一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法与应用与流程

1.本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法与应用。


背景技术：

2.自新冠疫情在2019年底暴发以来，至今已在全球造成数亿人确诊，四百多万人死亡，新冠变异毒株的不断出现，导致疫情近期反弹严重，不断恶化，其传播速度、人群感染率不断增高，我国的医疗与生物安全正在受到前所未有的挑战。目前为止，我们对新冠病毒的认知仍然非常有限。病毒侵入人体的方式，感染的机制、有效检测方法、抗病毒药物、中和抗体的反应和疫苗的开发，都急需一种接近人体组织和微环境的疾病模型。根据《新型冠状病毒肺炎防控方案(第六版)》规定，每个新型冠状病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，必须采集急性期呼吸道标本进行核酸检测。
3.鼻腔是呼吸道病毒侵入人体的第一站，病毒感染早期，鼻粘膜病毒载量往往远高于口咽和下呼吸道。meinhardt等发现嗅粘膜是鼻腔内新冠载量最高的部位，病毒直接损伤持细胞和基底细胞造成感染者嗅觉障碍。hernes h对流感病毒的取样检测做了鼻拭子和咽拭子的对比，32名流感病毒病患取样检测的对比结果表明，鼻拭子取样样本的检出率比咽拭子的高54倍。这说明鼻粘膜也是新冠病毒直接损伤的第一个靶器官。鼻粘膜类器官含有纤毛细胞、分泌细胞和基底细胞等多种细胞成分，不但具备典型的假复层柱状纤毛上皮的组织学特征，能形成具有分泌功能的腺腔结构，还能观察到节律摆动的纤毛和粘液毯共同组成的粘液纤毛传输系统。更重要的是鼻粘膜类器官的纤毛细胞和杯状细胞ace2和tmprss2均表达较高，新冠病毒感染实验获得成功，是研究新冠病毒变异、感染和传播、免疫机制和抗病毒药物、疫苗开发的理想模型。但正常人类鼻粘膜，仅在鼻腔结构畸形，如泡状中鼻甲等手术时能够少量获取，来源严重受限，且存在伦理风险。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法与应用。本发明的技术方案为：
5.第一方面，本发明提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法，是通过鼻拭子采样后收集其中的鼻粘膜上皮细胞，将获得的鼻粘膜上皮细胞转移至基质胶混合均匀，然后加入鼻粘膜类器官培养基进行培养，获取鼻粘膜类器官。
6.进一步地，所述方法具体包括：
7.步骤1，将鼻拭子插入受检者鼻腔取样，然后将已采样鼻拭子放入组织保存液中在一定温度下保存；
8.步骤2，将保存的已采样鼻拭子上的组织收集，加入dtt溶液混匀后于37℃下恒温震荡，再经100μm滤网过滤得到细胞滤液，离心后保留细胞沉淀；
9.步骤3，在细胞沉淀中加入begm培养液重悬细胞，于37℃孵育，之后采用差速贴壁
法除去先贴壁的成纤维细胞后，收集鼻粘膜上皮细胞；
10.步骤4，采用适量的advanced dmem/f12培养基重悬鼻粘膜上皮细胞，加入基质胶混匀后将胶滴接种至培养皿，待胶滴凝固后于37℃恒温倒置一段时间，加入鼻粘膜类器官培养基于37℃、5％co2条件下培养6-12天，每间隔2-3天更换一次培养基。
11.优选地，所述鼻拭子为尼龙植绒鼻拭子。
12.可选地，所述组织保存液按照终浓度的组成为：5-10％(wt/wt)fbs，1000u/ml青链霉素，50-100ug/ml庆大霉素，2-3ug/ml二性霉素b，溶剂为dmem培养基。
13.进一步地，所述begm培养液中还含有50-200iu/ml青霉素和50-200iu/ml链霉素。
14.进一步地，所述基质胶在胶滴中的终浓度为5-8mg/ml。
15.优选地，所述鼻粘膜类器官培养基按照终浓度的组成包括：fbs，2％-5％；bmp4，2-20ng/ml；fgf10，50-200ng/ml；fgf7，2-20ng/ml；bfgf，20-50ng/ml；sb-431542，0.2-1μm；y-27632 2hcl，1-20μm；chir99021，1-20μm；all-trans retinoic acid，10-100nm；wnt-7a，20-200ng/ml；hepes，5-20mm；tgf-β1，5-20ng/ml；青霉素，100u/ml；链霉素，0.1mg/ml；以上各组分的浓度均以其在begm培养液中的浓度为准。
