一种糖尿病微环境响应性复合智能水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种糖尿病微环境响应性复合智能水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。


背景技术：

2.糖尿病是一种以代谢失衡，高血糖以及胰岛b细胞破坏或胰岛素抵抗为特点的慢性系统性疾病。糖尿病患者自体组织长期处于慢性炎症的微环境中，在组织损伤时对自身愈合产生不利影响。此外，由于临床惰性和患者依从性等影响，糖尿病患者往往得不到及时有效的治疗，因此，许多糖尿病患者处于血糖不受控制的波动状态。糖化血红蛋白是衡量糖尿病患者血糖稳定的重要指标，然而据统计，我国糖尿病患者中糖化血红蛋白的达标率仅为19.5％。随着近年来相关研究的深入，糖尿病对皮肤缺损，血管再生，骨矿物质密度及骨折风险的负面影响昭然若揭，且有实验表明血糖波动比持续性高血糖对于骨组织损害更大。其背后机制涉及血糖波动对自体细胞线粒体的损伤，从而导致活性氧升高，以及机体自身抗氧化酶活力降低等。通常，自体组织缺损的愈合涉及多个复杂的生物过程：炎症反应初期，创伤信号激活免疫细胞，引起炎症因子化学梯度，并募集更多的免疫细胞到达伤口，引发免疫应答；经过急性炎症清除坏死组织和细菌后，缺损部位转为慢性炎症，通过免疫调控募集干细胞，诱导其分化成各种功能性细胞，重构新生组织。在健康状态下，免疫细胞与成骨细胞，成纤维细胞等相互作用，形成复杂精细的调控网络，促进组织重建。然而，在糖尿病等全身状态异常时，会通过多条途径对免疫系统和修复性干细胞造成干扰，扰乱钙磷代谢，降调胞外基质矿化，降低新骨生成效率与质量。由于全球庞大的糖尿病患者群体，较差的血糖控制水平，组织损伤的医疗成本和缺损迁延不愈对生活质量的影响，针对糖尿病状态制备更加智能有效的组织缺损治疗策略显得尤为重要。
3.目前，由于损伤部位的“智能释药”需求，已有许多研究专注于响应性智能释药载体研发，其响应条件包括磁响应，热响应，近红外响应等，然而，其“自律性”并不能得到保证。诸如光热疗法，磁场刺激释药等响应性材料，需要基于临床医师的诊察判断来决定刺激的施加，而由于“临床惰性”和患者依从性的问题，糖尿病患者往往不能接收到及时的临床治疗干预。而葡萄糖氧化酶为代表的自响应型药物载体亦存在高免疫原性，灵敏性和滞后性等问题，因此，研发更精准的智能响应性自律释药载体对于血糖控制不良的血糖波动状态下组织缺损的治疗具有潜在的临床意义。
4.基于苯硼酯化学键的生物材料相对于葡萄糖氧化酶，伴刀豆蛋白等生物源性糖响应分子，易于与葡萄糖结合，具有非免疫原性，易于制造，运输，储存及维护，是葡萄糖响应材料的优良选择。此外，苯硼酸还能够对以过氧化氢为代表的活性氧产生特异性降解行为，活性氧在慢性伤口环境中同样具有高表达。除了血糖和活性氧外，组织缺损周围还会高表达炎性因子基质金属蛋白酶(mmp-9)，mmp-9由巨噬细胞主要产出，是自身免疫应答的重要分子，但在糖尿病微环境下，其表达明显增加，会导致自身组织的异常水解，加重伤口负担。
5.通过合理的药物搭载和递送策略完成对局部自身组织的干预是重中之重。研究表明不论是软组织再生，还是骨缺损愈合，均受到自身免疫系统的调控。研究指出，良好的组织工程生物学材料应该调节免疫反应，促进释放细胞因子以推动下游干细胞主导的修复性分化作用，因此对组织缺损的调控离不开免疫-修复生物级联的共同干预。而生物级联反应中，不同的生物学事件发生的时间有所不同，比如在机体损伤出现后，1-3天内通常为急性炎症期，免疫细胞到达缺损部位，产生促炎因子，分泌蛋白酶，执行抗原呈递和吞噬作用，基于趋化因子招募更多的免疫细胞，这一系列生物学反应的目的在于清除入侵的病原微生物和组织碎片。而在4-5天之后，急性炎症期逐渐转为慢性炎症期，修复性免疫细胞逐渐开始分化，通过抑制炎症和分泌趋化因子，募集干细胞到达缺损部位，并通过修复性细胞因子的分泌促进干细胞分化，加快组织愈合。在糖尿病这一代谢异常的状态下，急性炎症期往往不能依靠自身免疫调节功能进行及时的终止，从而导致局部长期的炎症微环境，引发自体组织降解，局部活性氧增加等病理变化。因此，通过将释放药物的时机与宿主自身生物学行为出现的时间点相结合，可以实现更好的治疗逻辑，精准控制每一步生物学反应，从而达到更好的组织工程治疗效果。然而，目前已有的药物缓释的生物材料中，普遍负载一种药物，或是将两种药物进行负载并以相似的释放曲线进行递送，这些策略无法针对生物级联中各种生物学事件做到精准的药物释放调控。进一步而言，即使有生物材料能够实现两种(或以上)药物的负载和差异化的药物释放，在动态病理微环境下，实现响应多种病理刺激的程序化药物递送也存在诸多挑战。


技术实现要素：

