一种秀珍菇菌株黔秀3号及其应用的制作方法

1.本发明属于食用菌领域，具体涉及一种秀珍菇菌株，还涉及该秀珍菇菌株的用途。


背景技术：

2.秀珍菇(学名：肺形侧耳。别名：凤尾菇、凤尾侧耳、印度平菇或喜马拉雅平菇等；其拉丁名为：pleurotus pulmonarius)属于侧耳科侧耳属肺形侧耳种。秀珍菇外形小巧秀美，不仅质地细嫩，味道鲜美，而且营养丰富，含有丰富的蛋白质、糖类、不饱和脂肪酸、维生素、叶酸和多种微量元素等；秀珍菇的蛋白质含量比香菇、草菇都高，其子实体中含有18种氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸含量较高。另外，秀珍菇的蛋白含量高、低脂肪酸的特性，可作为减肥保健食品；其含有的多糖成分具有抗肿瘤功能，还能提高人体免疫力。故秀珍菇被视为是一种营养价值极高的珍稀食用菌，有“菇中极品”的美誉。
3.目前，秀珍菇生产中存在的问题：一是秀珍菇品种较少，国家认定的秀珍菇品种仅有2个，二是栽培周期长。难以满足人们高水平生活的消费需求。
4.我国从南到北的原始森林中具有丰富的野生食用菌资源，其中包括秀珍菇资源。对野生的秀珍菇资源进行开发，不仅可以丰富人们的餐桌，而且还可以利用食用菌药食兼用的特性，开发出附加值更高的食品、饮料和保健品等，从而大大提高菇农的收入和出口创汇能力。


