醇、高保真dna连接酶、高保真dna连接酶缓冲液混合，95℃孵育5分钟，然后65℃孵育20分钟，加入信号扩增体系缓冲液，65℃孵育60分钟，检测荧光强度，判断检测样品中是否含有新冠病毒单碱基突变株。
34.发明人发现，不使用聚乙二醇辅助的自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增虽然也可以用于基因单碱基突变检测，但其对于低浓度的样品检测效果并不好，最低检测限约为5pm，容易出现低浓度的核酸样本漏检情况，而使用了聚乙二醇辅助的自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增在检测灵敏度上有了显著提升，最低检测限为4fm，评估检测精度提高了约100倍。
35.本发明实施例中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法的检测原理为：
36.当检测样品中存在单碱基突变的sars-cov-2时，引物发夹ps-hp1与hp2中的sars-cov-2靶核酸识别序列会分别与检测样品中的sars-cov-2靶核酸部分互补，形成具有断口的哑铃状发夹(sars-cov-2靶核酸-ps-hp1-hp2复合体)。然后，sars-cov-2靶核酸-ps-hp1-hp2复合体会在体系中的peg 6000、高保真dna连接酶(hifi ligase)的作用下，催化ps-hp1的3'端羟基与hp2的5'端磷酸基团形成磷酸二酯键，将ps-hp1的3'端和hp2的5'端连接起来，形成完整的哑铃状发夹。当形成完整的哑铃状发夹(ps-hp1-hp2复合体)后，其3’端可作为自引物，在dna聚合酶(bst 2.0warmsmart dna聚合酶)的作用下以自身ps-hp1-hp2复合体的序列作为模板沿着5'端延伸，生成一个含有一段sars-cov-2靶核酸双链序列的延长的发夹结构(extension hairpin,ep1)，其5’端也含有20个硫代磷酸修饰的碱基序列(来自ps-hp1)，导致其稳定性降低，从而使ep1的3’端容易折回形成发夹结构从而形成新的自引物，以延长的自身序列为模板并被dna聚合酶延伸，再次产生具有更长茎的延伸发夹(ep2)，其含有两段sars-cov-2靶核酸双链序列，延伸产物ep2的5’端也存在20个硫代磷酸修饰的碱基序列，其3’端可再次折回发夹结构从而形成自引物，再次以更长的自身序列为模板进行扩增，循环往复，形成具有多段sars-cov-2靶核酸双链序列的延伸发夹(epx，x表示重复段数)。而sybr green i与扩增产物双链结合后荧光强度显著增强，从而确定检测样品中存在单碱基突变的sars-cov-2。
37.而当检测样品中不存在sars-cov-2或存在野生型sars-cov-2基因(无单碱基突变)时，由于ps-hp1的3'末端碱基与之不配对，则不会进行后续ps-hp1的3'端羟基与hp2的
5'端磷酸基团形成磷酸二酯键的反应，从而无法形成完整的哑铃状发夹(ps-hp1-hp2复合体)。野生型sars-cov-2基因被锁定无法进行后续的核酸扩增，sybr green i为游离态，荧光强度极弱。
38.因此，通过以野生型sars-cov-2基因作为阴性对照，对比检测样品与阴性对照的荧光强度，即可判断检测样品中是否存在单碱基突变的sars-cov-2。
39.根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，是否含有新冠病毒单碱基突变株的判断标准为：
40.以野生型新冠病毒为阴性对照，若检测样品的荧光强度与野生型荧光强度无显著差异，则检测样品中不含新冠病毒单碱基突变株；
41.若检测样品的荧光强度与野生型荧光强度有显著差异性，则检测样品中含有新冠病毒单碱基突变株。
42.根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测方法中的扩增体系为：
43.90～100nm ps-hp10.8～1.2μl；90～100nm hp20.8～1.2μl；10
×
高保真dna连接酶缓冲液0.8～1.2μl；30～40％聚乙二醇3.75～4μl；高保真dna连接酶0.2～0.25μl；7～8u/μl dna聚合酶0.45～0.5μl；25～30mm dntps0.45～0.5μl；10
×
sybr green i2～2.5μl；500～550μm甜菜碱0.8～1μl；10
×
等温扩增缓冲液2～2.5μl；水补至20μl
44.。
45.在本发明的一些优选实施方式中，所述检测方法中的扩增体系为：
46.100nm ps-hp11μl100nm hp21μl10
×
hifi ligase buffer1μl40％聚乙二醇6000(体系中的终浓度为15％)3.75μlhifi ligase0.2μl检测样品1μl8u/μl bst 2.0warmsmart dna聚合酶0.5μl25mm dntps0.5μl10
×
sybr green i2μl500μm甜菜碱1μl10
×
isothemal amplification buffer2μldepc水补至20μl
47.根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突
变株包括sars-cov-2d614g。
48.在本发明的一些实施方式中，所述sars-cov-2d614g优选为含有如seq id no.3所示特征序列的sars-cov-2d614g。