6.为解决上述关键临床问题，本发明提供一种具有响应糖尿病多种病理刺激的特性的，能够调节药物时序性释放的可注射复合双网络水凝胶及其制备方法和应用。
7.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明第一方面提供一种双网格水凝胶，所述双网格水凝胶包括第一网络和第二网络，所述第二网络包封在所述第一网络中，所述第一网络与所述第二网络之间具有可逆的相互作用力；所述第一网络包括聚乙烯醇聚合物，所述第二网络包括明胶颗粒。
9.可选地，所述聚乙烯醇聚合物选自四臂苯硼酸交联的聚乙烯醇聚合物；
10.可选地，所述可逆的相互作用力包括静电作用力、疏水作用力、氢键作用力。
11.本发明第二方面提供一种双网格水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将包含聚乙烯醇的溶液与包含明胶颗粒的物料混合后，加入包含交联剂的物料混合得包含预混合胶体凝胶的物料，固化，得包含双网络水凝胶的产品。
12.本发明第三方面提供一种双网格水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将包含聚乙烯醇的物料加入包含明胶颗粒悬浮液的物料中，冷冻干燥，得包含双网格水凝胶预聚合粉末的物料，加入包含交联剂的水性溶液后混合的，固化，得包含双网络水凝胶的产品。
13.可选地，所述聚乙烯醇的分子量为47-145kda，浓度为0.01-0.2g/ml。
14.可选地，所述明胶颗粒尺寸为50nm～500μm；所述明胶颗粒表面电荷为-40～20mv；所述络明胶颗粒的体积分数为
15.可选地，所述明胶颗粒和所述聚乙烯醇的质量比例为0.1～10。所述明胶颗粒和所
述交联剂的质量比例为0.5～100。
16.可选地，所述固化的温度为室温，所述固化的时间为80-120秒。
17.可选地，所述交联剂命名为tspba，所述交联剂具有如式1所示的结构式：
[0018][0019][0020]
本发明第四方面提供一种双网格水凝胶作为药物载体中的应用。
[0021]
本发明第五方面提供一种双网格水凝胶在糖尿病骨缺损中的应用，所述应用为用于骨组织，软骨组织，肌肉、血管组织缺损的修复填充。
[0022]
可选地，当用于人体组织创伤修复填充材料时，所述双网络结构复合水凝胶中可以混合有羟基磷灰石、磷酸钙、生物活性陶瓷、生物活性玻璃、脱细胞骨基质等颗粒性骨修复材料。
[0023]
本发明第六方面供一种双网格水凝胶作为止血制品中的应用。
[0024]
可选地，所述应用包括：用于体表组织、体腔内组织器官的有血创面的止血、防黏连、防感染、促进组织愈合和/或封闭伤口。
[0025]
可选地，所述双网络水凝胶中可以混合有生物活性物质、生物活性蛋白药物、活细胞颗粒或药物分子中的一种或几种的组合。
[0026]
原理：本发明开发了以明胶颗粒或明胶核壳颗粒作为基本单元，在核壳颗粒中，刚性核可增加胶体颗粒的机械强度，柔性壳使颗粒保留明胶高分子相的高形变性和表面电荷，使得复合材料颗粒间仍然能够通过明胶高分子相建立可逆的相互作用(包括静电、疏水、氢键作用力)，而保持胶体凝胶网络的自修复能力，同时增加胶体的密堆积程度和体积分数，实现对胶体凝胶的增强。进一步，刚性核颗粒的复合还赋予胶体凝胶更多的功能性，如成骨，光热性，磁响应性等功能。进一步在明胶相中引入可进一步构建共价键交联的基团构建兼具高强度和自修复能力的胶体凝胶的新材料设计理念，为胶体凝胶类材料在生物医学领域的广泛应用奠定理论基础。
[0027]
本发明将可逆交联的聚乙烯醇(pva)网络与由明胶纳米粒子静电组装的胶体网络相结合，开发了一种基于双重逻辑且适应性强的水凝胶。四臂苯硼酸交联的聚乙烯醇水凝胶网络可以在高活性氧或高葡萄糖环境分解并加速药物分子的释放，而明胶胶体网络具有高细胞相容性以及在高金属基质蛋白酶mmp-9诱导的酶响应性。因此，该复合双网络水凝胶
可根据动态糖尿病微环境中生物信号分子控制水凝胶网络的可控药物释放。
[0028]
有益效果：
[0029]
(1)本发明制备有明胶颗粒基组成的双网络水凝胶，水凝胶在聚乙烯醇网络未共价交联时，由于颗粒之间的可逆相互作用，凝胶具有剪切变稀，自修复的特点；进一步实现注射和打印性能之后，凝胶可按需通过聚乙烯醇的非共价键交联实现凝胶力学强度的增加。这一特性使其在微创植入材料和人工细胞外基质等领域具有广阔的应用前景。
[0030]
(2)本发明制备得到的可共价交联明胶颗粒凝胶，具有可注射、自修复和可塑性的优异性能的同时，还可以通过聚乙烯醇的共价交联得到具有高力学强度和结构稳定性的双网络水凝胶，通过调控凝胶的质量分数，共价交联基团接枝度凝胶的储能模量可在1～500kpa之间调控，远高于传统依靠物理相互作用形成的颗粒凝胶，并保证了凝胶植入后结构的完整性和高力学强度。
[0031]