技术实现要素：

5.为了解决目前生产中秀珍菇品种少，生产周期长等问题，本发明目的在于提供一种秀珍菇菌株。
6.本发明另一目的在于提供上述秀珍菇菌株的用途。
7.本发明的目的通过如下技术方案实现：
8.本发明一种秀珍菇(pleurotus pulmonarius)菌株黔秀3号，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，其保藏编号为cctcc no:m20211210，保藏日期为2021年9月24日。
9.本发明还提供上述秀珍菇菌株黔秀3号在食品或保健品中的应用。
10.本发明还提供一种食品或保健品，所述的食品或保健品中含有上述菌株黔秀3号或黔秀3号的提取物。
11.本发明还提供上述菌株黔秀3号在饮料中的应用。
12.本发明还提供一种饮料，所述的饮料中含有上述菌株黔秀3号或黔秀3号的提取物。
13.上述菌株黔秀3号在制备提高人体免疫力药物上的应用。
14.本发明还提供一种秀珍菇的基因工程菌株，所述的秀珍菇基因工程菌株的出发菌株为上述菌株黔秀3号。
15.本发明还提供一种用于鉴定上述菌株黔秀3号的分子标记，所述的分子标记是长
度为568bp的dna分子片段；所述的dna分子片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。
16.上述分子标记，其所述的分子标记的pcr扩增引物为通用引物its1和its4；所述的引物序列如下：
17.its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；
18.its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。
19.上述分子标记在菌株黔秀3号真实性或侵权鉴定中的应用。
20.本发明还提供了上述菌株黔秀3号的栽培方法，包括如下步骤：
21.(1)母种培养：将黔秀3号菌种接种于母种培养基上，在25℃、空气相对湿度60～75％、避光条件下培养8天，得黔秀3号母种；
22.(2)原种培养：按照1:30的质量比将步骤(1)中所得的黔秀3号母种接种于原种培养基上，在25℃、空气相对湿度60～75％，避光条件下培养25～30天，得黔秀3号原种；
23.(3)栽培种培养：按照1:30的质量比将步骤(2)中所得的黔秀3号原种接种到栽培培养基上，在25℃、空气相对湿度60～75％，避光条件下培养25～30天，得黔秀3号栽培种；
24.(4)栽培培养料接种：在无菌环境中，取出菌袋中心的塑料棒，按照1:30的质量比将步骤(3)中所得的黔秀3号栽培种接种到栽培培养料中心的棒孔中，再用套环和棉塞封口；在25℃、空气相对湿度60～75％，避光条件下培养30～35天，菌丝长满培养料；
25.(5)搔菌：将菌袋袋口打开，再用灭菌后的小铲刀将表面的老菌皮挖去，露出新鲜菌丝；
26.(6)低温刺激：将菌袋置于4℃环境中低温刺激12小时，低温刺激促进出菇整齐；
27.(7)出菇管理和采收：出现原基后，在温度23℃、空气相对湿度80～90％、散射光500～600lx、通风良好条件下培养6～8天；当子实体菌盖平展，孢子未弹射时，采收子实体。
28.上述栽培方法步骤(1)中所述的母种培养基的组成成分及其重量比为：去皮马铃薯200g取汁，葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，混匀后用纯净水定容至1000ml。
29.所述的母种培养基的制备方法：将马铃薯200g去皮切成1.5cm左右方块，放入800mlro水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，再加入葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，混匀后用纯净水定容至1000ml，121℃灭菌30min；倒入直径9cm平板，备用。
30.上述栽培方法步骤(2)中所述原种培养基或步骤(3)中所述栽培种培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，培养基含水量为60～65％。
31.所述步骤(2)中原种培养基或步骤(3)中栽培种培养基的制备方法：按步骤比例取玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，混合均匀，然后按照比例加水，搅拌均匀，装入聚丙烯塑料袋(规格15cm
×
33cm
×
0.005cm)，121℃灭菌2小时，备用。
32.上述方法步骤(4)中所述的栽培培养料的组成成分及其重量百分比为：玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，培养料中含水量60～65％。
33.所述步骤(4)中栽培培养料的制备方法：按照重量百分比比例将玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，混合均匀，然后按照比例加水，搅拌
均匀。栽培袋采用聚丙烯塑料袋(规格15cm
×
33cm
×
0.005cm)，将混匀的栽培料装入袋中，袋口中心插入13cm空心塑料棒，3.5cm套环配套棉塞封口，121℃灭菌2小时，再冷却至常温；备用。
34.本发明具有的优点和有益技术效果：(1)本发明菌株黔秀3号的菌盖淡褐色，朵形饱满，商品价值高，为消费者提供了一种新的秀珍菇类型。(2)本发明黔秀3号的栽培周期短。其从栽培培养料接种到出菇采收的周期仅为55～60天，而现有的秀珍菇品种：凤尾菇、京秀1号、秀03、夏秀004、中农秀珍(国品认菌2008027)、秀珍菇5号(国品认菌2008026)”的栽培周期分别为60～80天、60～70天、70～90天、70～80、70～90天、70～90天，黔秀3号比现有秀珍菇主栽品种生产周期至少缩短15～20天。(3)本发明黔秀3号的产量高，其每袋平均产量为352.3g，经济效益高。(4)本发明分子标记对黔秀3号特异性强，检测结果准确、可靠；检测方法简单、速度快；适于在黔秀3号的真实性或侵权鉴定中进行现场或实时检测。
35.生物保藏：本发明秀珍菇(pleurotus pulmonarius)菌株黔秀3号是本发明人在贵州省贵阳市花溪区阿哈湖水库地区采集，并经筛选、培育而成；该菌株已于保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：地址中国武汉武汉大学；其保藏编号为cctcc no:m20211210。
附图说明:
36.图1.本发明菌株黔秀3号的子实体照片.
37.图2.本发明菌株黔秀3号的系统发育树图。
38.图3.采用rapd引物s43扩增的不同秀珍菇菌种的papd电泳图谱；其中m为dna分子量标准；1为黔秀3号；2为凤尾菇；3为京秀1号；4为秀03；5为夏秀004。
具体实施方式
39.以下通过实例对本发明作进一步说明，但是对本发明不构成任何限制。
40.实施例1本发明菌株黔秀3号的采集、分离驯化过程
41.2019年8月，本发明人在贵州省贵阳市花溪区阿哈湖水库地区，发现并采集了一株野生的类似秀珍菇的子实体。将该子实体进行组织分离，得到菌丝(菌种)；将组织分离后所得菌种进行栽培出菇试验；再对朵型良好的子实体进行组织分离，接种于pda培养基上进行培养，筛选菌丝生长速度快、长势均匀的菌株继续栽培驯化，经过数代培养，筛选出一个遗传性状稳定、出菇周期短的秀珍菇菌株，命名为：黔秀3号。