49.本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的发夹探针或本发明的第三个方面所述的试剂盒在新冠病毒单碱基突变检测中的应用。
50.根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变株包括sars-cov-2d614g。
51.在本发明的一些实施方式中，所述sars-cov-2d614g优选为含有如seq id no.3所示特征序列的sars-cov-2d614g。
52.本发明的有益效果是：
53.1.本发明中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法操作简便，检测耗时短，可对sars-cov-2单碱基突变基因样本直接检测，且反应无需严格的热循环过程，特异性好，不易受其它核酸影响，灵敏度高，其检测限可达4fm，在10nm-10fm间线性良好。
54.2.本发明中的新冠病毒基因单碱基突变检测试剂和试剂盒均基于一个硫代磷酸化发夹探针和一个磷酸化修饰的发夹探针即可实现高灵敏度检测，通过结合实时荧光定量pcr仪、荧光分光光度计、荧光酶标仪等实现不同多场景，多平台应用，具有极高的实用性和普适性。
附图说明
55.图1为本发明实施例中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法的原理图；
56.图2为不同浓度的sars-cov-2d614g靶基因检测的实时荧光强度曲线；
57.图3为本发明实施例中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法的标准曲线；
58.图4为不同基因突变样品的实时荧光强度曲线；
59.图5为不同基因突变样品的荧光强度对比；
60.图6为不使用聚乙二醇的新冠病毒基因单碱基突变检测方法对不同浓度的sars-cov-2d614g靶基因检测的实时荧光强度曲线。
具体实施方式
61.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
62.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
63.一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法
64.本实施例中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法是基于聚乙二醇辅助的自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增来实现sars-cov-2基因单碱基突变的检测。
65.具体检测步骤如下：
66.(1)发夹探针的设计：
67.本实施例中的发夹探针包括ps-hp1和hp2，其中，其核苷酸序列分别为：
68.ps-hp1：其5’端为磷酸化(po4)修饰；
69.hp2：hp2：
70.其中，ps-hp1和hp2中仅加粗的部分均靶向sars-cov-2基因。ps-hp1和hp2中的加粗且标有下划线的部分为发夹互补序列，以形成茎环结构。ps-hp1的3’端的最后一个碱基c则是单碱基识别位点。
71.其中，对ps-hp1的5’端第1～20位碱基(tagaattctaatgaattcta)进行硫代磷酸化修饰。
72.在本发明实施例中，ps-hp1的硫代磷酸化修饰服务由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
73.在本实施例中，sars-cov-2基因具体为sars-cov-2d614g。
74.sars-cov-2d614g的靶标序列为：5
’‑
caggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaa-3(seq id no.3)。所述靶标序列位于sars-cov-2d614g的s蛋白第23381～23419位碱基。
75.(2)待测样品的检测：
76.参考表1所示体系将除信号扩增体系缓冲液的其他组分混合，95℃孵育5分钟，再65℃孵育20分钟，加入信号扩增体系缓冲液，65℃反应60分钟，检测荧光强度。
77.表1
[0078][0079][0080]
其中，10x hifi ligase buffer和hifi ligase均来自new eangland biolabs(new eangland,usa)。
[0081]
信号扩增体系缓冲液由表2所示组分混合得到。
[0082]
表2
[0083]
组分含量
8u/μl bst 2.0warmsmart dna聚合酶0.5μl25mm dntps0.5μl10
×
sybr green i2μl500μm甜菜碱1μl10
×
isothemal amplification buffer2μldepc水4μl总计10μl
[0084]
其中，10
×
isothemal amplification buffer购自new eangland biolabs(new eangland,usa)
[0085]
本实施例中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法的检测原理为：
[0086]
本实施例中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法的检测原理图如图1所示。
[0087]