(3)本发明在复杂的糖尿病微环境中，其中慢性炎症和代谢受损诱导的ros的过度表达，并增加组织缺损处的葡萄糖和mmps浓度。本发明制备的双网络水凝胶具有精确响应糖尿病微环境性能可以同时响应与糖尿病相关的三重刺激，并控制药物的释放。相比较，传统刺激响应生物材料通响应单一刺激。而当前双网络水凝胶可以响应特定三种的糖尿病微环境生物线索具有显著的优异性。
[0032]
(4)本发明中pva网络和明胶纳米颗粒网络均属于多孔网络，药物分子易渗透入水凝胶中，且网络本身对药物具有物理阻隔作用，使其释放遵循非费克释放模型，根据负载药物的剂量，与pva或明胶纳米颗粒混合的时间，以及pva及明胶纳米颗粒的比例调整，可以实现两种负载药物的差异化释放速率调控，从而更好地契合人体损伤部位炎症到抗炎的生物学过程，使药物释放峰值具有针对性。
附图说明
[0033]
图1为实施例1中(a)为对比例2制得的胶体凝胶的电镜图，(b)为对比例1制得的聚乙烯醇水凝胶的电镜图，(c)为实施例1制得的双网络水凝胶电镜图。
[0034]
图2为实施例5中水凝胶材料的压缩应力应变曲线。
[0035]
图3为是实施例5中水凝胶材料的循环压缩应力应变曲线。
[0036]
图4为实施例6中水凝胶材料的拉伸应力应变曲线。
[0037]
图5为实施例6中水凝胶材料的循环拉伸应力应变曲线。
[0038]
图6为实施例7和对比例3中材料的粘合应力应变曲线。
[0039]
图7是实施例8中水凝胶材料在不同葡萄糖浓度下的响应性降解行为；
[0040]
图8是实施例9中水凝胶材料在不同基质金属蛋白酶浓度下的响应性降解行为。
[0041]
图9是实施例10中水凝胶材料在不同过氧化氢浓度下的响应性降解行为。
[0042]
图10是实施例11中水凝胶材料在负载了两种模型药物后，于糖尿病模拟环境下的药物释放行为。
[0043]
图11是实施例12中水凝胶材料在负载了两种模型药物后，于高血糖/低血糖交替变换条件下的药物释放行为。
[0044]
图12是实施例13中水凝胶材料在负载了两种模型药物后，于有基质金属蛋白酶/无基质金属蛋白酶的两种交替变换条件下的药物释放行为。
[0045]
图13是实施例14中健康和糖尿病大鼠颅顶骨缺损在植入材料后2周，4周，8周的microct重建图。
[0046]
图14是实施例15中健康和糖尿病大鼠股骨干骺端在圆柱形缺损制备和植入材料后4周，8周的h&e染色光学显微镜采图。
具体实施方式
[0047]
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。如无特殊说明，实施例中所使用的原料均商业途径购买。
[0048]
实施例1
[0049]
将0.1g n,n,n,n-四甲基-1,3-丙二胺(购买自中国阿拉丁试剂公司)和0.5g4-(溴甲基)苯基硼酸(购买自中国阿拉丁试剂公司)分别溶解在10ml二甲基甲酰胺中并混合在一起。在60℃搅拌过夜后，将上述混合物倒入100ml四氢呋喃中得到白色沉淀并过滤，再用四氢呋喃洗涤白色沉淀。真空干燥过夜后得到四臂苯硼酸(tspba)。
[0050]
将0.05g分子量为47、145kda的pva在80℃溶解在1ml去离子水中得到均匀溶液，并通过鲁尔转接头与0.1g明胶纳米颗粒共混均匀后，再与0.025gtspba共混以获得可注射自修复预聚合双网络水凝胶。将上述水凝胶在室温等待100秒，得到双网络水凝胶。
[0051]
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表1)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1hz，应变为0.5％。水凝胶的微观结构通过扫描电镜进行观察(图1)。
[0052]
表1
[0053] 47kda pva145kda储能模量1.2kpa7.1kpa损耗模量0.1kpa0.4kpa自修复效率0.740.78
[0054]
对比例1
[0055]
将0.1g n,n,n,n-四甲基-1,3-丙二胺(购买自中国阿拉丁试剂公司)和0.5g4-(溴甲基)苯基硼酸(购买自中国阿拉丁试剂公司)分别溶解在10ml二甲基甲酰胺中并混合在一起。在60℃搅拌过夜后，将上述混合物倒入100ml四氢呋喃中得到白色沉淀并过滤，再用四氢呋喃洗涤白色沉淀。真空干燥过夜后得到tspba。
[0056]
将0.05g分子量为47、145kda的pva在80℃溶解在1ml去离子水中得到均匀溶液，并通过鲁尔转接头与0.025g tspba共混以获得聚乙烯醇水凝胶预聚液。将上述水凝胶在室温等待100秒，得到聚乙烯醇水凝胶。
[0057]
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表2)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1hz，应变为0.5％。水凝胶的微观结构通过扫描电镜进行观察(图1)。