42.实施例2本发明菌株黔秀3号的分类鉴定
43.(1)黔秀3号菌株的形态学鉴定：
44.子实体丛生，菌盖淡褐色呈扇形，菌盖截面平整，中部稍凹，菌盖直径4.3～10.2cm，平均7.5cm；菌盖厚度适中，0.7～1.1cm，平均0.8cm；菌柄长0.9～2.1cm；菌褶无网纹，菌褶延生至菌柄顶端；子实体质地紧密。根据《中国大型菌物资源图鉴》(李玉主编，中原农民出版社，2015年出版)第990页有关秀珍菇的照片及相应特征描述，黔秀3号与秀珍菇(肺形侧耳)的形态特征一致，初步确定黔秀3号在分类上属于侧耳科侧耳属肺型侧耳种(pleurotus pulmonarius)。
45.(2)黔秀3号菌株的分子生物学分类鉴定
46.采用新型植物基因组dna提取试剂盒cw0531(北京康为世纪公司)提取黔秀3号菌株的基因组dna，以its1和its4为引物进行pcr扩增。所述的its1和its4引物序列如下：
47.its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；
48.its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。
49.its-pcr反应体系为：总体积20μl：20-50ng/μl的dna模板1μl，10
×
buffer(with mg2+)2μl，2.5mm dntp 0.5μl，5u/μl dna聚合酶0.2μl，0.2μm引物各0.5μl，加双蒸水至20μl。its-pcr反应条件为：预变性94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃75s，30个循环；72℃延伸10min。将所得扩增产物进行凝胶电泳，结果获得长度为568bp的dna分子片段。将所得dna分子片段送交上海生工进行测序，该dna分子片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。将该核苷酸序列在genebank上进行blast比对，并构建系统发育树图。结果本发明菌株黔秀3号菌株与秀珍菇(pleurotus pulmonarius)的相似度最高，可达99.62％，说明本发明菌株黔秀3号在分类上属于侧耳属肺形侧耳种(pleurotus pulmonarius)。从系统发育树图(见图2)也可得出相同结论。此外，从blast对比可知，本发明菌株黔秀3号与任何其他的秀珍菇菌株都不相同，是一种新的秀珍菇菌株。
50.实施例3本发明菌株黔秀3号与其他秀珍菇菌种的papd对比分析试验按照如下方法进行：
51.采用植物基因组dna提取试剂盒cw0531(北京康为世纪公司)分别提取黔秀3号、凤尾菇(北京吉蕈园选育出的淡灰色秀珍菇)、京秀1号(北京吉蕈园选育出的淡褐色秀珍菇)、秀03(黔东南创健台江的灰色秀珍菇)，夏秀004(江苏天龙菌业选育出的褐色秀珍菇)菌株的基因组dna，选取20条rapd引物(见表1)进行pcr扩增。
52.表1 rapd随机引物序列
[0053][0054][0055]
rapd-pcr扩增反应体系为：总体积20μl：20-50ng/μl的dna模板1μl，10
×
buffer(with mg
2+
)2μl，2.5mm dntp 0.5μl，5u/μl easytaq酶0.2μl，0.2μm引物1μl，加双蒸水至20μl。rapd-pcr反应条件为：预变性95℃5min；94℃45s，36℃1min，72℃2min，35个循环；72℃
延伸10min。
[0056]
从以s43为引物扩增所得的rapd电泳图谱(见图3)可以看出，黔秀3号相对于凤尾菇、京秀1号、秀03、夏秀004均存在具有明显差异的特异性条带，说明本发明菌株黔秀3号与现有的凤尾菇、京秀1号、秀03、夏秀004等秀珍菇菌株都不同，是一种新的秀珍菇(pleurotus pulmonarius)菌株。
[0057]
实施例4本发明菌株黔秀3号的栽培试验
[0058]
按照如下步骤进行：
[0059]
(1)母种培养：将黔秀3号菌种(本菌种已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20211210)接种于母种培养基上，在25℃、空气相对湿度70％、避光条件下培养8天，得黔秀3号母种；母种培养基的制备方法：将200g去皮马铃薯切成1.5cm左右方块，放入800ml水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，加入葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，混匀后定容至1000ml，121℃灭菌30min；倒入直径90mm平板备用。
[0060]
(2)原种培养：按照1:30的质量比将步骤(1)中黔秀3号母种接种于原种培养基上，在25℃、空气相对湿度70％，避光条件下培养30天，得黔秀3号原种。所述原种培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米芯40％，棉籽壳40％，麦麸15％，豆粨2％，石灰2％，轻质碳酸钙1％，培养基含水量65％。所述原种培养基的按照如下方法制备：按照重量百分比将各组分混合均匀，然后按比例加入水，混合均匀，即为原种培养基。将其装入聚丙烯塑料袋(15cm
×
33cm
×
0.005cm)，121℃灭菌2小时。
[0061]
(3)栽培种培养：按照1:30的质量比将步骤(2)中所得黔秀3号原种接种到栽培培养料上。在25℃、空气相对湿度70％，避光条件下培养30天，得黔秀3号栽培种。其中栽培培养料的配制，装袋和灭菌方式与原种培养基相同，但是在在装袋时在袋口中心插入13cm空心塑料棒，3.5cm套环配套棉塞封口，121℃灭菌2小时备用。
[0062]
(4)栽培培养料接种：将按照步骤(3)制备的栽培培养料，灭菌后充分冷却至常温。在无菌环境中，取出菌袋中心的塑料棒，按照1:30的质量比将步骤(3)中所得黔秀3号栽培种接种到栽培培养料中心的棒孔内，再用套环和棉塞封口，在25℃、空气相对湿度70％，避光条件下培养35天。
[0063]
(5)搔菌：将步骤(4)的菌袋袋口打开，用灭菌后的小铲刀将表面的老菌皮挖去，露出新鲜菌丝。
[0064]
(6)低温刺激：将菌袋置于4℃环境中低温刺激12小时，低温刺激促进菇蕾整齐。
[0065]
(7)出菇管理和采收：出现原基后，在温度23℃、空气相对湿度85％、散射光500lx，通风良好条件下培养8天；当子实体菌盖平展，菌盖边缘平伸，为最适宜采收期，可采收子实体。采收时左手按住栽培袋，右手握住菌柄基部，轻轻旋钮即可完成采摘，采摘后用保鲜盒封装。
[0066]
将采收后的秀珍菇黔秀3号进行肉眼观察、称重，并计算其栽培周期。
[0067]
结果本发明黔秀3号的子实体(见图1)质地紧密，口感清脆，菌盖淡褐色，朵形饱满，商品价值高；其次，黔秀3号从栽培培养料接种到出菇采收的周期为55～60天，而现有主栽秀珍菇品种凤尾菇、京秀1号、秀03、夏秀004、中农秀珍(国品认菌2008027)、秀珍菇5号(国品认菌2008026)”等秀珍菇的相应栽培周期分别为60～80天、60～70天、70～90天、70～
80、70～90天、70～90天，黔秀3号比现有秀珍菇主栽品种栽培周期至少缩短10～20天。此外，本发明黔秀3号农业式栽培每袋平均产量为352.3g，产量高，经济效益高。

