抗C5抗体及其应用的制作方法

抗c5抗体及其应用
1.本技术要求申请号为202011459619.0专利申请的优先权(在先申请的申请日为2020年12月11日，发明名称为抗c5抗体及其应用)。
技术领域
2.本发明属于生物医药技术领域，涉及抗c5抗体及其应用。


背景技术：

3.补体系统由30多种血浆蛋白和膜蛋白组成，广泛存在于血液、组织液和细胞表面，促进吞噬细胞的吞噬和溶解靶细胞能力，是机体免疫防御机制的重要组成部分。其中，c5是一种重要的补体，在炎症反应过程中c5转化酶将c5分解成c5a和c5b，c5a游离于液相，是重要的炎症介质，c5b经过一系列补体反应形成膜攻击复合物(mac)，导致细胞裂解死亡。
4.正常情况下补体的激活和抑制机制共同作用维持健康的机体状态，而当由于某些情况导致c5过度激活时，则产生异常的自身免疫。例如，阵发性夜间血红蛋白尿(pnh)是由于pnh红细胞的cd59缺陷导致c5抑制作用受损引起的，非典型性溶血性尿毒症综合征(ahus)则是由于补体旁路的过度激活导致膜攻击复合物形成并损伤微血管内皮细胞引起的，其共同的作用机理均为c5的过度激活。


技术实现要素：

5.本发明提供了抗c5抗体及其应用，所述抗c5抗体能够高亲和性地结合c5，阻止其被c5转化酶裂解，有利于阻断膜攻击复合物的形成，最终达到缓解并改善临床症状的目的。
6.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供了抗c5抗体，所述抗c5抗体包括重链可变区和轻链可变区；
8.所述重链可变区包括seq id no:3、seq id no:9或seq id no:15所示的cdr3；
9.所述轻链可变区包括seq id no:6、seq id no:12或seq id no:18所示的cdr3。
10.优选地，所述重链可变区还包括seq id no:1、seq id no:7或seq id no:13所示的cdr1。
11.优选地，所述重链可变区还包括seq id no:2、seq id no:8或seq id no:14所示的cdr2。
12.优选地，所述轻链可变区还包括seq id no:4、seq id no:10或seq id no:16所示的cdr1。
13.优选地，所述轻链可变区还包括seq id no:5、seq id no:11或seq id no:17所示的cdr2。
14.本发明中，抗体的重链可变区的cdr1～3和轻链可变区的cdr1～3共同决定抗体对抗原的特异性识别结合能力，含有seq id no:1～6、seq id no:7～12以及seq id no:13～18的cdr的抗体对c5蛋白具有显著的结合能力，表现出明显的cdc抑制作用。
15.在一个具体实施例中，所述抗c5抗体cr3#24的重链可变区包括seq id no:1所示
的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、seq id no:3所示的cdr3；
16.所述抗c5抗体cr3#24的轻链可变区包括seq id no:4所示的cdr1、seq id no:5所示的cdr2、seq id no:6所示的cdr3；
17.seq id no:1：dyymh；
18.seq id no:2：vvdpedgeiiyaekfqg；
19.seq id no:3：sdygagsymvdp；
20.seq id no:4：ggnnleskivs；
21.seq id no:5：ydtdrps；
22.seq id no:6：qvwdsnsdhvi。
23.本发明中，包含seq id no:1～3的重链可变区cdr和seq id no:4～6的轻链可变区cdr的抗c5抗体cr3#24具有c5蛋白结合活性，表现出明显的cdc抑制作用。
24.优选地，所述抗c5抗体cr#24的重链可变区包括seq id no:19所示的氨基酸序列，轻链可变区包括seq id no:20所示的氨基酸序列；
25.seq id no:19：
26.evqlvqsgaevkkpgaavkisckvsgytftdyymhwvqqapgkglewmgvvdpedgeiiyaekfqgrititadtstdtvymelsslrsedtavyycarsdygagsymvdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk；
27.seq id no:20：
28.syvltqppsvsvtpgktariacggnnleskivswyqqkpgqapvlvifydtdrpsgiserfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsnsdhvifgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclvsdfypgavtvawkadgspvkvgvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscrvthegstvektvataecs。
29.在一个具体实施例中，所述抗c5抗体cr3#30的重链可变区包括seq id no:7所示的cdr1、seq id no:8所示的cdr2、seq id no:9所示的cdr3；
30.所述抗c5抗体cr3#30的轻链可变区包括seq id no:10所示的cdr1、seq id no:11所示的cdr2、seq id no:12所示的cdr3；
31.seq id no:7：syymh；
32.seq id no:8：iinpsggstsyaqkfqg；
33.seq id no:9：gtvddafdi；
34.seq id no:10：tgtssdvggydlvs；
35.seq id no:11：dvskrps；
36.seq id no:12：ssfadsnnwevv。
37.本发明中，包含seq id no:7～9的重链可变区cdr和seq id no:10～12的轻链可变区cdr的抗c5抗体cr3#30具有c5蛋白结合活性，表现出明显的cdc抑制作用。
38.优选地，所述抗c5抗体cr3#30的重链可变区包括seq id no:21所示的氨基酸序列，轻链可变区包括seq id no:22所示的氨基酸序列；