当检测样品中存在单碱基突变的sars-cov-2时，引物发夹ps-hp1与hp2中的sars-cov-2靶核酸识别序列会分别与检测样品中的sars-cov-2靶核酸部分互补，形成具有断口的哑铃状发夹(sars-cov-2靶核酸-ps-hp1-hp2复合体)。然后，sars-cov-2靶核酸-ps-hp1-hp2复合体会在体系中的peg 6000、高保真dna连接酶(hifi ligase)的作用下，催化ps-hp1的3'端羟基与hp2的5'端磷酸基团形成磷酸二酯键，将ps-hp1的3'端和hp2的5'端连接起来，形成完整的哑铃状发夹(hp1-hp2复合体)。当形成完整的哑铃状发夹后，hp2的自引物茎环结构会在dna聚合酶(bst 2.0warmsmart dna聚合酶)的作用下沿着hp1-hp2复合体的5'端延伸，生成一个含有一段sars-cov-2靶核酸双链序列的延长的发夹结构(extension hairpin,ep1)，由于ep1的5’端中存在20个硫代磷酸修饰的碱基序列，导致其稳定性降低，从而使ep1的3’端容易折回形成发夹结构，从而形成新的自引物，在dna聚合酶作用下以延长的自身序列(ep1)为模板沿着5’端延伸再次产生含有两段sars-cov-2靶核酸双链序列的更长茎的延伸发夹(ep2)，由于得到的ep2中仍的5’端仍存在20个硫代磷酸修饰的碱基序列，因此，ep2延伸结束后会再次发生3’端折回形成发夹结构，从而形成新的自引物，循环往复，从而产生长多段含有sars-cov-2靶核酸双链序列长茎的延伸发夹(epx)扩增产物。而sybr green i与扩增产物结合后荧光强度显著增强，从而确定检测样品中存在单碱基突变的sars-cov-2。
[0088]
而当检测样品中不存在sars-cov-2或存在野生型sars-cov-2基因(无单碱基突变)时，由于ps-hp1的3'末端碱基与之不配对，则不会进行后续ps-hp1的3'端羟基与hp2的5'端磷酸基团形成磷酸二酯键的反应，从而无法形成完整的哑铃状发夹(hp1-hp2复合体)。野生型sars-cov-2基因被锁定无法进行后续的核酸扩增，sybr green i为游离态，荧光强度极弱。
[0089]
因此，通过以野生型sars-cov-2基因作为阴性对照，对比检测样品与阴性对照的荧光强度，即可判断检测样品中是否存在单碱基突变的sars-cov-2。
[0090]
检测效果验证试验
[0091]
(1)灵敏度：
[0092]
根据上述实施例中的方法构建检测体系，其中，检测样品分别为0，10fm，1pm，10pm，100pm，1nm和10nm七个梯度浓度的sars-cov-2d614g。阴性对照为水。
[0093]
检测结果如图2和3所示。
[0094]
从图2中可以发现，不同浓度的sars-cov-2d614g突变型靶基因具有良好的与之对应的荧光强度梯度，说明上述实施例中的方法具有良好的检测线性。进一步对0，10fm，1pm，10pm，100pm，1nm和10nm七个梯度浓度的sars-cov-2d614g在60分钟时荧光强度进行统计，可以发现在检测的七个浓度中，线性关系良好，相关系数大于0.98，表明上述实施例中的基于聚乙二醇辅助自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增的sars-cov-2基因单碱基突变检测方法在10fm-10nm范围内线性良好。通过线性范围公式，以最低检测限的60分钟荧光强度为阴性对照，把阴性对照荧光强度的3倍作为y值，可以计算出最低检测限为4fm。相对于现有技术中的检测方法，上述实施例中的基于聚乙二醇辅助自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增的sars-cov-2基因单碱基突变检测方法检测精度更高，检测灵敏度提高了约100倍。
[0095]
(2)特异性：
[0096]
根据上述实施例中的方法构建检测体系，其中，检测样品(浓度均为10nm)分别如下所示：
[0097]
sars-cov-2d614g：5
’‑
caggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaa-3’；
[0098]
野生型sars-cov-2(wh)：5
’‑
caggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaa-3’(seq id no.4)；
[0099]
其中，突变型基因(d614g)与野生型基因(wh)中下划线部分为相对的单碱基突变位点。
[0100]
错配序列1(m1)：5
’‑
caggttgctgttctttatcagaatgttaactgcacagaa-3’(seq id no.5)；
[0101]
错配序列2(m2)：5
’‑
caggttgctgttctttatccgaatgttaactgcacagaa-3’(seq id no.6)；
[0102]
错配序列3(m3)：5
’‑
caggttgctgttctttatccggatctgaactgcacagaa-3’(seq id no.7)。
[0103]
其中，错配序列1～3中的下划线部分为错配序列1～3与突变型基因(d614g)相对的错配碱基。
[0104]
阴性对照为以水代替靶标核酸，其它成分不变。
[0105]
检测结果如图4和5所示。
[0106]