技术特征：
1.一种秀珍菇(pleurotus pulmonarius)菌株黔秀3号，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no:m20211210。2.权利要求1所述的菌株黔秀3号在食品或保健品中的应用。3.一种食品或保健品，所述的食品或保健品中含有权利要求1所述的菌株黔秀3号或黔秀3号的提取物。4.权利要求1所述的菌株黔秀3号在饮料中的应用。5.一种饮料，所述的饮料中含有权利要求1所述的菌株黔秀3号或黔秀3号的提取物。6.权利要求1所述的菌株黔秀3号在制备提高人体免疫力药物上的应用。7.一种秀珍菇基因工程菌株，所述的基因工程菌株的出发菌株为权利要求1所述的菌株黔秀3号。8.一种用于鉴定权利要求1所述菌株黔秀3号的分子标记，其特征在于，所述的分子标记是长度为568bp的dna分子片段；所述的dna分子片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。9.根据权利要求7所述的分子标记，其特征在于所述的分子标记的pcr扩增引物为通用引物its1和its4；所述的引物序列如下：its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。10.权利要求8或9所述的分子标记在菌株黔秀3号真实性或侵权鉴定中的应用。

技术总结
本发明属于食用菌领域，具体公开了一种秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)菌株黔秀3号，其保藏编号为CCTCC NO:M20211210。本发明还公开了该菌株在食品、保健品或饮料等方面的用途。本发明菌株黔秀3号的菌盖淡褐色，朵形饱满，商品价值高；其次，栽培周期短，黔秀3号比现有秀珍菇主栽品种生产周期至少缩短了15～20天；此外，黔秀3号产量高，其每袋平均产量为352.3g，经济效益高。本发明还公开了对该菌株具有特异性的分子标记，用该分子标记鉴定黔秀3号，结果准确、可靠；检测方法简单、速度快；适于在黔秀3号的真实性或侵权鉴定中进行现场或实时检测。号的真实性或侵权鉴定中进行现场或实时检测。


技术研发人员：王晓敏 张邦喜 杜慕云 陈旭 朱森林 杨珍 陈波 张钦语 唐玲 杨仁德
受保护的技术使用者：贵州省土壤肥料研究所（贵州省生态农业工程技术研究中心）（贵州省农业资源与环境研究所）
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/3/7