[0058]
表2
[0059] 47kda pva145kda储能模量0.21kpa0.69kpa损耗模量0.02kpa0.02kpa自修复效率0.810.86
[0060]
对比例2
[0061]
将0.1g明胶纳米颗粒与1ml去离子水共混均匀后以获得可注射自修复胶体凝胶。胶体凝胶的储能模量和损耗模量(表3)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1hz，应变为0.5％。水凝胶的微观结构通过扫描电镜进行观察(图1)。
[0062]
表3
[0063]
储能模量2.1kpa损耗模量0.2kpa自修复效率0.58
[0064]
实施例2
[0065]
将0.1g n,n,n,n-四甲基-1,3-丙二胺(购买自中国阿拉丁试剂公司)和0.5g4-(溴甲基)苯基硼酸(购买自中国阿拉丁试剂公司)分别溶解在10ml二甲基甲酰胺中并混合在一起。在60℃搅拌过夜后，将上述混合物倒入100ml四氢呋喃中得到白色沉淀并过滤，再用四氢呋喃洗涤白色沉淀。真空干燥过夜后得到tspba。
[0066]
将0.025g tspba溶解在1ml的含有0.1g明胶纳米颗粒的去离子水中得到均匀溶液并搅拌12hrs，之后冷冻干燥得到颗粒状粉末，将0.025g tspba溶解在1ml去离子水中得到均匀溶液后，与上述颗粒粉末共混以获得预聚合双网络水凝胶。将上述水凝胶在室温等待100秒，得到双网络水凝胶。
[0067]
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表4)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1hz，应变为0.5％。
[0068]
表4
[0069] 47kda pva145kda储能模量65.2kpa64.1kpa损耗模量1.7kpa1.8kpa自修复效率0.390.38
[0070]
实施例3
[0071]
将0.1g n,n,n,n-四甲基-1,3-丙二胺(购买自中国阿拉丁试剂公司)和0.5g4-(溴甲基)苯基硼酸(购买自中国阿拉丁试剂公司)分别溶解在10ml二甲基甲酰胺中并混合在一起。在60℃搅拌过夜后，将上述混合物倒入100ml四氢呋喃中得到白色沉淀并过滤，再用四氢呋喃洗涤白色沉淀。真空干燥过夜后得到tspba。
[0072]
将0.1g分子量为47、145kda的pva在80℃溶解在1ml去离子水中得到均匀溶液，并通过鲁尔转接头与0.1g明胶纳米颗粒共混均匀后，再与0.025gtspba共混以获得可注射自修复预聚合双网络水凝胶。将上述水凝胶在室温等待100秒，得到双网络水凝胶。
[0073]
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表5)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
[0074]
表5
[0075]
[0076][0077]
实施例4
[0078]
将0.1g n,n,n,n-四甲基-1,3-丙二胺(购买自中国阿拉丁试剂公司)和0.5g4-(溴甲基)苯基硼酸(购买自中国阿拉丁试剂公司)分别溶解在10ml二甲基甲酰胺中并混合在一起。在60℃搅拌过夜后，将上述混合物倒入100ml四氢呋喃中得到白色沉淀并过滤，再用四氢呋喃洗涤白色沉淀。真空干燥过夜后得到tspba。
[0079]
将0.05g分子量为47、145kda的pva在80℃溶解在1ml去离子水中得到均匀溶液，并通过鲁尔转接头与0.1g明胶纳米颗粒共混均匀后，再与0.05gtspba共混以获得可注射自修复预聚合双网络水凝胶。将上述水凝胶在室温等待100秒，得到双网络水凝胶。
[0080]
上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表6)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到，其中频率为1hz，应变为0.5％。压缩力学应变和断裂强度通过力学测试机获得，其中压缩速率为0.021 1/s。
[0081]
表6
[0082] 47kda pva145kda储能模量3.2kpa9.1kpa损耗模量0.2kpa1.1kpa自修复效率0.420.78
[0083]
实施例5
[0084]
压缩性能，压缩回复性能
[0085]
用实施例1-4中制备的聚乙烯醇分子量为145kda的双网络水凝胶和对比例1,2中制备的凝胶，通过在三维打印模具中成型得到圆柱形支架(直径12mm，高8mm)。使用万能力学测试机测试凝胶的压缩应力应变曲线，如图2所示。进一步将实施例1-4制备的双网络水凝胶进行循环压缩测试。图3为双网络水凝胶的循环应力应变曲线。