39.seq id no:21：
40.qvqlvesgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargtvddafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk；
41.seq id no:22：
42.qsaltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggydlvswyqqhpgkapklmiydvskrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaddeadyycssfadsnnwevvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqweshrsyscqvthegstvektvaptecs。
43.在一个具体实施例中，所述抗c5抗体cr3#75的重链可变区包括seq id no:13所示的cdr1、seq id no:14所示的cdr2、seq id no:15所示的cdr3；
44.所述抗c5抗体cr3#75的轻链可变区包括seq id no:16所示的cdr1、seq id no:17所示的cdr2、seq id no:18所示的cdr3。
45.seq id no:13：dyyth；
46.seq id no:14：lvdpeggetiyaekfqg；
47.seq id no:15：gsflaapdy；
48.seq id no:16：kssqsllynsnnknyla；
49.seq id no:17：wastres；
50.seq id no:18：qqyystplt。
51.本发明中，包含seq id no:13～15的重链可变区cdr和seq id no:16～18的轻链可变区cdr的抗c5抗体cr3#75相比于伊库利珠单抗(eculizumab，soliris/alexion)与c5具有更优的结合活性，表现出非常强的cdc抑制作用，半衰期长，可以长时间滞留，降低给药频次和施用计量也可达到治疗目的。
52.优选地，所述抗c5抗体cr3#75的重链可变区包括seq id no:23所示的氨基酸序列，轻链可变区包括seq id no:24所示的氨基酸序列；
53.seq id no:23：
54.evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdyythwvqqapgkglewmglvdpeggetiyaekfqgrvtitadastdtaymelsslrsedtavyycatgsflaapdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk；
55.seq id no:24：
56.divmtqapdslavslgeratvnckssqsllynsnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyfcqqyystpltlgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
57.优选地，所述抗c5抗体还包括恒定区。
58.优选地，所述恒定区来源于igg4、igg1或igg2中的任意一种，优选为igg4。
59.优选地，所述igg4具有s228p突变，有助于提高igg4的稳定性。
60.优选地，所述igg1具有n297a和/或k322a突变。
61.优选地，所述igg2具有s257a突变。
62.本发明中，igg1上的突变位点n297a和k322a分别用于消除抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc)和补体依赖的细胞毒性(cdc)。
63.优选地，所述igg2具有较低的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc)和补体依赖的细胞毒性(cdc)，可具有s257a突变。
64.优选地，所述抗c5抗体分子可以在n端、内部或c端进行寡聚化、糖基化或与标记物缀合的修饰，从而调节抗体的功能。
65.第二方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述的抗c5抗体的dna片段。
66.第三方面，本发明提供了表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
67.第四方面，本发明提供了重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的抗c5抗体。
68.优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
69.优选地，所述重组细胞包括第三方面所述的表达载体。
70.第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的抗c5抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
71.(1)将抗c5抗体的编码核酸连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
72.(2)提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。
73.第六方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗c5抗体。
74.优选地，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物。
75.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
76.第七方面，本发明提供了第一方面所述的抗c5抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组细胞或第六方面所述的药物组合物在制备疾病检测试剂和/或疾病治疗药物中的应用。
77.优选地，所述疾病包括c5过度激活导致的自身免疫疾病。
