一种蛹虫草高产菌株及构建方法

本发明涉及菌种改造，更具体的说是涉及一种蛹虫草高产菌株及构建方法。

背景技术：

1、蛹虫草，又称为虫草、北冬虫夏草，是一种珍稀食药用真菌，具有较高的营养价值和保健功能，已成为我国及东南亚地区极其重要的食药用真菌。蛹虫草含有丰富的次级代谢产物，包括虫草素、虫草酸、类胡萝卜素、麦角甾醇、喷司他丁等，具有抗病毒、抗癌、免疫调节、降血糖等多种作用。

2、蛹虫草虽已实现工厂化栽培，但在生产过程中仍会出现产量低等问题。随着蛹虫草子实体发育机制的深入研究，蛹虫草疏水蛋白基因家族被证实参与调控蛹虫草子实体生长发育。其中，ⅰ型疏水蛋白编码基因cmhyd4缺失后，蛹虫草原基和子实体可正常发育，且单瓶子实体数目和生物学转化率显著高于野生型菌株。但所得菌株为农杆菌转化所得，抗性标签已保留在蛹虫草基因组中，存在食品安全问题，不符合《农业用基因编辑植物评审细则(试行)》要求。

3、因此，提供一种符合食品安全的蛹虫草高产菌株及构建方法与应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、蛹虫草crispr/cas9基因高效编辑系统于2022年创立，可实现基因的精准编辑和敲除，该技术具有目的性强、周期短且高效简便。此外，载体元件ama1(丝状真菌自主复制核苷酸序列)能够使载体独立于染色体外复制，而不插入到真菌基因组中，并且转化体在没有抗生素选择压力的条件下，载体在转化子传代过程中很容易丢失，从而实现真正无外源基因插入的无痕编辑，避免出现转基因食品安全问题。而在此之前，蛹虫草基因的敲除主要通过农杆菌转化，将抗性基因与靶标基因进行同源替换来实现靶标基因的缺失，所得菌株基因组中保留抗性标签，存在很大的食品安全隐患。

2、有鉴于此，本发明提供了靶标基因为蛹虫草负调控子实体发育基因cmhyd4，然后利用游离型crispr/cas9基因编辑技术无痕敲除cmhyd4，从而创制蛹虫草高产菌株，由此获得本发明。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种蛹虫草高产菌株的构建方法，所述构建方法为通过crispr/cas9无痕敲除蛹虫草ⅰ型疏水蛋白编码基因cmhyd4，所述基因核苷酸序列如seq id no:1所示。

5、进一步的，包括以下步骤：

6、s1、确定敲除靶基因ⅰ型疏水蛋白编码基因cmhyd4的sgrna，并构建crispr/cas9敲除靶基因cmhyd4的sgrna中间载体；

7、s2、确定并扩增敲除靶基因cmhyd4的上、下游同源臂核苷酸序列；

8、s3、确定并扩增所述上、下游同源臂核苷酸序列连接至s1 crispr/cas9敲除靶基因cmhyd4的sgrna中间载体；

9、s4、将s3所得载体转化到蛹虫草原生质体中，获得所述靶基因敲除的转化体；

10、s5、在基因组dna水平，从s4获得的靶基因cmhyd4缺失的转化体，即为阳性转化体；

11、s6、在cdna水平，验证s4获得的阳性转化体，确认阳性转化体所述的靶基因表达水平；

12、s7、对s6中获得的阳性转化体进行传代培养，获得载体丢失的无外源基因插入、所述靶基因cmhyd4缺失的蛹虫草菌株；

13、s8、用s7所获得的蛹虫草菌株，进行小麦栽培出草试验，统计成熟子实体单瓶子实体数目、高度和生物学转化率，以验证s7获得菌株是否为高产菌株。

14、进一步的，步骤s1所述的crispr/cas9敲除cmhyd4的sgrna的核苷酸序列如seq idno:2所示。

15、sgrna(single guide rna)是crispr/cas9基因敲除系统中重要组成部分，可以和cas9酶结合，引导cas9酶靶向切割基因组dna。在本发明的实施方案中，sgrna核苷酸序列为基因cmhyd4碱基，即5’-n20-ngg-3’，其中ngg表示pam核苷酸序列，n20代表20bp碱基的识别核苷酸序列。