如图4和5所示，通过把10nm的sars-cov-2d614g突变型靶基因作为x轴，荧光强度作为y轴，野生型基因wh的荧光强度约为完全配对的d614g的15％。这说明上述实施例中的基于聚乙二醇辅助自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增sars-cov-2基因单碱基突变检测方法能够很好地区分sars-cov-2野生型基因和sars-cov-2d614g单碱基突变型基因，并能够很好的屏蔽干扰序列的干扰。而该结果也能够提示该方法有望于应用于“sars-cov-2关切变异株(variant of concern，voc)”和“关注变异株(variant of interest，voi)”所有突变位点的直接检测。
[0107]
对比例1
[0108]
检测方法同上述实施例中的一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法，区别在于，在对比例1中，使用等量的水替换40％聚乙二醇6000。
[0109]
在对比例1中，检测样品为不同浓度(0，10pm，100pm，1nm和10nm)的sars-cov-2d614g。
[0110]
阴性对照为水。
[0111]
检测结果如图6所示。
[0112]
可以发现，使用未加入聚乙二醇的自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增的sars-cov-2基因单碱基突变检测方法检测不同浓度的sars-cov-2d614g，低浓度的sars-cov-2d614g突变型基因相对应的荧光强度无法成梯度，这说明了缺少聚乙二醇的辅助，自引物硫代磷酸化发夹介导等温扩增的灵敏度会出现显著下降，无法有效区分低浓度的sars-cov-2d614g单碱基突变基因。
[0113]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种新冠病毒单碱基突变检测发夹探针，其特征在于，所述发夹探针包括ps-hp1和hp2；所述ps-hp1依次含有发夹互补序列、新冠病毒靶向序列和新冠病毒单碱基突变识别位点；所述ps-hp1的5’端发夹互补序列经硫代磷酸化修饰；所述hp2依次含有发夹互补序列和新冠病毒靶向序列；所述发夹互补序列中含有发夹互补序列，以形成茎环结构；所述新冠病毒单碱基突变识别位点用于区分野生型新冠病毒和单碱基突变型新冠病毒。2.根据权利要求1中所述的发夹探针，其特征在于，所述ps-hp1的核苷酸序列为：5
’‑
tagaattctaatgaattctattctgtgcagttaacac-3’(seq id no.1)；所述hp2的核苷酸序列为：5
’‑
cctgataaagaacagcaacctggttagtggaataccactaac-3’(seq id no.2)。3.一种新冠病毒单碱基突变检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有权利要求1～2任一项所述的发夹探针。4.一种新冠病毒单碱基突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求3所述的检测试剂、聚乙二醇和高保真dna连接酶。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有信号扩增体系缓冲液和高保真dna连接酶缓冲液；其中，所述信号扩增体系缓冲液中优选包括dna聚合酶和双链dna染料。6.一种新冠病毒单碱基突变检测方法，包括如下步骤：将权利要求1～2任一项所述的发夹探针、聚乙二醇、高保真dna连接酶、高保真dna连接酶缓冲液混合，94～96℃孵育4～6分钟，然后63～67℃孵育19～21分钟，加入信号扩增体系缓冲液，63～67℃孵育55～65分钟，检测荧光强度，判断检测样品中是否含有新冠病毒单碱基突变株。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，是否含有新冠病毒单碱基突变株的判断标准为：以野生型新冠病毒为阴性对照，若检测样品的荧光强度与野生型荧光强度无显著差异，则检测样品中不含新冠病毒单碱基突变株；若检测样品的荧光强度与野生型荧光强度有显著差异性，则检测样品中含有新冠病毒单碱基突变株。8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中的扩增体系为：
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述新冠病毒单碱基突变株包括sars-cov-2 d614g，所述sars-cov-2 d614g优选为含有如seq id no.3所示特征序列的sars-cov-2 d614g。10.权利要求1～2任一项所述的发夹探针或权利要求4～5任一项所述的试剂盒在新冠病毒单碱基突变检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用，该新冠病毒基因单碱基突变检测方法基于聚乙二醇辅助，通过发夹探针PS-HP1和HP2实现SARS-CoV-2单碱基突变情况的检测。该方法操作简便，检测耗时短，可对SARS-CoV-2单碱基突变基因样本直接检测，且反应无需严格的热循环过程，特异性好，不易受其它核酸影响，灵敏度高，其检测限可达4fM，在10nM-10fM间线性良好。10fM间线性良好。


技术研发人员：余路新 陈章权 汤子彬 邓玉玲 何素辉 孙元中 郑国柱 王厚淇
受保护的技术使用者：广东医科大学
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/3/8