78.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
79.(1)本发明的抗c5抗体cr3#24、cr3#30和cr3#75、尤其是cr3#75，与人源重组c5蛋白具有显著的结合能力，表现出明显的cdc抑制作用，cr3#75的解离平衡常数kd为0.366～0.722nm，相比于对照抗体eculizumab与c5具有更优的结合活性；
80.(2)本发明的抗c5抗体cr3#75在小鼠模型中表现出优异的药代动力学，半衰期长达15天；
81.(3)本发明的cr3#75/igg4单克隆抗体结构稳定，等电点为6.0～6.9，在低浓度水平下(》1mg/ml)溶解性良好，热稳定性良好，tm值达69.83℃；与cr3#75/igg4相比，cr3#75/igg1(n297a/k322a)具有更优的热稳定性；
82.(4)本发明的抗c5抗体在预防和/或治疗c5过度激活导致的自身免疫疾病方面具有潜在的应用价值。
附图说明
83.图1为经过3轮筛选获得的128条c5特异性结合肽段phage elisa亲和力检测结果；
84.图2为含有igg恒定区的c5特异性抗体的sds-page电泳图，其中，m-蛋白分子量marker，1-cr3#24，2-cr3#30，3-c5 ref，4-cr3#25，5-cr3#29，6-cr3#37，7-cr3#47，8-cr3#53，9-cr3#56，10-cr3#74，11-cr3#75，12-cr3#79，13-cr3#110，14-cr3#112，15-cr3#115；
85.图3为筛选的c5特异性抗体结合c5蛋白的活性的检测结果；
86.图4a为筛选的c5特异性抗体的cdc抑制效果结果，图4b为不同浓度的c5特异性抗体的cdc抑制效果结果；
87.图5a为eculizumab的解离曲线，图5b为cr3#75的解离曲线；
88.图6为cr3#75/igg4在小鼠体内的代谢曲线；
89.图7为cr3#75/igg4的完整性分析结果，图中，i图-非还原性条件下，ii图-还原性条件下；
90.图8为cr3#75/igg4的等电点检测结果，其中，m-蛋白分子量marker，1-cr3#75/igg4单克隆抗体；
91.图9为低浓度cr3#75/igg4(》1mg/ml)的sec-hplc分析结果；
92.图10为cr3#75/igg4的热稳定性分析结果；
93.图11为高浓度cr3#75/igg4(》10mg/ml)的sec-hplc分析结果；
94.图12a为小鼠脑组织aqp4病灶缺失面积统计图片，图12b为小鼠脑组织gfap病灶缺失面积统计图片。
具体实施方式
95.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
96.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
97.实施例1c5抗体活性肽段的筛选
98.为了获得具有治疗效果的c5抗体，本实施例首先从噬菌体抗体库omnimab中筛选具有特异性结合c5活性的肽段。噬菌体抗体库omnimab(ap biosciences inc.)中收集有上百个健康供者的b细胞，并基于hyperphage(μ13k07δριιι，progen，heidelberg，germany)进行抗体展示。全长c5参考ncbi reference sequence:np_001726.2抗原，并采用hek293细胞(sino biologica，cat#13416-h18h)进行重组表达，用于从omnimab库中富集和分离特异性结合肽段，并以不表达c5的hek293细胞作为对照。
99.经过3轮筛选(cr3)和富集，c5特异性结合肽段采用elisa进行鉴定和分离。如图1所示，根据克隆特异性识别c5活性，对cr3#1至cr3#128进行测序分析，确认重链和轻链的序
列信息和多样性，并从中选出15个候选样品进行后续筛选。其中，cr3#24的重链可变区和轻链可变区如seq id no:19～20所示，cr3#30的重链可变区和轻链可变区如seq id no:21～22所示，cr3#75的重链可变区和轻链可变区如seq id no:23～24所示。
100.实施例2表达和纯化含有igg恒定区的c5特异性抗体
101.为了进一步评估c5特异性结合肽段形成完整抗体后的理化性质，将实施例1中获得的15个样品的重链和轻链亚克隆至携带有igg4(s228p)恒定区的igg表达载体(ap biosciences inc.)上，其中，igg4上的突变位点用于提高igg4的稳定性。
102.重组质粒经测序鉴定为正确插入有目的片段的阳性克隆后，使用质粒提取试剂盒制备足量无菌重组质粒，经转染试剂(invitrogen)转染至6
×
106个expicho中进行抗体表达。将重组expicho细胞在37℃、5％co2中培养6天，抗体分泌至无血清细胞培养上清中，采用蛋白质a色谱法(protein a chromatography)从细胞培养上清中亲和纯化抗体，经浓缩后置于dpbs缓冲液中进行裂解，采用nanodrop2000检测蛋白浓度，采用sds-page、在非还原性(non-reducing)和还原性(reducing)条件下进行纯度和完整性检测，蛋白上样量为5μg/泳道。凝胶进行考马斯亮蓝染色后，采用ddh2o清洗。同时设置伊库利珠单抗(eculizumab，soliris/alexion)对照组(c5 ref)。
103.如图2所示，expicho细胞分泌的c5抗体的完整性和纯度达到95％以上，sds-page胶中几乎没有可见的片段，说明抗体的筛选、亚克隆、表达、纯化步骤不会影响抗体蛋白的结构稳定性。
104.实施例3基于直接elisa的c5特异性抗体的结合活性检测
105.本实施例利用直接elisa法，检测c5特异性抗体与人源重组c5蛋白的结合活性，并设置伊库利珠单抗(eculizumab，soliris/alexion)对照组(c5 ref)。步骤如下：
106.将人源c5蛋白(sino biologica，cat#13416-h18h)用1
×
dpbs稀释至1μg/ml，以100μl/孔加入到elisa板中，4℃孵育过夜，进行包被处理；弃去包被液后，向每孔中加入350μl1％bsa封闭液，室温封闭1h；