16、本发明的实施方案中，可以通过扩增sgrna表达盒(seq id no:5)，将其连接至载体例如pama1-cas9-hyg载体上，来构建cmhyd4敲除的中间载体，例如pama1-cas9-sgrnacmhyd4。

17、进一步的，步骤s2敲除的cmhyd4所述上游同源臂核苷酸序列如seq id no:3所示；所述下游同源臂核苷酸序列如seq id no:4所示。

18、本发明的实施方案中，将cmhyd4上下游同源臂核苷酸序列连接至cmhyd4敲除的中间载体，构建靶基因的敲除载体。

19、本发明的实施方案中，通常将靶基因敲除的载体转化到蛹虫草原生质体中，来获得靶标基因敲除的转化体。其中转化方法为peg介导。

20、本发明的实施方案中，通过crispr/cas9基因编辑技术无痕敲除cmhyd4创制蛹虫草高产菌株的方法还包括：s6、在基因组dna水平，从s5获得的转化体中鉴定获得靶基因cmhyd4缺失的转化体，即阳性转化体；s7、在cdna水平，验证s6获得的阳性转化体，确认阳性转化体中所述靶基因cmhyd4不表达；s8、对s7中获得的阳性转化体进行传代培养，获得载体丢失的无外源基因插入且靶基因cmhyd4缺失的蛹虫草菌株，将该菌株和原始菌株进行基因组重测序，再次确认该菌株无载体序列残留、无外源基因插入，且靶基因cmhyd4缺失；s9、对s8种获得的阳性转化体进行出草试验，以验证所述的蛹虫草菌株是否为高产菌株。

21、一种蛹虫草高产菌株，所述菌株现已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：蛹虫草(cordyceps militaris)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为cgmcc no.41360，保藏日期为2024年7月8日。

22、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

23、本发明通过crispr/cas9基因编辑技术在蛹虫草基因组中敲除负调控蛹虫草子实体发育疏水蛋白基因cmhyd4，从而创制蛹虫草高产菌株，既能提高蛹虫草的产量，又能避免转基因元件整合至基因组引起的食品安全性问题，为蛹虫草高产菌株选育提供了思路和实验依据，且与传统育种方式相比，本发明育种周期短，且实现了定向育种。

技术特征：

1.一种蛹虫草高产菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为通过crispr/cas9无痕敲除蛹虫草ⅰ型疏水蛋白编码基因cmhyd4，所述基因核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草高产菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种蛹虫草高产菌株的构建方法，其特征在于，步骤s1所述的crispr/cas9敲除cmhyd4的sgrna的核苷酸序列如seq id no:2所示。

4.根据权利要求2所述的一种蛹虫草高产菌株的构建方法，其特征在于，，步骤s2敲除的cmhyd4所述上游同源臂核苷酸序列如seq id no:3所示；所述下游同源臂核苷酸序列如seq id no:4所示。

5.一种蛹虫草高产菌株，其特征在于，所述菌株现已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.41360，保藏日期为2024年7月8日。

技术总结
本发明公开了一种蛹虫草高产菌株及构建方法，涉及菌种改造技术领域。所述构建方法为通过CRISPR/Cas9无痕敲除蛹虫草Ⅰ型疏水蛋白编码基因Cmhyd4，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在蛹虫草基因组中敲除负调控蛹虫草子实体发育疏水蛋白基因Cmhyd4，从而创制蛹虫草高产菌株，既能提高蛹虫草的产量，又能避免转基因元件整合至基因组引起的食品安全性问题，为蛹虫草高产菌株选育提供了思路和实验依据，且与传统育种方式相比，本发明育种周期短，且实现了定向育种。

技术研发人员：李肖,任慧慧,李守勉,李国杰,田景花,王俊玲,李明
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5