16.可选地，所述鼻粘膜类器官培养基还包括：nicotinamide，1-20mm；a83-01，0.2-1μm。
17.第二方面，本发明提供一种鼻粘膜类器官样本库的建立方法，包括：
18.采用上述方法获得鼻粘膜类器官；
19.将鼻粘膜类器官进行传代培养；
20.将传代培养的鼻粘膜类器官进行冻存建库。
21.本发明首次利用人鼻拭子无创取样成功培养得到鼻粘膜类器官，整个制备过程简单易行，成本低，具有良好的推广应用价值。并且方法的工艺操作中鼻粘膜类器官快速生长，并可长期稳定培养，形成的鼻粘膜类器官形态为空腔状，能在体外很好地保留上皮细胞的组织特征。本发明还提供了鼻粘膜类器官样本库的建立方法，为研究新冠病毒变异、感染和传播、免疫机制和抗病毒药物、疫苗开发提供了理想的鼻粘膜类器官模型。
附图说明
22.图1为本发明实施例1获得的鼻粘膜类器官的结构形态图。
23.图2为本发明实施例2获得的鼻粘膜类器官的结构形态图。
24.图3为本发明实施例3获得的鼻粘膜类器官的结构形态图。
25.图4为本发明实施例4获得的鼻粘膜类器官的结构形态图。
26.图5为本发明实施例5传代的鼻粘膜类器官的结构形态图。
27.图6为本发明实施例6传代的鼻粘膜类器官的结构形态图。
28.图7为本发明实施例7传代的鼻粘膜类器官的结构形态图。
29.图8为本发明实施例8传代的鼻粘膜类器官的结构形态图。
30.图9为本发明实施例1的类器官冻存与复苏后的结构形态图。
31.图10为本发明实施例2的类器官冻存与复苏后的结构形态图。
32.图11为本发明实施例3的类器官冻存与复苏后的结构形态图。
33.图12为本发明实施例4的类器官冻存与复苏后的结构形态图。
34.图13为本发明对比例1的细胞的结构形态图。
35.图14为本发明对比例2的鼻粘膜类器官的结构形态图。
具体实施方式
36.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
38.实施例1
39.本实施例提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法，具体包括以下步骤：
40.一、鼻拭子的采集方法
41.(1)一次性鼻采样拭子：选取尼龙植绒采样拭子，其采集样本的时间是3-5秒，远远快于棉拭子15-120秒的采集时间。直立的尼龙纤维像一把柔软的刷子，尼龙纤维间的毛细作用增强了水性样品的载量，且样本都集中在拭子的表层更容易洗脱。因此，尼龙植绒鼻咽拭子能够吸附和释放更多的细胞样本。
42.(2)将鼻采样拭子插入受试者鼻咽部取样。
43.二、鼻拭子的保存、运输及预处理
44.将已采样拭子放入预先加好组织保存液(含有10％fbs，1000u/ml青霉素，50ug/ml庆大霉素，2.5ug/ml二性霉素b的dmem培养基)的采样管中，拧紧采样管盖后贴好封口膜，放置在事先装有数个冰袋的标本运输箱里，运送至实验室。在生物安全柜中先用无菌医用棉签轻轻擦拭组织表面粘液，持拭子柄对内管壁反复挤压拭子头，然后反复吹打标本，目的是尽可能多的收集上皮细胞，然后再将组织转移至离心管，加入等量10mmol/ldtt溶液并于振荡器上混匀，37℃下恒温以50r/min转速震荡10min，尽可能去除粘液。经100μm滤网过滤得细胞滤液，1500r离心3min后，弃去上清液。加入配制好的begm(含100iu/ml青霉素，100iu/ml链霉素)培养液重悬细胞，转移入培养皿中，37℃孵育1h。采用差速贴壁法除去先贴壁的成纤维细胞后，即可收集鼻粘膜上皮细胞，利用细胞计数仪测定总细胞数。
45.三、鼻拭子取样类器官的培养
46.全程低温冰上操作，使用适量的advanced dmem/f12培养基重悬细胞沉淀，并使用过夜溶解的基质胶(终浓度为5.5mg/ml)混匀细胞沉淀，此操作应在冰上进行，操作过程避免产生气泡。使用200μl移液枪(200μl枪头已于4℃预冷)将胶滴接种至60mm培养皿中，每个胶滴大小约35μl。将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃恒温孵箱，倒置45min。加入已预热好的鼻粘膜类器官培养基，约4ml。镜下观察，拍照，放入37℃恒温孵箱，每间隔2-3天更换一次培养基，培养8天。