[0086]
实施例6
[0087]
拉伸性能
[0088]
用实施例1-4中制备的聚乙烯醇分子量为145kda的双网络水凝胶和对比例1,2中制备的凝胶，通过在模具中成胶得到标准单轴拉伸测试样条(根据iso527-2标准的5b型设计)。并使用配备有50n测力传感器的万能试验机以50mm/min的变形速度对水凝胶进行拉伸试验，图4是水凝胶的拉伸应力应变曲线。进一步将实施例1-4制备的双网络水凝胶进行循环拉伸测试。图5为双网络水凝胶的循环应力应变曲线。
[0089]
实施例7
[0090]
粘合测试性能
[0091]
使用实施例1～4中得到的双网络水凝胶，搭接粘合在两块猪皮(5.0cm
×
2.0cm矩形)表面，其中搭接重叠区域为(1.5cm
×
2.0cm矩形)之后，将水凝胶涂抹至猪皮表面并进行搭接按压后静置10min后，使用具有50n测力传感器的拉伸测试仪对搭接样品进行剪切剥离(剥离速率为:10mm/min)，得到剥离过程应力应变曲线，用曲线的应力最大点定义粘合强度。最大粘合力如图6所述。
[0092]
对比例3
[0093]
使用商用组织粘合剂纤维蛋白胶(购买自上海莱士)和氰基丙烯酸酯胶(购买自中国科峰生物)搭接粘合在两块猪皮(5.0cm
×
2.0cm矩形)表面，其中搭接重叠区域为(1.5cm
×
2.0cm矩形)之后，将凝胶涂抹至猪皮表面并进行搭接按压后静置10min后，使用具有50n测力传感器的拉伸测试仪对搭接样品进行剪切剥离(剥离速率为:10mm/min)，得到剥离过程应力应变曲线，用曲线的应力最大点定义粘合强度。最大粘合力如图6所述。
[0094]
实施例8
[0095]
使用实施例1-4实施例中的复合水凝胶以确定其在不同糖浓度下的响应性降解能力。具体的，将复合水凝胶在制备前称量干重记为m1，分组后浸泡于含有25mm葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水溶液中(pbs，ph＝7.4)，以模拟体内高血糖环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在1d，4d，7d，14d取出水凝胶，以冷冻干燥机在-50℃进行低温真空干燥24h，称量干重记为m2，并根据m1和m2的比例计算水凝胶降解速率。
[0096]
使用复合水凝胶确定其在无糖pbs环境中，以及模拟生理糖浓度环境中的降解能力。具体的，将复合水凝胶在制备前称量干重记为m1，分组后浸泡于含有0mm和5mm葡萄糖的pbs中(ph＝7.4)，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在1d，4d，7d，14d取出水凝胶，以冷冻干燥机在-50℃进行低温真空干燥24h，称量干重记为m2，并根据m1和m2的比例计算水凝胶降解速率。
[0097]
如图7所示，复合水凝胶在单纯pbs中，复合水凝胶14天内降解速度不超过5％，在5mm生理血糖浓度下，降解接近10％，在25mm模拟高糖浓度下，水凝胶降解程度超过35％，显示其具有明显的血糖响应性降解特性。
[0098]
实施例9
[0099]
使用实施例1-4中复合水凝胶以确定其在不同基质金属蛋白酶浓度下的响应性降解能力。具体的，将复合水凝胶在制备前称量干重记为m1，浸泡于含有10nm基质金属蛋白酶9的pbs中(ph＝7.4)，以模拟体内炎症缺损区域的富蛋白酶微环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在1d，4d，7d，14d取出水凝胶，以冷冻干燥机在-50℃进行低温真空干燥24h，称量干重记为m2，并根据m1和m2的比例计算水凝胶降解速率。
[0100]
使用复合水凝胶以确定其在无基质金属蛋白酶状态下的降解能力。具体的，将复合水凝胶在制备前称量干重记为m1，浸泡于含有0nm基质金属蛋白酶9的pbs中(ph＝7.4)，以模拟体内炎症缺损区域的富蛋白酶微环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在1d，4d，7d，14d取出水凝胶，以冷冻干燥机在-50℃进行低温真空干燥24h，称量干重记为m2，并根据m1和m2的比例计算水凝胶降解速率。
[0101]
如图8所示，在不含基质金属蛋白酶的单纯pbs溶液中，复合水凝胶14d内的降解程度小于5％，而在10nm的基质金属蛋白酶模拟条件下，水凝胶几乎达到30％的材料降解，相较于单纯pbs而言，复合水凝胶体现出响应于基质金属蛋白酶的降解特性。
[0102]
实施例10
[0103]