107.配制梯度稀释的待检测抗体溶液(从30nm开始进行3倍稀释，稀释10次，并添加不含抗体的溶液，共12个浓度进行检测)，向制备好的elisa板的每孔中加入100μl不同浓度的待检测抗体溶液，室温振荡条件下孵育1h；弃上清，加入350μl/孔洗涤液(0.05％tween-20+1
×
dpbs)，洗涤3次；
108.加入100μl/孔的hrp标记抗体anti-fc-ab-hrp(0.4μg/ml)(jackson immuno research，cat#109-006-098)，室温振荡条件下孵育30min；弃上清，加入350μl/孔的洗涤液，洗涤3次；
109.加入tmb显色1～5min后，加入50μl终止液(1n hcl)终止反应，置于酶标仪上读取450nm处的吸光值。
110.结果如图3所示，筛选的cr3#75具有与c5 ref非常接近的结合c5蛋白的活性，cr3#24、cr3#30、cr3#53也具有显著的c5蛋白结合活性。
111.实施例4基于cdc抑制实验的c5特异性抗体的功能验证
112.c5特异性抗体能够阻断cdc激活，本实施例基于cdc实验检测c5特异性抗体的功能。
113.步骤如下：
114.向2
×
104个raji细胞中加入10μg/ml利妥昔单抗(rituximab)，室温孵育20min，随后加入20μg/ml抗c5抗体和补体激活的人血清(12.5％)，至终体积为200μl；
115.37℃孵育2h，采用碘化丙锭(propidium iodide)进行死细胞染色，进行流式检测(attune nxt flow cytometer system，thermofisher scientific)。
116.结果如图4a和图4b所示，cr3#24、cr3#30、cr3#75表现出明显的cdc抑制作用，其中，cr3#75具有最强的中和活性，与对照抗体(c5 ref，soliris)的中和活性相当。
117.实施例5c5特异性抗体与人源重组c5蛋白的亲和力检测
118.本实施例采用(menlo park，calif.)生物传感器分析cr3#75和c5的亲和力，并设置伊库利珠单抗(eculizumab)对照组(c5 ref)。步骤如下：
119.简言之，将抗体以5μg/ml的浓度装载到ahc(anti-human igg fc capture)生物传感器(cat#18-5060)上，将传感器在测定缓冲液中离线平衡，在线监测直至信号达到约0.5nm；
120.将装载抗体的传感器暴露于不同浓度(0.4688nm、0.9375nm、1.88nm、3.75nm、7.5nm、15nm和30nm)c5(sino biologica，cat#13416-h18h)中，随后在pbst中孵育1min确定基线，在不同浓度的c5溶液中孵育5min检测抗体与c5的结合速率，在pbst中孵育5min检测抗体与c5的解离速率。动力学参数采用octet data软件进行分析。
121.结果如表1、表2、图5a和图5b所示，相比于对照抗体eculizumab(kd＝0.371～0.553nm)，cr3#75与c5具有更优的结合活性，解离平衡常数kd为0.366～0.722nm。
122.表1 eculizumab与c5的结合力
123.编号kd(m)kon(1/ms)koff(1/s)15.53e-105.44e+053.00e-0423.77e-103.94e+051.49e-0433.99e-103.81e+051.52e-0444.35e-103.77e+051.64e-0453.71e-103.51e+051.30e-04
124.表2 cr3#75与c5的结合力
125.编号kd(m)kon(1/ms)koff(1/s)13.66e-104.13e+051.51e-0426.14e-104.88e+053.00e-0436.16e-104.52e+052.79e-0447.22e-104.25e+053.07e-0457.20e-104.29e+053.09e-04
126.实施例6药代动力学检测
127.本实施例评价c5特异性抗体cr3#75/igg4在小鼠体内的半衰期、auc(area under the curve)、cmax、cl(clearance)和vd(volume of distribution)。
128.向scid-bg鼠(cb.17/.cg-prkdcscidlystbg-j/crlbltw)静脉注射5mg/kg cr3#75/igg4单克隆抗体，在不同时间点从尾静脉收集血液样本。采用直接elisa法检测血清中的cr3#75浓度，并采用pksolver(ver.2.0)计算药代动力学参数。
129.结果如表3、表4和图6所示，cr3#75在小鼠模型中表现出优异的药代动力学，半衰期长达361.5h(折合15天)，表明抗体在小鼠体内代谢较慢可以长时间滞留，可以降低给药频次并在动物实验中施用低剂量的抗体即可达到治疗的目的。
130.表3
131.时间(h)浓度(μg/ml)0.5141.6922459.5277253.08416838.22224042.07533628.30750412.81167223.378
132.表4
133.参数单位数值t1/2h361.451cmaxμg/ml141.69auc 0-tμg/ml
×
h22283.99vz_obs(mg/kg)/(μg/ml)0.0756cl_obs(mg/kg)/(μg/ml)/h0.000145vss_obs(mg/kg)/(μg/ml)0.0838
134.实施例7 cr3#75/igg4单克隆抗体的完整性分析
135.本实施例利用labchip gxii检测纯化的cr3#75/igg4单克隆抗体的完整性。步骤如下：
136.将纯化的cr3#75/igg4单克隆抗体用dpbs稀释至1mg/ml，吸取2.5μl蛋白样品稀释液与18μl样品缓冲液(含1m dtt或250mm nem)混合，70℃下孵育10min，随后冷却至室温。向体系中加入35μl去离子水后上样至labchip gxii(perkin elmer,inc.，cat.cls138160)，进行完整性分析。