47.所采用的类器官培养基的成分组成为：fbs，3％；bmp4，10ng/ml；fgf10，100ng/ml；fgf7，12ng/ml；bfgf，35ng/ml；sb-431542，0.5μm；y-276322hcl，10μm；chir99021，10μm；all-trans retinoic acid，60nm；wnt-7a，120ng/ml；hepes，15mm；tgf-β1，10ng/ml；青霉素，100u/ml；链霉素，0.1mg/ml；nicotinamide，10mm；a83-01，0.5μm；以上各组分的浓度均
以其在begm培养液中的浓度为准。
48.本实施例获得的类器官如图1所示，细胞结构清晰完整，呈圆的腔体状，形态均匀。
49.实施例2
50.本实施例提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法，具体操作方法与实施例1的区别在于：类器官培养基的成分组成为：fbs，5％；bmp4，15ng/ml；fgf10，200ng/ml；fgf7，2ng/ml；bfgf，25ng/ml；sb-431542，1μm；y-27632 2hcl，20μm；chir99021，3μm；all-trans retinoic acid，20nm；wnt-7a，200ng/ml；hepes，5mm；tgf-β1，20ng/ml；青霉素，100u/ml；链霉素，0.1mg/ml；以上各组分的浓度均以其在begm培养液中的浓度为准。
51.本实施例获得的类器官如图2所示，细胞结构清晰完整，形态均匀。
52.实施例3
53.本实施例提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法，具体操作方法与实施例2的区别在于：类器官培养基的成分组成为：fbs，2％；bmp4，5ng/ml；fgf10，50ng/ml；fgf7，20ng/ml；bfgf，40ng/ml；sb-431542，0.2μm；y-27632 2hcl，1μm；chir99021，20μm；all-trans retinoic acid，100nm；wnt-7a，20ng/ml；hepes，20mm；tgf-β1，5ng/ml；青霉素，100u/ml；链霉素，0.1mg/ml；以上各组分的浓度均以其在begm培养液中的浓度为准。
54.本实施例获得的类器官如图3所示，细胞结构清晰完整，形态均匀。
55.实施例4
56.本实施例提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法，具体操作方法与实施例2的区别在于：类器官培养基的成分组成为：fbs，4％；bmp4，2ng/ml；fgf10，200ng/ml；fgf7，15ng/ml；bfgf，50ng/ml；sb-431542，0.5μm；y-27632 2hcl，5μm；chir99021，18μm；all-trans retinoic acid，80nm；wnt-7a，30ng/ml；hepes，10mm；tgf-β1，8ng/ml；青霉素，100u/ml；链霉素，0.1mg/ml；以上各组分的浓度均以其在begm培养液中的浓度为准。
57.本实施例获得的类器官如图4所示，细胞结构清晰完整，形态均匀。
58.实施例5
59.实施例1的类器官传代
60.将培养皿中的培养基吸出，加入hbss轻轻润洗胶滴，使用tryple轻轻将胶滴吹散，并置于co2培养箱内消化3-5min，待类器官消化至均一的直径约为20-30μm细胞团时，加入hbss终止消化，1500rpm，离心3min弃上清收获细胞沉淀，加入100μl培养基重悬后加入120μl matrigel重新接种培养类器官。
61.获得的类器官类器官活性较好，多数呈圆的腔体状，图5给出了单一类器官的结构形态图，可以很清楚地观察到细胞结构清晰完整，形态均匀。
62.实施例6
63.实施例2的类器官传代
64.操作同实施例5，获得的类器官类器官活性较好，多数呈圆的腔体状，图6给出了单一类器官的结构形态图，可以很清楚地观察到细胞结构清晰完整，形态均匀。