使用实施例1-4中复合水凝胶以确定其在高活性氧存在下的响应性降解能力。具体的，将复合水凝胶在制备前称量干重记为m1，浸泡于含有1mm过氧化氢的pbs中(ph＝7.4)，以模拟体内炎症缺损区域的富蛋白酶微环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在1d，4d，7d，14d取出水凝胶，以冷冻干燥机在-50℃进行低温真空干燥24h，称量
干重记为m2，并根据m1和m2的比例计算水凝胶降解速率。
[0104]
使用复合水凝胶以确定其在无活性氧存在的状态下的降解能力。具体的，将复合水凝胶在制备前称量干重记为m1，浸泡于含有0mm过氧化氢的pbs中(ph＝7.4)，以模拟体内炎症缺损区域的富蛋白酶微环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在1d，4d，7d，14d取出水凝胶，以冷冻干燥机在-50℃进行低温真空干燥24h，称量干重记为m2，并根据m1和m2的比例计算水凝胶降解速率。
[0105]
如图9所示，在不含过氧化氢的单纯pbs溶液中，复合水凝胶14d内的降解程度小于5％，而在1mm的过氧化氢条件下，水凝胶几乎达到30％的材料降解，相较于单纯pbs而言，复合水凝胶体现出响应于过氧化氢的降解特性，且响应灵敏性与基质金属蛋白酶响应性相似。
[0106]
实施例11
[0107]
使用实施例1-4中复合水凝胶以确定其在糖尿病模拟环境下对负载生物活性大分子的基于治疗逻辑的程序化释放能力。具体的，以绿色荧光蛋白fitc和红色荧光蛋白rbitc接枝的牛血清蛋白(bsa)作为模型药物(记为模型药物1和模型药物2)。在制备复合水凝胶的过程中，将模型药物1与明胶纳米颗粒混合，得到负载于第二网络的药物释放体系；将模型药物2与pva混合，得到负载于第一网络的药物释放体系；将双网络水凝胶浸泡于糖尿病微环境模拟的液体中，具体为pbs(ph＝7.4)中含有25mm的葡萄糖，1mm的过氧化氢，10nm的基质金属蛋白酶9，并于室温下置于水平摇床上。分别在每天的固定时间吸取释放体系中的上清液，并加入等量新鲜pbs进行补充。根据两种荧光蛋白的激发和发射波长，检测收取样本中的荧光强度，并根据标准曲线换算为模型药物的浓度，每组检测3个样本，每个样本重复检测3次。
[0108]
模型药物1呈现出延迟的释放曲线，表明其从明胶纳米颗粒中释放需要更长时间，且在糖尿病模拟的体液环境中，在第5天达到释放峰值；模型药物2呈现出初始较高并持续稳定降低的释放曲线，表明其从pva网络中释放需要时间更短，且两种模型药物均可维持至少2周的稳定释放。
[0109]
实施例12
[0110]
使用实施例11中的双负载复合水凝胶检测其在单纯pbs下的药物释放能力。将双负载复合水凝胶浸泡于单纯pbs中(ph＝7.4)，并于室温下置于水平摇床上。分别在每天的固定时间吸取释放体系中的上清液，并加入等量新鲜pbs进行补充。根据两种荧光蛋白的激发和发射波长，检测收取样本中的荧光强度，并根据标准曲线换算为模型药物的浓度，每组检测3个样本，每个样本重复检测3次。
[0111]
使用实施例11中的双负载复合水凝胶以确定其在交替变化的糖浓度下的响应性智能控释能力。具体的，将复合水凝胶先浸泡于单纯pbs溶液(ph＝7.4)中，12h后吸走液体，并加入等体积的含有25mm葡萄糖的pbs溶液(ph＝7.4)，再过12h后，吸走高糖pbs，加入等体积单纯pbs溶液，以此类推，每12h更换一次降解环境，以模拟动态变化血糖的微环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h吸取释放体系中的上清液，并加入等量新鲜pbs或高糖pbs进行补充。根据两种荧光蛋白的激发和发射波长，检测收取样本中的荧光强度，并根据标准曲线换算为模型药物的浓度，每组检测3个样本，每个样本重复检测3次。
[0112]
在96小时的高糖-低糖交替变化的液体环境中，材料负载的模型药物1和模型药物2均体现出明显的响应性，具体为释放药物浓度在高糖环境下(灰色背景表示)增高，而在单纯pbs环境下(白色背景表示)降低。
[0113]
实施例13
[0114]
使用实施例11中的双负载复合水凝胶以确定其在交替变化的基质金属蛋白酶浓度下的响应性智能控释能力。具体的，将复合水凝胶先浸泡于单纯pbs溶液(ph＝7.4)中，12h后吸走液体，并加入等体积的含有1mm过氧化氢的pbs溶液(ph＝7.4)，再过12h后，吸走高糖pbs，加入等体积单纯pbs溶液，以此类推，每12h更换一次降解环境，以模拟动态变化血糖的微环境，同时保持室温置于水平摇床上(30转/分)。分别在12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h吸取释放体系中的上清液，并加入等量新鲜pbs或含过氧化氢的pbs进行补充。根据两种荧光蛋白的激发和发射波长，检测收取样本中的荧光强度，并根据标准曲线换算为模型药物的浓度，每组检测3个样本，每个样本重复检测3次。