137.结果如表5和图7所示，在非还原性条件下可以检测到完整的cr3#75/igg4单克隆抗体(m.w.172.75kda)，经蛋白质a色谱法(protein a chromatography)分析发现，完整的cr3#75/igg4单克隆抗体的纯度达100％，说明抗体的重链和轻链正确配对，抗体在制备和纯化过程中可以保持结构的稳定性。在还原性条件下，重链和轻链之和(hc+lc)也达到96.67％，说明采用一步纯化步骤即可去除大部分杂质。
138.表5
[0139][0140]
实施例8等电点检测
[0141]
本实施例利用ief凝胶电泳检测cr3#75/igg4单克隆抗体的电荷性。步骤如下：
[0142]
将5μl蛋白样品和5μl 2
×
样品缓冲液混合，电泳装置xcell surelocktmmini-cell(invitrogen)的上层和下层缓冲室中分别充有200ml 1
×
ief阴极缓冲液或600ml 1
×
ief阳极缓冲液，电泳条件为100v电泳1h，200v电泳1h，500v电泳30min。电泳结束后采用12％tca固定凝胶30min，考马斯亮蓝染色后进行凝胶成像。
[0143]
结果如图8所示，cr3#75/igg4的电荷分布不均一，ief凝胶电泳检测的等电点为6.0～6.9，预测的等电点为5.92。
[0144]
实施例9聚集性分析
[0145]
将cr3#75/igg4抗体进行纯化和浓缩后，进行sec-hplc分析。步骤如下：
[0146]
将浓缩蛋白样品(》1mg/ml)与等体积流动相缓冲液(25mm磷酸盐、200mm nacl，ph 6.8)混合，经0.22μm滤膜(millipore，cat#slgp003rb)过滤后，上样至xbridge protein beh sec column(waters，cat#186007640)，25℃下进行sec分离，设置流速为0.4ml/min，样品加入体积为10μl，在280nm处测定吸光值。最后采用empower 2进行数据分析。
[0147]
结果如图9所示，17.839min处的主峰显示蛋白样品的纯度为99.9％，浓度为1.014mg/ml，说明cr3#75/igg4在dpbs中保持良好的溶解性，基本未发生聚集沉淀。
[0148]
实施例10热稳定性分析
[0149]
本实施例采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，dsc)检测抗体的热稳定性。步骤如下：
[0150]
配制浓度为0.2～1.0mg/ml的蛋白样品，采用microcal peaq-dsc system(northampton，malvern)从10～100℃、以200℃/h的速率进行dsc检测，绘制热分析图，根据绘制的热分析图进行抗体的热稳定性分析。
[0151]
图10为cr3#75/igg4的熔解曲线，tm值为69.83℃，说明此抗体的热稳定性正常。
[0152]
实施例11溶解性分析
[0153]
将cr3#75/igg4抗体进行纯化和浓缩后，进行sec-hplc分析。步骤如下：
[0154]
将浓缩蛋白样品(》10mg/ml)与等体积流动相缓冲液(25mm磷酸盐、200mm nacl，ph 6.8)混合，经0.22μm滤膜(millipore，cat#slgp003rb)过滤后，上样至xbridge protein beh sec column(waters，cat#186007640)，25℃下进行sec分离，设置流速为0.4ml/min，样品加入体积为2μl，在280nm处测定吸光值。最后采用empower 2进行数据分析。
[0155]
结果如图11所示，cr3#75/igg4抗体可以浓缩至10mg/ml而不产生肉眼可见的沉淀，97.15％蛋白在18.005min处产生单一峰，仅有＜4％的蛋白形成沉淀，说明此抗体可溶性正常，可以继续成药性开发。
[0156]
实施例12体内药效
[0157]
本实施例验证cr3#75/igg4抗体在nmo小鼠模型的体内药效，步骤如下：
[0158]
6～8周龄的c57雌性小鼠用水合氯醛麻醉后备皮，将小鼠头部固定于脑立体定位仪，调正定位后钻孔，垂直将微量进样针插入小鼠脑组织中，开启注射泵，注入cr3#75/igg4抗体、补体、致病性抗体混合溶液，注射完成后拔针，缝合皮肤，放入笼内饲养。造模7天后取出脑组织制作冰冻组织切片，采用免疫荧光技术对星形胶质细胞表达的aqp4和gfap进行染色，对各组aqp4和gfap病灶缺失面积进行统计。
[0159]
结果如图12a和图12b所示，cr3#75/igg4抗体在0.04mg/ml、0.156mg/ml、0.625mg/ml和2.5mg/ml的浓度下，可抑制nmo典型病灶的形成。
[0160]
实施例13抗体恒定区替换
[0161]
本实施例在维持cr3#30/igg4和cr3#75/igg4可变区不变的情况下，将重链恒定区替换为igg1(n297a/k322a)、igg1(n297a)和igg2，形成6个全新抗体，氨基酸序列如下：
[0162]
cr3#30/igg1(n297a/k322a)重链(seq id no:25)：
[0163]
qvqlvesgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargtvddafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
[0164]
cr3#30/igg1(n297a)重链(seq id no:26)：
[0165]
qvqlvesgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargtvddafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
[0166]
cr3#30/igg2重链(seq id no:27)：
[0167]
qvqlvesgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargtvddafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg。
[0168]
上述cr3#30/igg1(n297a/k322a)、cr3#30/igg1(n297a)和cr3#30/igg2均选用cr3#30/lambda轻链，序列如seq id no:28所示：
[0169]