65.实施例7
66.实施例3的类器官传代
67.操作同实施例5，获得的类器官类器官活性较好，多数呈圆的腔体状，图7给出了单
一类器官的结构形态图，可以很清楚地观察到细胞结构清晰完整，形态均匀。
68.实施例8
69.实施例4的类器官传代
70.操作同实施例5，获得的类器官类器官活性较好，多数呈圆的腔体状，图8给出了单一类器官的结构形态图，可以很清楚地观察到细胞结构清晰完整，形态均匀。
71.实施例9
72.实施例5获得的类器官冻存与复苏
73.将传代培养后的类器官消化至均一的直径约为20-30μm细胞团时，加入5ml hbss终止消化，将其转移至15ml离心管中；1500rpm，3min，离心弃上清收获细胞沉淀，用1ml的冻存液(fbs:dmso＝9:1)重悬细胞沉淀并置于冻存管中，并于管壁标记相关信息，程序降温后，长期保存于液氮中。可建立鼻粘膜类器官样本库，为研究新冠病毒变异、感染和传播、免疫机制和抗病毒药物、疫苗开发提供了理想的鼻粘膜类器官模型。
74.将准备复苏的类器官37℃快速溶解，离心收获类器官后，使其重新与基质胶混匀接种在培养板上，观察类器官的生长状态。
75.培养7天后获得的类器官如图9所示，类器官多呈薄壁空泡状，活性较好，直径较大，形态较为规则且数量仍然较多。
76.实施例10
77.实施例6获得的类器官冻存与复苏
78.操作同实施例9，获得的类器官如图10所示，类器官活性较好，多数呈圆的腔体状或实心球状，数量较多，形态较为规则。
79.实施例11
80.实施例7获得的类器官冻存与复苏
81.操作同实施例9，获得的类器官如图11所示，类器官多呈薄壁空泡状，活性较好，直径较大，形态较为规则。
82.实施例12
83.实施例8获得的类器官冻存与复苏
84.操作同实施例9，获得的类器官如图12所示，类器官活性较好，多数呈圆的腔体状，数量较多，形态较为规则。
85.对比例1
86.本对比例提供一种通过手术切除获取的组织培养鼻粘膜类器官的方法，具体操作如下：
87.一、手术切除的鼻息肉组织的保存、运输及预处理
88.将手术切除的鼻息肉组织用dmem保存，使用冰袋2-8℃运输至实验室，然后用手术剪刀将组织剪碎至1立方毫米左右。收集剪碎的组织至离心管，加入5ml iv型胶原酶，37℃消化处理30分钟。加入dmem终止消化，然后离心收集细胞。
89.二、组织类器官的培养
90.采用现有常规市售完全培养基(dmem+10％fbs)，其它同实施例1，结果鼻粘膜细胞在培养过程中细胞生长缓慢且容易附着在培养皿底部，与一般细胞培养结果类似，无法形成有球形结构的、多细胞组份的类器官结构，如图13所示，图(a)和(b)分别是培养5天和8天
的图。
91.对比例1的过程是目前研究者普遍进行的研究方向，通过手术切除的组织进行鼻粘膜类器官的培养，一方面这种操作方式只能在进行手术时才能获取到培养组织，来源十分受限，存在伦理风险，另一方面采用现有的常规通用培养基很难获得鼻粘膜类器官，因而必须要找寻新的途径来开发鼻粘膜类器官。
92.对比例2
93.本对比例提供另一种通过手术切除获取的组织培养鼻粘膜类器官的方法，与对比例1的区别在于：采用本发明的鼻粘膜类器官培养基进行培养。如图14所示，可以成功获得类器官，并且细胞结构清晰完整，形态均匀。显然，本发明的鼻粘膜类器官培养基同样可以适用于鼻部手术切除组织的鼻粘膜类器官培养。
94.综上所述，一方面，本发明的样本与手术组织样本来源相比，鼻拭子操作相对简单，且取样时能在鼻部长期停留，只要患者耐受性好，不需要麻醉就能采集样品。相比其它手术组织来源的呼吸道样本，鼻拭子采集无创且不涉及伦理问题，且样本来源丰富，解决了类器官培养中最大瓶颈之人体组织来源问题。另一方面，本发明首次利用人鼻拭子无创取样成功培养得到鼻粘膜类器官，并可长期稳定培养，形成的鼻粘膜类器官形态为空腔状，能在体外很好地保留上皮细胞的组织特征。再者，本发明还提供了鼻粘膜类器官样本库的建立方法，为研究新冠病毒变异、感染和传播、免疫机制和抗病毒药物、疫苗开发提供了理想的鼻粘膜类器官模型。