[0115]
在96小时的高活性氧-无活性氧的交替变化的液体环境中，材料负载的模型药物1和模型药物2均体现出明显的响应性，具体为释放药物浓度在高糖环境下(灰色背景表示)增高，而在单纯pbs环境下(白色背景表示)降低。
[0116]
实施例14
[0117]
通过负载白介素10(il-10)和骨形态发生蛋白2(bmp-2)的复合水凝胶确定其在糖尿病动物模型中对于骨缺损的愈合促进效果。具体的，通过对sd大鼠(购自重庆医科大学动物实验中心)注射链脲佐菌素(40ng/kg)制造糖尿病大鼠模型，并通过每间隔1天注射重组胰岛素的方法制造血糖控制不良的血糖波动状态，并使用血糖仪进行血糖监测。使用3％w/v的戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉糖尿病大鼠，完全麻醉后，剔除颅顶骨部位的鼠毛，使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于手术术区对其进行局部麻醉。待糖尿病大鼠术区无痛觉后，沿着颅骨的矢状中线切开，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。翻开骨膜后，使用5mm环钻于基底骨上的矢状中线双边制备圆形窗口。小心去除圆形窗口的骨壁以避免损坏下方硬脑膜。在缺损处加入药物负载的复合水凝胶，逐层缝合骨膜层和皮肤层。术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于2w，4w，8w处死进行影像学分析。
[0118]
microct显示，糖尿病环境对新骨生成具有明显的负向作用，负载il-10和bmp-2的双负载复合水凝胶组成骨效果明显好于不载药的单纯复合水凝胶组以及糖尿病空白组。上述实验结果说明负载il-10和bmp-2的双负载复合水凝胶能够促进糖尿病下的骨缺损愈合。
[0119]
实施例15
[0120]
使用实施例14中的糖尿病大鼠，以及未进行糖尿病造模的健康大鼠，检测无填充的骨缺损伤口自愈合能力，以及实施例1-4中不载药的复合水凝胶的促成骨效果。具体的，使用3％w/v的戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉健康大鼠和糖尿病大鼠，完全麻醉后，剔除颅顶骨部位的鼠毛，使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于术区对其进行局部麻醉。待糖尿病大鼠术区无痛觉后，沿着颅骨的矢状中线切开，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。翻开骨膜后，使用5mm环钻于基底骨上的矢状中线双边制备圆形窗口。小心去除圆形窗口的骨壁以避免损坏下方硬脑膜。在缺损处加入药物负载的复合水凝胶，逐层缝合骨膜层和皮肤层。术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于2w，4w，8w处死进行影像学分析。
[0121]
实施例16
[0122]
使用实施例14中的负载il-10和bmp-2的复合水凝胶，以及实施例14中的糖尿病大鼠，以股骨缺损为模型，检测其对于股骨干骺端缺损的修复效果。具体的，使用3％w/v的戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉糖尿病大鼠，完全麻醉后，剔除腿部鼠毛，使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于手术术区对其进行局部麻醉。待糖尿病大鼠术区无痛觉后，沿着膝关节外侧做垂直切口，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。使用剥离子翻开骨膜后，使用直径1mm的裂钻于股骨干骺端正中心做直径1mm深约2mm的圆柱形缺损。在缺损处注射入负载il-10和bmp-2的复合水凝胶，逐层缝合肌肉和皮肤层。术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于4w，8w处死取材，对标本进行固定和厚度8μm的组织切片，对切片进行h&e染色，并进行组织学分析。
[0123]
实施例17
[0124]