seq id no:28：
[0170]
qsaltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggydlvswyqqhpgkapklmiydvskrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaddeadyycssfadsnnwevvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs。
[0171]
cr3#75/igg1(n297a/k322a)重链(seq id no:29)：
[0172]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdyythwvqqapgkglewmglvdpeggetiyaekfqgrvtitadastdtaymelsslrsedtavyycatgsflaapdywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
[0173]
cr3#75/igg1(n297a)重链(seq id no:30)：
[0174]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdyythwvqqapgkglewmglvdpeggetiyaekfqgrvtitadastdtaymelsslrsedtavyycatgsflaapdywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
[0175]
cr3#75/igg2重链(seq id no:31)：
[0176]
evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdyythwvqqapgkglewmglvdpeggetiyaekfqgrvtitadastdtaymelsslrsedtavyycatgsflaapdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg。
[0177]
上述cr3#75/igg1(n297a/k322a)、cr3#75/igg1(n297a)和cr3#75/igg2均选用cr3#75/kappa轻链，序列如seq id no:32所示。
[0178]
seq id no:32：
[0179]
divmtqapdslavslgeratvnckssqsllynsnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyfcqqyystpltlgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
[0180]
将上述抗体进行基因合成，构建重组质粒，重组质粒经测序鉴定为正确插入有目的片段的阳性克隆后，使用质粒提取试剂盒制备足量无菌重组质粒，用于瞬时转染生产蛋白样品。
[0181]
实施例14不同恒定区抗体生产
[0182]
将cr3#24/igg4、cr3#30/igg4、cr3#75/igg4、cr3#30/igg1(n297a/k322a)、cr3#30/igg1(n297a)、cr3#30/igg2、cr3#75/igg1(n297a/k322a)、cr3#75/igg1(n297a)和cr3#75/igg2共计9种抗体的无菌重组质粒经转染试剂(invitrogen)转染至6
×
106个expicho中进行抗体表达。
[0183]
将重组expicho细胞在37℃、5％co2中培养9～11天后，抗体分泌至无血清细胞培养上清中。对发酵液进行proteina-hplc检测蛋白表达量。步骤如下：
[0184]
将发酵液样品用0.22μm滤膜(sartorius，cat#17c07ft)过滤后，上样至poros-20a column(thermo scientific，cat#1-5024-12)，25℃下进行proteina-hplc检测，色谱参数见表6。最后用empower 3进行数据采集和分析，结果如表7所示。
[0185]
表6 proteina-hplc色谱参数
[0186][0187][0188]
表7 proteina-hplc检测发酵液蛋白表达量
[0189][0190]
9批cho细胞培养9～11天后，对全部发酵液进行sec-hplc检测蛋白纯度，步骤如下：
[0191]
将蛋白样品用0.22μm滤膜(sartorius，cat#17c07ft)过滤后，上样至tskgel g3000 swxl sec column(tosoh，cat#008541)，25℃下进行sec分离，设备为waters e2695，检测器为waters 2998pda检测器，流动相为50mm磷酸盐+400mm氯化钠(ph 7.0)缓冲液，设置流速为0.5ml/min，进样体积为10μl，在280nm处测定分离的各组分吸光值。最后采用empower 3进行数据采集和分析，结果如表8所示。
[0192]
表8 sec-hplc检测发酵液纯度
[0193]
样品编号样品名称高分子量(％)主峰(％)低分子量(％)s125(38#)-1cr3#24/igg430.219.150.7s125(38#)-2cr3#30/igg431.619.748.6s125(38#)-3cr3#75/igg428.424.846.8
s125(38#)-4cr3#30/igg1(n297a/k322a)29.722.747.6s125(38#)-5cr3#30/igg1(n297a)29.325.545.2s125(38#)-6cr3#30/igg234.610.854.7s125(38#)-7cr3#75/igg1(n297a/k322a)30.019.051.0s125(38#)-8cr3#75/igg1(n297a)29.619.850.5s125(38#)-9cr3#75/igg227.113.559.5
[0194]
9个候选分子的发酵液进行prisma捕获后，利用紫外分光光度计测定蛋白浓度，步骤如下：
[0195]