95.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：是通过鼻拭子采样后收集其中的鼻粘膜上皮细胞，将获得的鼻粘膜上皮细胞转移至基质胶混合均匀，然后加入鼻粘膜类器官培养基进行培养，获取鼻粘膜类器官。2.根据权利要求1所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述方法具体包括：步骤1，将鼻拭子插入受检者鼻腔取样，然后将已采样鼻拭子放入组织保存液中在一定温度下保存；步骤2，将保存的已采样鼻拭子上的组织收集，加入dtt溶液混匀后于37℃下恒温震荡，再经100μm滤网过滤得到细胞滤液，离心后保留细胞沉淀；步骤3，在细胞沉淀中加入begm培养液重悬细胞，于37℃孵育，之后采用差速贴壁法除去先贴壁的成纤维细胞后，收集鼻粘膜上皮细胞；步骤4，采用适量的advanced dmem/f12培养基重悬鼻粘膜上皮细胞，加入基质胶混匀后将胶滴接种至培养皿，待胶滴凝固后于37℃恒温倒置一段时间，加入鼻粘膜类器官培养基于37℃、5％co2条件下培养6-12天，每间隔2-3天更换一次培养基。3.根据权利要求1或2所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述鼻拭子为尼龙植绒鼻拭子。4.根据权利要求2所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述组织保存液按照终浓度的组成为：5-10％(wt/wt)fbs，1000u/ml青链霉素，50-100ug/ml庆大霉素，2-3ug/ml二性霉素b，溶剂为dmem培养基。5.根据权利要求2所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述begm培养液中还含有50-200iu/ml青霉素和50-200iu/ml链霉素。6.根据权利要求2所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述基质胶在胶滴中的终浓度为5-8mg/ml。7.根据权利要求1或2所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述鼻粘膜类器官培养基按照终浓度的组成包括：fbs，2％-5％；bmp4，2-20ng/ml；fgf10，50-200ng/ml；fgf7，2-20ng/ml；bfgf，20-50ng/ml；sb-431542，0.2-1μm；y-27632 2hcl，1-20μm；chir99021，1-20μm；all-trans retinoic acid，10-100nm；wnt-7a，20-200ng/ml；hepes，5-20mm；tgf-β1，5-20ng/ml；青霉素，100u/ml；链霉素，0.1mg/ml；以上各组分的浓度均以其在begm培养液中的浓度为准。8.根据权利要求7所述的一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法，其特征在于：所述鼻粘膜类器官培养基还包括：nicotinamide，1-20mm；a83-01，0.2-1μm。9.一种鼻粘膜类器官样本库的建立方法，其特征在于：包括：采用权利要求1～8任意一项所述的方法获得鼻粘膜类器官；将鼻粘膜类器官进行传代培养；将传代培养的鼻粘膜类器官进行冻存建库。

技术总结
本发明提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法与应用，该培养鼻粘膜类器官的方法是通过鼻拭子采样后收集其中的鼻粘膜上皮细胞，将获得的鼻粘膜上皮细胞转移至基质胶混合病进行培养获取鼻粘膜类器官。本发明提供一种鼻粘膜类器官样本库的建立方法，包括：采用上述方法获得鼻粘膜类器官；将鼻粘膜类器官进行传代培养；将传代培养的鼻粘膜类器官进行冻存建库。本发明首次利用人鼻拭子无创取样成功培养得到鼻粘膜类器官，整个制备过程简单易行，成本低，具有良好的推广应用价值。并且方法的工艺操作中鼻粘膜类器官快速生长，并可长期稳定培养，形成的鼻粘膜类器官形态为空腔状，能在体外很好地保留上皮细胞的组织特征。征。征。


技术研发人员：李刚 于言 汪珂 崔忠林 李君朗 张涵清 王麓淇
受保护的技术使用者：创芯国际生物科技（广州）有限公司
技术研发日：2021.09.28
技术公布日：2022/3/8