使用实施例14中的糖尿病大鼠，以及未进行糖尿病造模的健康大鼠，检测无填充的骨缺损伤口自愈合能力，以及实施例1-4中不载药的复合水凝胶的促成骨效果。具体的，使用3％w/v的戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉健康大鼠和糖尿病大鼠，完全麻醉后，剔除腿部鼠毛，使用碘伏与酒精交替清理术区。随后使用2％利多卡因注射于术区对其进行局部麻醉。待糖尿病大鼠术区无痛觉后，沿着膝关节外侧做垂直切口，包括皮肤和骨膜的全厚瓣。使用剥离子翻开骨膜后，使用直径1mm的裂钻于股骨干骺端正中心做直径1mm深约2mm的圆柱形缺损。根据分组，在缺损处不作处理，或注射入不载药的复合水凝胶，逐层缝合肌肉和皮肤层。术后常规注射青霉素3天，7天后拆除缝线。分别于4w，8w处死取材，对标本进行固定和厚度8μm的组织切片，对切片进行h&e染色，并进行组织学分析。
[0125]
组织学染色显示，注射材料周围未见明显的免疫细胞浸润，说明其自身生物安全性较为理想。且糖尿病大鼠相对于健康大鼠，缺损自愈合能力明显减弱，而不载药的复合水凝胶显示出极其有限的促愈合能力。相较而言，负载il-10和bmp-2的复合水凝胶明显促进更多的编织骨形成，骨小梁数量增多。

技术特征：
1.一种双网格水凝胶，其特征在于，所述双网格水凝胶包括第一网络和第二网络，所述第二网络包封在所述第一网络中，所述第一网络与所述第二网络之间具有可逆的相互作用力；所述第一网络包括聚乙烯醇聚合物，所述第二网络包括明胶颗粒；优选地，所述聚乙烯醇聚合物选自四臂苯硼酸交联的聚乙烯醇聚合物；优选地，所述可逆的相互作用力包括静电作用力、疏水作用力、氢键作用力。2.一种权利要求1中所述水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将包含聚乙烯醇的溶液与包含明胶颗粒的物料混合后，加入包含交联剂的物料混合得包含预混合胶体凝胶的物料，固化，得包含双网络水凝胶的产品。3.一种权利要求1中所述水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将包含聚乙烯醇的物料加入包含明胶颗粒悬浮液的物料中，冷冻干燥，得包含双网格水凝胶预聚合粉末的物料，加入包含交联剂的水性溶液后混合的，固化，得包含双网络水凝胶的产品。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为47-145kda，浓度为0.01-0.2g/ml。5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述明胶颗粒尺寸为50nm～500μm；所述明胶颗粒表面电荷为-40～20mv；所述明胶颗粒的体积分数为6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述明胶颗粒和所述聚乙烯醇的质量比例为0.1～10；所述聚乙烯醇和所述交联剂的质量比例为0.5～100。7.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，述交联剂命名为tspba，所述交联剂具有如式1所示的结构式：剂具有如式1所示的结构式：8.一种权利要求1所述的水凝胶或一种权利要求2-7任一项方法制备的水凝胶在药物载体中的应用。9.一种权利要求1所述的水凝胶或一种权利要求2-7任一项方法制备的水凝胶在糖尿病骨缺损中的应用；优选地，所述应用为用于骨组织，软骨组织，肌肉、血管组织缺损的修复填充；优选地，所述水凝胶应用于组织缺损的修复填充时加入羟基磷灰石、磷酸钙、生物活性
陶瓷、生物活性玻璃、脱细胞骨基质中的至少一种。10.一种权利要求1所述的水凝胶或一种权利要求2-7任一项方法制备的水凝胶为止血制品中的应用；优选地，所述应用包括：用于体表组织、体腔内组织器官的有血创面的止血、防黏连、防感染、促进组织愈合和/或封闭伤口；优选地，所述水凝胶中加入生物活性物质、生物活性蛋白药物、活细胞颗粒、药物分子中的至少一种。

技术总结
本发明公开了一种糖尿病微环境响应性复合智能水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。本发明涉及的双网格水凝胶包括第一网络和第二网络，所述第二网络包封在所述第一网络中，所述第一网络与所述第二网络之间具有可逆的相互作用力；所述第一网络包括聚乙烯醇聚合物，所述第二网络包括明胶颗粒。本发明制备有明胶颗粒基组成的双网络水凝胶，水凝胶在聚乙烯醇网络未共价交联时，由于颗粒之间的可逆相互作用，凝胶具有剪切变稀，自修复的特点；进一步实现注射和打印性能之后，凝胶可按需通过聚乙烯醇的非共价键交联实现凝胶力学强度的增加。这一特性使其在微创植入材料和人工细胞外基质等领域具有广阔的应用前景。和人工细胞外基质等领域具有广阔的应用前景。


技术研发人员：陈陶 李帝泽 王华楠 季平 陈楷文
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2022/3/8