取供试品溶液，以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照。采用1cm的石英吸收池，将样品用空白溶剂进行稀释，将装有样品的石英吸收池放入检测池检测。紫外分光光度计为implen，型号np80。
[0196]
蛋白浓度计算公式如下：
[0197][0198]
式中，x：稀释倍数；供试品蛋白的吸收系数。
[0199]
结果如表9所示。
[0200]
表9纯化样品浓度
[0201]
样品编号样品名称蛋白浓度(mg/ml)s125(38#)-1cr3#24/igg42.5s125(38#)-2cr3#30/igg42.6s125(38#)-3cr3#75/igg42.5s125(38#)-4cr3#30/igg1(n297a/k322a)4.4s125(38#)-5cr3#30/igg1(n297a)2.4s125(38#)-6cr3#30/igg21.4s125(38#)-7cr3#75/igg1(n297a/k322a)3.0s125(38#)-8cr3#75/igg1(n297a)2.0s125(38#)-9cr3#75/igg21.4
[0202]
将9个候选分子的发酵液进行prisma捕获后，进行sec-hplc分析，步骤如下：
[0203]
将蛋白样品用0.22μm滤膜(sartorius，cat#17c07ft)过滤后，上样至tskgel g3000 swxl sec column(tosoh，cat#008541)，25℃下进行sec分离，设备为waters e2695，检测器为waters 2998 pda检测器，流动相为50mm磷酸盐+400mm氯化钠(ph 7.0)缓冲液，设置流速为0.5ml/min，进样体积为10μl，在280nm处测定吸光值。最后采用empower 3进行数据采集和分析，结果如表10所示。
[0204]
表10 sec-hplc检测纯化样品纯度
[0205][0206]
综合上述结果，9种抗体顺利完成样品生产，浓度均大于1mg/ml，纯度均高于90％，可以进行后续实验。
[0207]
实施例15聚集性分析
[0208]
本实施例利用icief测定各候选分子等电点，步骤如下：
[0209]
样品脱盐后，用蒸馏水稀释至蛋白浓度约为2mg/ml，按以下体系配置(200μl体系)：8μl 2％pharmalyte(ph 3～10)(ge，cat#17045601)，70μl 1％mc(proteinsimple，cat#1018761)，1μl low pi(proteinsimple，cat#102222)，1μl high pi(proteinsimple，cat#101996)，100μl 8m尿素(sigma，cat#u0631-500g1)，20μl样品。
[0210]
体系配置于离心管中，随后10000g离心5min，取上清(60～120μl)加入内插管，内插管置于离心管中10000g离心5min，取出内插管，放于进样瓶中，上机检测，设备为proteinsimple ice3。结果如表11所示，实际等电点略高于预测的等电点。
[0211]
表11候选分子等电点
[0212]
样品编号样品名称预测等电点icief-等电点s125(38#)-1cr3#24/igg45.976.13s125(38#)-2cr3#30/igg46.186.30s125(38#)-3cr3#75/igg45.925.89s125(38#)-4cr3#30/igg1(n297a/k322a)7.247.33s125(38#)-5cr3#30/igg1(n297a)7.567.57s125(38#)-6cr3#30/igg26.506.97s125(38#)-7cr3#75/igg1(n297a/k322a)6.366.58s125(38#)-8cr3#75/igg1(n297a)6.516.76s125(38#)-9cr3#75/igg25.976.18
[0213]
实施例16毛细管电泳分析
[0214]
将9个候选分子的发酵液进行prisma捕获后，进行ce-sds分析，步骤如下：
[0215]
将蛋白样品用30μm超滤离心管(sartorius，cat#vs0122)超滤，然后制备样品，70℃加热，上样，25℃下进行ce-sds分离，设备为sciex pa800 plus，检测器为pda检测器，在220nm处测定吸光值。最后采用32karat进行数据采集和分析，结果如表12所示，其中cr3#75/igg2纯度较低。
[0216]
表12毛细管电泳检测纯化样品纯度
[0217][0218]
实施例17c5特异性抗体的蛋白稳定性检测
[0219]
本实施例采用蛋白稳定性分析系统(unchained labs，calif.)的tm&tagg with optional dls程序，检测蛋白粒径和稳定性。通过分析结果参数tm(蛋白熔解温度)、tagg266(蛋白聚集温度)、tagg473(蛋白聚集温度)、z-ave.dia(蛋白平均粒径)、pdi(多分散性系数)、pk1 mode dia、pk1 mass(％)、pk2 mode dia和pk2 mass(％)9个参数，多角度分析蛋白粒度及粒度分布和热稳定性。步骤如下：
[0220]
取抗体9μl加入uni管(unchained labs，calif.)中，每种抗体重复2个复孔，选定tm&tagg with optional dls程序进行分析。
[0221]
25℃和95℃粒度结果分别如表13和表14所示，tm&tagg结果如表15所示。其中，z-ave.dia-样品平均水化动力学直径，反映样品整体粒径情况；pdi-多分散性系数，pdi《0.1表示粒度窄分布，值越大表示粒径分布越不均一，离散程度越高；fit var-拟合偏差，小于0.01表示z-ave.dia和pdi高可信度，值越大表示可信度越低；pk1 mode dia-光强分布显示多峰时，第一个主峰的众数粒径；pk 1mass(％)-第一个峰的质量占比。
[0222]
从表13可以看出，s125(38#)-3/6/7/9平均水化动力学直径与pk1 mode dia.均在11nm左右，无大粒径成分，pdi《0.1，表明粒度均一，推测为蛋白单体；组中其余样品均存在较大粒径成分，推测为聚集体。从表14可以看出，由平均水化动力学直径和pdi可知，经过加热后蛋白分子产生明显聚集。从表15可以看出，s125(38#)-4和s125(38#)-7tm较高，推测构象热稳定性较高，s125(38#)-2/4/5/6/7tagg266均在60℃以上，推测胶体热稳定性较高。
[0223]
表13 25℃粒度结果
[0224][0225][0226]
表14 95℃粒度结果
[0227][0228][0229]
表15 tm&tagg结果
[0230][0231]
综合上述结果，可以看出s125(38#)-7组的综合热稳定性较高，即cr3#75/igg1(n297a/k322a)具有优于cr3#75/igg4的热稳定性。
[0232]
综上所述，本发明的抗c5抗体与人源重组c5蛋白具有显著的结合能力，半衰期长，溶解性良好，热稳定性良好，有望开发为蛋白药物，应用于预防和/或治疗c5过度激活导致的自身免疫疾病中。
[0233]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.抗c5抗体，其特征在于，所述抗c5抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括seq id no:3、seq id no:9或seq id no:15所示的cdr3；所述轻链可变区包括seq id no:6、seq id no:12或seq id no:18所示的cdr3。2.根据权利要求1所述的抗c5抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括seq id no:1、seq id no:7或seq id no:13所示的cdr1；优选地，所述重链可变区还包括seq id no:2、seq id no:8或seq id no:14所示的cdr2；优选地，所述轻链可变区还包括seq id no:4、seq id no:10或seq id no:16所示的cdr1；优选地，所述轻链可变区还包括seq id no:5、seq id no:11或seq id no:17所示的cdr2。3.根据权利要求1或2所述的抗c5抗体，其特征在于，所述抗c5抗体的重链可变区包括seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、seq id no:3所示的cdr3；所述抗c5抗体的轻链可变区包括seq id no:4所示的cdr1、seq id no:5所示的cdr2、seq id no:6所示的cdr3；优选地，所述抗c5抗体的重链可变区包括seq id no:7所示的cdr1、seq id no:8所示的cdr2、seq id no:9所示的cdr3；所述抗c5抗体的轻链可变区包括seq id no:10所示的cdr1、seq id no:11所示的cdr2、seq id no:12所示的cdr3；优选地，所述抗c5抗体的重链可变区包括seq id no:13所示的cdr1、seq id no:14所示的cdr2、seq id no:15所示的cdr3；所述抗c5抗体的轻链可变区包括seq id no:16所示的cdr1、seq id no:17所示的cdr2、seq id no:18所示的cdr3。4.根据权利要求1-3任一项所述的抗c5抗体，其特征在于，所述抗c5抗体的重链可变区包括seq id no:19所示的氨基酸序列，轻链可变区包括seq id no:20所示的氨基酸序列；优选地，所述抗c5抗体的重链可变区包括seq id no:21所示的氨基酸序列，轻链可变区包括seq id no:22所示的氨基酸序列；优选地，所述抗c5抗体的重链可变区包括seq id no:23所示的氨基酸序列，轻链可变区包括seq id no:24所示的氨基酸序列；优选地，所述抗c5抗体还包括恒定区；优选地，所述恒定区来源于igg4、igg1或igg2中的任意一种；优选地，所述igg4具有s228p突变；优选地，所述igg1具有n297a和/或k322a突变；优选地，所述igg2具有s257a突变。5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1-4任一项所述的抗c5抗体的dna片段。6.表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述的核酸分子。7.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1-4任一项所述的抗c5抗体；优选地，所述重组细胞的基因组中整合有权利要求5所述的核酸分子；
优选地，所述重组细胞包括权利要求6所述的表达载体。8.一种权利要求1-4任一项所述的抗c5抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将抗c5抗体的编码核酸连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；(2)提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的抗c5抗体；优选地，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。10.权利要求1-4任一项所述的抗c5抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备疾病检测试剂和/或疾病治疗药物中的应用；优选地，所述疾病包括c5过度激活导致的自身免疫疾病。

技术总结
本发明提供了抗C5抗体及其应用，所述抗C5抗体的可变区包括SEQ ID NO:19～20、SEQ ID NO:21～22或SEQ ID NO:23～24所述的氨基酸序列。本发明的抗C5抗体CR3#24、CR3#30和CR3#75、尤其是CR3#75，与人源重组C5蛋白具有显著的结合能力，表现出明显的CDC抑制作用，相比于Eculizumab与C5具有更优的结合活性，半衰期长，溶解性良好，热稳定性良好，在成药性开发方面具有潜在的应用价值。面具有潜在的应用价值。面具有潜在的应用价值。


技术研发人员：吕明启 李剑 黄瑞晶 于永生 王根辈 王轶博 李文蕾
受保护的技术使用者：天士力生物医药股份有限公司
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/3/8